Biorreactores ultimo
- 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ ESCUELA DE POST GRADO MAESTRÍA EN DIDÁCTICA Y GESTIÓN EDUCATIVA ESCRITO POR: PROFESOR ENRIQUE GREGORIO NÚÑEZ YAPIAS TARMA, JULIO DE 2013 BIORREACTORES
- 2. INDICE I. BIORREACTORES ....................................................................................................................... 4 1.1. DEFINICIÓN........................................................................................................................... 4 1.2. CLASIFICACIÓN:.................................................................................................................. 4 1.2.1. DE ACUERDO A SUS FASES:................................................................................... 4 1.2.2. DE ACUERDO AL METABOLISMO (CLASIFICACIÓN BIOLÓGICA). ................ 4 1.2.3. DE ACUERDO A SU PROCESO DE OPERACIÓN:............................................... 5 1.2.4. DE ACUERDO A LA MEZCLA: ................................................................................... 5 1.3. ELECCIÓN DEL TIPO DE REACTOR:.............................................................................. 5 1.4. DISEÑO DE BIORREACTORES........................................................................................ 5 PRINCIPIOS EN EL DISEÑO DE BIORREACTORES. .......................................................... 6 DESVENTAJAS:........................................................................................................................... 6 DESVENTAJAS:........................................................................................................................... 7 VENTAJAS: ................................................................................................................................... 7 VENTAJAS: ................................................................................................................................... 7 DESVENTAJAS:........................................................................................................................... 7 1.5. CULTIVOS Y FERMENTACIONES.................................................................................... 8 1.6. BIORREACTORES Y TIPOS DE CULTIVO ..................................................................... 9 A. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS ANAERÓBICOS.................................................... 9 B. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS FACULTATIVOS................................................... 9 C. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS AERÓBICOS. .................................................. 10 1.7. TIPOS DE CULTIVO QUE SE PUEDEN REALIZAR: ................................................... 10 CULTIVOS MICROBIANOS ANAERÓBICOS – FERMENTADOR BACTERIAL (CO2).............................................................................................................................................. 10 CULTIVOS MICROBIANOS FACULTATIVOS – FERMENTADOR BACTERIAL..... 10 CULTIVOS MICROBIANOS AERÓBICOS – FERMENTADOR BACTERIAL (O2). 10 CULTIVOS CELULARES AERÓBICOS Y FACULTATIVOS – FERMENTADOR MICÓTICO (CO2)........................................................................................................................ 10 CULTIVOS CELULARES AERÓBICOS ESTRICTOS – FERMENTADOR CON AIREACIÓN (O2)......................................................................................................................... 10 CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN – BIORREACTOR DE ELEVAMIENTO POR AIRE (O2) EN RÉGIMEN TURBULENTO (Re ≥ 3000)............................................... 11
- 3. PROTOPLASTOS VEGETALES – BIORREACTOR DE LEVATAMIENTO POR AIRE (O2) EN RÉGIMEN LAMINAR (Re ≤ 2300).................................................................. 11 CÉLULAS ANIMALES – BIORREACTOR DE LECHO FLUIDIZADO (O2). .............. 11 CÉLULAS INMOBILIZADAS – BIORREACTOR DE FIBRA HUECA (O2). ............... 11 CÉLULAS EMPAQUETADAS – BIORREACTOR DE LECHO EMPACADO (O2)... 12 CULTIVOS ENZIMÁTICOS – REACTORES DE LECHO CATALÍTICO.................... 12 1.8. MODO DE OPERACIÓN Y SISTEMAS DE CULTIVO. ............................................... 12 1.8.1. DISCONTINUO (batch). ............................................................................................. 13 1.8.2. SEMICONTINUO (Fed – batch)................................................................................ 13 1.8.3. CONTINUO. ................................................................................................................. 13 1.9. BALANCES Y ECUACIONES ........................................................................................... 13 1.9.1. BALANCE GENERAL BIOMASA.............................................................................. 13 1.9.2. BALANCE GENERAL POR COMPONENTE.......................................................... 14 1.9.3. BALANCE GENERAL POR COMPONENTE PARA CADA MODO DE OPERACIÓN................................................................................................................................ 14 1.9.4. BALANCES INDIVIDUALES...................................................................................... 16 II. TECNOLOGIA ENZIMÁTICA .................................................................................................... 18 2.1. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES...................................................................... 18 2.2. APLICACIONES INDUSTRIALES .................................................................................... 18 2.2.1. ALIMENTOS................................................................................................................. 19 2.2.2. INDUSTRIAS LÁCTEAS ............................................................................................ 19 2.2.3. PANADERÍA................................................................................................................. 20 2.2.4. CERVECERÍA.............................................................................................................. 20 2.2.5. FABRICACIÓN DE ZUMOS ...................................................................................... 20 2.2.6. FABRICACIÓN DE GLUCOSA Y FRUCTOSA A PARTIR DEL MAÍZ. .............. 20 2.2.7. ENERGÍA...................................................................................................................... 21 2.2.8. PRODUCTOS MÉDICOS Y FARMACÉUTICOS ................................................... 21 2.3. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y CÉLULAS............................................................... 21 MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS.............................. 22 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................ 23
- 4. I. BIORREACTORES 1.1. DEFINICIÓN. Es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos, se lleva a cabo una reacción catalizada por enzimas o células, libres o inmovilizadas. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. El biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propias (PH, temperatura, concentración de oxígeno) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres puntos distintos: Lote (batch). Lote alimentado (fed – batch). Continuo o quimiostato. 1.2. CLASIFICACIÓN: 1.2.1. DE ACUERDO A SUS FASES: Homogéneos. Heterogéneos. 1.2.2. DE ACUERDO AL METABOLISMO (CLASIFICACIÓN BIOLÓGICA). Los sistemas biológicos deben interaccionar con el ambiente externo para poder crecer y desarrollarse, es por eso que los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al metabolismo procesal del sistema: ANAERÓBICO, FACULTATIVO, AERÓBICO. Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas – biológicas de diseño y de operación del biorreactor. Estas características son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo; por lo que , definen la clasificación biológica . procesal del sistema de cultivo.
- 5. 1.2.3. DE ACUERDO A SU PROCESO DE OPERACIÓN: Continuos. Semicontinuo. Discontinuos. Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico (biorreactor). En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesal – productiva del bioproceso (cultivo). Al operar un biorreactor en una determinada categoría (discontinuo, semicontinuo, continuo), automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el proceso productivo del sistema. 1.2.4. DE ACUERDO A LA MEZCLA: Biorreactor discontinuo de mezcla completa. Biorreactor continuo de mezcla completa. Biorreactor continuo de flujo de pistón. Biorreactor reactores de lecho fluidizado. 1.3. ELECCIÓN DEL TIPO DE REACTOR: Control de PH y temperatura. Exigencias de suministro o eliminación de reactores gaseosos. Presencia de partículas sólidas deseadas o indeseadas en la alimentación. Estabilidad química y/o biológica de sustratos y productos. Sustitución del catalizador. Inhibición por sustratos y/o productos. Escala de operación. Destinos del producto. 1.4. DISEÑO DE BIORREACTORES. Es una tarea de ingeniería bastante compleja, los organismos o células son capaces de realizar su función deseada con gran eficiencia bajo condiciones óptimas. Las condiciones ambientales de un biorreactor tales como flujo de gases (por ejemplo; oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.), temperatura, PH, oxígeno disuelto y velocidad de agitación o circulación, deben ser cuidadosamente monitoreadas y controladas.
- 6. La mayoría de los fabricantes industriales de biorreactores usan recipientes, sensores, controladores y un sistema de control interconectados para su funcionamiento en el sistema biorreacción. La misma propagación celular puede afectar la esterilidad y eficiencia del biorreactor, especialmente en los intercambiadores de calor. Para evitar esto, el biorreactor debe ser fácilmente limpiable y con acabados lo más sanitario posible (de ahí sus formas redondeadas). Se requiere de un intercambiador de calor para mantener el bioproceso a temperatura constante. La fermentación biológica es una fuente importante de calor, por lo que en la mayor parte de los casos, los biorreactores requieren de agua de enfriamiento. Pueden ser refrigerados con una chaqueta externa o, para recipientes sumamente grandes, con serpentines internos. En un proceso aerobio, la transferencia óptima de oxígeno es tal vez la tarea más difícil de lograr. El oxígeno se disuelve poco en agua (y aún menos en caldos fermentados) y es relativamente escaso en el aire (20,8 %). La transferencia de oxígeno usualmente se facilita por la agitación que se requiere también para mezclar los nutrientes y mantener la fermentación homogénea. Sin embargo, existen límites para la velocidad de agitación, debidos tanto al alto consumo de energía ( que es proporcional al cubo de la velocidad del motor) como al daño ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo de corte excesivo. Los biorreactores industriales usualmente emplean bacterias u otros organismos simples que pueden resistir la fuerza de agitación. También son fáciles de mantener ya que requieren solo soluciones simples de nutrientes y pueden crecer a grandes velocidades. En los biorreactores utilizados para crecer células o tejidos, el diseño es significativamente distinto al de los biorreactores industriales. Muchas células y tejidos, especialmente de mamífero, requieren una superficie u otro soporte estructural para poder crecer y los ambientes agitados son comúnmente dañinos para estos tipos de células y tejidos. Los organismos superiores también requieren medios de cultivo más complejos. PRINCIPIOS EN EL DISEÑO DE BIORREACTORES. A. BIORREACTOR DISCONTINUO DE MEZCLA COMPLETA. Variación de forma continua. Constante a través del reactor. Empleo de enzimas solubles. Volumen pequeño de producción. DESVENTAJAS: Cambios en las condiciones de operación. Grado de mezcla en reactores a gran escala.
- 7. B. BIORREACTOR CONTINUO DE MEZCLA COMPLETA. Composición uniforme. Versátiles y baratos. Facilidad de control de PH, temperatura, etc. DESVENTAJAS: Gastos energéticos elevados. C. BIORREACTOR DE FLUJO EN PISTÓN. Invariable a lo largo del tiempo. Varía a través del reactor. Células o enzimas libres (inoculación). Células o enzimas inmovilizados. VENTAJAS: Más eficaces que los de mezcla completa. Simples y fáciles de manejar y automatizar. D. BIORREACTOR DE LECHO FLUIDIZADO Fluidización: winkler (1921). De lecho fluido o turbulento. Biocatalizador o en suspensión. Flujo de sustrato. VENTAJAS: Buen control de PH, T°, gas, etc. Gran área de interacción. Facilidad de hacer trabajo en continuo. DESVENTAJAS: Técnica de trabajo cara. El diseño en bioingeniería no es solo la aplicación de conceptos básicos y teóricos que conlleven a lograr un prototipo; para la realización integra de un modelo, otra gran parte, trata de la adaptación creativa y de la utilización del ingenio propio para lograr el objetivo de conjuntar el ambiente biológico de un cultivo vivo con el ambiente artificial de un dispositivo controlado; este es el resultado denominado biorreactor o reactor biológico. Un biorreactor es por tanto un dispositivo biotecnológico que debe proveer internamente un ambiente controlado que garantice y maximice la producción y el crecimiento de un cultivo vivo; esa es la parte biológica. Externamente el biorreactor es la frontera que protege ese cultivo del ambiente
- 8. externo: contaminado y no controlado. El biorreactor debe por tanto suministrar los controles necesarios para que la operación o proceso (bioproceso) se lleve a cabo con economía, alto rendimiento (productividad) y en el menor tiempo posible; esa es la parte tecnológica. El biorreactor es un sistema totalmente cerrado para la recepción y tratamiento de las aguas residuales, residuos agrícolas y de cualquier otro tipo de residuos orgánicos biodegradables, donde son convertidos en abono biológico formulado, libre de todo patógeno, y genera un gas, llamado biogás, el cual se purifica hasta llevarlo a metano puro en la mayor proporción posible para ser utilizado en cualquier sistema de combustión, motores o cualquier otro tipo de equipo que opere con gas natural, incluyendo los vehículos particulares convertidos a gas natural pues tiene un alto porcentaje de metano de no menos del 91% y su composición, poder calorífico, etc. Es casi idéntico a la del gas natural, debido a que se purifica hasta su punto óptimo. 1.5. CULTIVOS Y FERMENTACIONES. Lo primero que hay que entender en el diseño de reactores biológicos es que contrario a los químicos, su cinética no está determinada exclusivamente por la velocidad de reacción y las variables que la determinan. Aunque se puede describir de manera similar a la química, la cinética biológica también depende de características intrínsecas del organismo o cultivo tales como crecimiento y tasa de división celular, así como del tipo de operación que se lleve a cabo. Por eso, lo primero que se define en el diseño de un biorreactor es el propósito de utilización; es
- 9. decir, qué tipo de cultivo se va utilizar, el modo de operar y/o el proceso de cultivo. El biorreactor – sistema de cultivo debe cumplir con los siguientes objetivos: a. Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo. b. Mantener constante y homogénea la temperatura. c. Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes. d. Prevenir la sedimentación y la floculación. e. Permitir la difusión de gases nutrientes a la velocidad requerida por el cultivo. f. Mantener el cultivo puro. g. Mantener un ambiente aséptico. h. Maximizar el rendimiento y la producción. i. Minimizar el gasto y los costos de producción. j. Reducir al máximo el tiempo. Una fermentación es un proceso biológico o bioproceso que consiste en la descomposición de la materia orgánica por microorganismos fermentadores (bacterias y hongos). Un cultivo también es un bioproceso; pero generalmente se asocia a organismos o microorganismos superiores (en orden jerárquico) a las bacterias; los cultivos son casi todos del reino Eucariota. 1.6. BIORREACTORES Y TIPOS DE CULTIVO Los sistemas biológicos que determinan el metabolismos celular de cultivo y el modo procesal – biológico del sistema son: A. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS ANAERÓBICOS. Bacterias en su gran mayoría, son microorganismos de metabolismos degradativo (catabólico); generalmente unicelulares, estos microorganismos son autónomos y nutricionalmente independientes ( autótrofos); sus células (cuerpos) no respiran (no utilizan la glucólisis para la respiración celular), en cambio, utilizan vías alternas, donde una molécula orgánica, producida durante el proceso metabólico (catabolismos), es utilizada como aceptor de electrones, en un proceso bioquímico como respiración oxidativa; esta molécula es reducida a producto orgánico en un proceso comúnmente denominado fermentación. B. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS FACULTATIVOS. Son ambivalentes, tienen la capacidad de vivir o sobrevivir entre ambientes: aeróbico y anaeróbico; microorganismos de metabolismos mixto por lo que, pueden tanto degradar (catabolismo) como construir (anabolismos) materia orgánica, a partir de diferentes sustratos (materia prima), tanto orgánicos como inorgánicos. Pese a su versatilidad, sus mayores representantes son microorganismos que presentan relaciones parásitas o simbiontes tales como; hongos y levaduras, por lo que son muy extensos.
- 10. C. CÉLULAS Y MICROORGANISMOS AERÓBICOS. Pertenecen en su mayoría al reino Eucariota (pero también hay procariotas) son microorganismos y células que respiran (utilizan la glucólisis como forma de respiración celular); por lo que su metabolismo es constructivo (anabólico) y deben obtener sus nutrientes de diferentes fuentes. Sus principales grupos están representados por: bacterias y microorganismos aeróbicos, plantas y animales; cuyas células se pueden cultivar en suspensiones celulares o bien, en diferentes arreglos artificiales o modificadas. 1.7. TIPOS DE CULTIVO QUE SE PUEDEN REALIZAR: CULTIVOS MICROBIANOS ANAERÓBICOS – FERMENTADOR BACTERIAL (CO2). Los microorganismos de metabolismos anaeróbico son los más simples de todos, tan solo necesitan de un medio de cultivo adecuado, agitación vigorosa y cierta cantidad de CO2 disuelto para crecer y multiplicarse. CULTIVOS MICROBIANOS FACULTATIVOS – FERMENTADOR BACTERIAL. Los microorganismos facultativos toleran la presencia de oxígeno en bajas concentraciones y además de un sustrato adecuado, sólo requieren agitación moderada y un medio de cultivo para crecer y desarrollarse. CULTIVOS MICROBIANOS AERÓBICOS – FERMENTADOR BACTERIAL (O2). Los microorganismos aeróbicos necesariamente requieren la presencia de oxígeno disuelto (OD) para sobrevivir; además, agitación moderada y un medio de cultivo rico en nutrientes para poder crecer y desarrollarse. CULTIVOS CELULARES AERÓBICOS Y FACULTATIVOS – FERMENTADOR MICÓTICO (CO2). Los cultivos celulares se diferencian de los bacteriales (microbios) en que o son microorganismos procariotas, son eucariotas. Son microorganismos aeróbicos o facultativos pertenecientes al reino fungi (hongos y levaduras), generalmente llamados micóticos, requieren de la presencia de CO2 disuelto en el medio como sustrato limitante de la velocidad de reacción y generan estructuras reproductivas muy particulares. CULTIVOS CELULARES AERÓBICOS ESTRICTOS – FERMENTADOR CON AIREACIÓN (O2). El cultivo de microorganismos celulares (no bacteriales) aeróbicos estrictos requieren la presencia de oxígeno disuelto en el medio de cultivo para el metabolismo celular; así como una adecuada agitación.
- 11. CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN – BIORREACTOR DE ELEVAMIENTO POR AIRE (O2) EN RÉGIMEN TURBULENTO (Re ≥ 3000). Las células vegetales pueden ser cultivadas en suspensiones celulares: pequeños agregados celulares que se suspenden en el medio de cultivo mediante agitación. Dado que las células vegetales, el diseño del biorreactor debe incorporar una línea de aireación (aire) para suministrar oxígeno disuelto (OD) al medio de cultivo. El diseño debe contar con agitación vigorosa, pues los agregados celulares vegetales tienden a agruparse (clusters) y de alcanzar gran tamaño y peso, precipitarían. Por eso, la operación de este tipo de biorreactores debe ser en régimen turbulento (Re ≥ 3000). Los biorreactores para células vegetales en suspensión generalmente son diseñados con un mecanismo de levantamiento por aire que combina una agitación vigorosa (turbulenta) con una adecuada aireación (oxígeno disuelto) del medio de cultivo. PROTOPLASTOS VEGETALES – BIORREACTOR DE LEVATAMIENTO POR AIRE (O2) EN RÉGIMEN LAMINAR (Re ≤ 2300). Los protoplastos son células vegetales desprovistas de su pared celular, esto se logra utilizando enzimas proteolíticas (proteasas y lipasas) que degradan la pared celular. Actualmente, el cultivo de protoplastos no es muy común, pero de realizarse, requiere de una cama de aire (burbujas muy finas) que opere en régimen laminar (Re ≤ 2300), para evitar que los esfuerzos cortantes (esquileo) e hidrodinámicos (agitación) generados en el medio de cultivo dañen (lisis celular) las células en suspensión. También es indispensable que el medio de cultivo contenga las proteasas y lipasas necesarias para evitar la regeneración de la pared celular. CÉLULAS ANIMALES – BIORREACTOR DE LECHO FLUIDIZADO (O2). Los cultivos de las células animales requieren de proximidad mutua y de un soporte sólido (anclaje) para interactuar (comunicación célula – célula) y poder metabolizar (producir); esto por cuanto, las células animales, por lo general, no son independientes y deben estar unidas a un sistema (por ejemplo hepático) para funcionar adecuadamente. Par suministrar esa proximidad y el soporte necesario, los diseños de biorreactores para células animales deben aumentar la densidad celular (concentrar) de las células en cultivo. Una forma de hacerlo es incorporar un lecho fluidizado formado por cantidad de microesferas acarreadoras hechas de material cerámico poros inerte que, por su tamaño (micrométrico) forman una interfase con el medio de cultivo (fluido) que permite la transferencia de masa (nutrientes y OD), energía (calor) y momentun (agitación) entre el medio de cultivo y las células en cultivo; lo que es llamado lecho fluidizado. Los cultivos celulares animales, por la delicada naturaleza de las membranas plasmáticas requieren además de oxígeno disuelto (OD) en el medio de cultivo y de un régimen de agitación laminar (Re ≤ 2300). CÉLULAS INMOBILIZADAS – BIORREACTOR DE FIBRA HUECA (O2).
- 12. La inmovilización celular es otra forma de lograr proximidad celular y aumentar la densidad celular y la concentración de metabolitos dentro de las células. La inmovilización es un método mucho más eficiente y logra rendimientos muy superiores a los del lecho fluidizado. Pero, los fenómenos de transferencia (masa, momentun y energía) se ven muy limitados por la inmovilidad. Esto es especialmente crítico en cultivos de células de mamífero por cuanto la célula no recibe la nutrición adecuada. Los reactores de fibra hueca son los dispositivos más utilizados para inmovilizar y concentrar cultivos celulares animales. Su diseño consiste en una batería de fibras huecas y porosas en su interior, colocadas en paralelo. Las células se concentran y aumenta la densidad celular, en los intersticios de las fibras huecas. El medio de cultivo fluye en contrasentido desde el exterior del reactor o a través de una carcasa como si fuera un intercambiador de calor de doble tubo. Para solventar el problema de la escasa transferencia de masa (nutrientes y OD) dentro de la fibra hueca, un diseño novedoso es el tambor rotativo en el cual, el tambor externo rota sobre la batería de fibras huecas, generando una circulación constante de masa y de momentun, aumentando las tazas de transferencia. CÉLULAS EMPAQUETADAS – BIORREACTOR DE LECHO EMPACADO (O2). El empaquetamiento celular es una forma menos drástica de inmovilización; pues ésta es parcial. También tiene el objetivo de aumentar la concentración y la densidad celular; pero al no estar enclaustradas las células, la transferencia de masa es mayor, aunque siempre limitada. Un lecho empacado es una matriz de soporte sólido que retiene las células, bien por geometría (dentro de los intersticios o espacios huecos de la matriz), bien por afinidad (paso o adherencia selectiva). Un biorreactor con este propósito debe contener un lecho de soporte sólido, sumergido en el medio de cultivo. La oxigenación generalmente se realiza en el exterior del lecho, a través del medio de cultivo. CULTIVOS ENZIMÁTICOS – REACTORES DE LECHO CATALÍTICO. Los cultivos enzimáticos se comportan en algunos aspectos como cultivos celulares y en otros como reactivos químicos. Debido a que un sustrato enzimático es un catalítico de una reacción biológica, la cinética de estos reactores puede simularse como la química, pero sin olvidar que el compuesto es biológico. Los sustratos enzimáticos deben estar anclados a un lecho semisólido o a un semifluido (según sea el caso) dependiendo de la naturaleza enzimática del sustrato; que por la naturaleza de la enzimas se conocen como lechos catalíticos. Muchas veces el medio de cultivo, además de la enzima, requiere, para un sustrato determinado, su respectivo precursor metabólico llamado cofactor, más algún componente especial que agilice el proceso metabólico. 1.8. MODO DE OPERACIÓN Y SISTEMAS DE CULTIVO. El modo de operación de un sistema de cultivo, es sinónimo del modo de operar del biorreactor o fermentador. Éste no solo influye en el diseño propio del reactor, también, en el modelo cinético de
- 13. crecimiento del cultivo y en el proceso de producción. Existen tres modos de cultivo aunados a tres modos básicos de operación: 1.8.1. DISCONTINUO (batch). Por lotes o tandas, sin alimentación (F); se coloca dentro del biorreactor la carga total de cada proceso (tanda o lote) de cultivo o fermentación y se deja que se lleve a cabo el proceso productivo o la fermentación por el tiempo que sea necesario; el cual se denomina tiempo de retención. Las células se cultivan en biorreactor con una concentración inicial, sin que esta sea alterada por nutrientes adicionales o el lavado, por lo que el volumen permanece constante y sólo las condiciones ambientales del medio (PH, temperatura, velocidad de agitación) son controladas por el operador. Es proceso finaliza cuando todo el sustrato es consumido por la biomasa. 1.8.2. SEMICONTINUO (Fed – batch). Por lotes alimentados, con alimentación de entrada (F1); se alimenta una línea de entrada o alimentación (F1) para que el sistema de cultivo tenga un producto (biomasa) con máximo crecimiento (exponencial) y aumente la productividad. Los nutrientes son alimentados al biorreactor de forma semicontinua o continua, mientras que no hay efluente en el sistema. La adición intermitente del sustrato mejora la productividad de la fermentación manteniendo baja la concentración del sustrato. Este proceso está restringido por la capacidad volumétrica del reactor. 1.8.3. CONTINUO. Por quimioestato, se alimenta una línea de entrada F1 con nutrientes de manera continua y se drena una salida F2 o lavado; de manera que los flujos o caudales de ambas líneas sean iguales y la producción sea continua. 1.9. BALANCES Y ECUACIONES La parte teórica del diseño consiste en modelar; es decir, “poner” en ecuaciones el proceso biológico (bioproceso) que se lleva a cabo, para que, a partir de esas ecuaciones, dimensionar (dar dimensiones) y simular el comportamiento teórico de un modelo prototipo. 1.9.1. BALANCE GENERAL BIOMASA Velocidad de Acumulación = Velocidad de Entrada – Velocidad de Salida + Velocidad de Formación – Velocidad de Consumo. = - + -VELOCIDAD DE ACUMULACI ÓN VELOCIDAD DE CONSUMO VELOCIDAD DE ENTRADA VELOCIDAD DE FORMACIÓN VELOCIDAD DE SALIDA
- 14. 1.9.2. BALANCE GENERAL POR COMPONENTE Una vez dado el balance general de biomasa, debe tomarse en cuenta que, en un sistema de cultivo, existen muchos componentes: sustratos, productos, compuestos metabólicos que conforman el caldo de cultivo (medio interno); incluso la biomasa, se considera un componente en sí misma. A partir del balance general, debe establecerse un balance general para cada componente del cultivo o la biomasa. …………. Ec.1 Donde: : Velocidad de acumulación del componente . : Volumen del cultivo(m³). : Flujo o caudal de entrada (m³/s). : Concentración inicial del componente . (kg/m³). : Flujo o caudal de salida (m³/s). : Concentración del componente . (kg/m³). : Velocidad de formación del componente . (kg/m³s). : Velocidad de consumo del componente . (kg/m³s). Respecto a las velocidades de formación y consumo: Si se trata de un componente metabólico, responden a la acumulación (formación) del componente dentro de la célula y al consumo del metabolito por parte de la célula (consumo). Si se trata de biomasa, formación corresponde a la generación de biomasa y el consumo al consumo de biomasa durante el bioproceso; esto es, a la producción metabólica en el primer caso y a la producción o productividad en el segundo. 1.9.3. BALANCE GENERAL POR COMPONENTE PARA CADA MODO DE OPERACIÓN La ecuación de balance general por componente Ec. 1, por ser general, se define para una operación continua. La condición fundamental de toda operación continua es: En una operación continua el flujo de entrada (F1) debe ser igual al flujo de salida (F2): F1 = F2 Velocidad de Entrada Velocidad de Salida Velocidad de Formación Velocidad de Consumo Velocidad de Acumulación
- 15. Esta condición se conoce como flujo en estado estacionario (FEE). Para modelar el comportamiento de la biomasa del cultivo en el estado estacionario (EE) además de la condición de flujo (FEE) debe haber equilibrio en la densidad o concentración de ésta. Esto se conoce como quimioestásis o equilibrio quimioestático y es por eso que a los sistemas de cultivo continuo se les llama quimioestatos. Está condición está dada por la ecuación: ……………… Ec. 2. Bajo la condición de FEE y suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales (Ec.2, quimioestásis) la Ec.1 se reduce a la ecuación de balance para una operación continua en estado estacionario. …………….. Ec. 3. De no existir el estado estacionario (EE) se producirían dentro del biorreactor dos condiciones de flujo indeseables: Si F1 > F2 se produce el rebalse o desborde del biorreactor, condición que se da cuando el flujo de entrada sobrepasa la capacidad del reactor. Si F2 > F1 se produce el lavado o drenado de producto o biomasa, condición que se da cuando el flujo de salida sobrepasa la capacidad del reactor. Cuando el modo de operación es semicontinuo (fed-batch) el caudal de salida F2 es nulo (F2 = 0) por lo que, el volumen V aumentará con el tiempo en función del caudal de entrada: ………………. Ec.4. Y en el balance de materia se anula el término resultando: ………………………….. Ec.5. Observe que el volumen que permanece dentro del operador diferencial es porque varía con el tiempo (Ec.4), en tanto que el otro no lo hace (Ec.3). Esa es la razón por la que una operación semicontinua tiene duración limitada en el tiempo (el volumen no puede incrementarse más allá del volumen de trabajo o volumen útil del biorreactor). El tiempo que dura una operación semicontinua se conoce como tiempo de residencia (tr) y es el tiempo que dura el cultivo o bioproceso en un sistema semicontinuo. Cuando el modo de operación es discontinuo (batch) ambos caudales son nulos F1 = F2 = 0 Por lo que, el volumen es constante y se anulan los términos y en la Ec.1. Eso da como resultado: ……………… Ec.6. La duración de un cultivo discontinuo (batch) es también, limitada en el tiempo, pero se diferencia de la del cultivo semicontinuo (fed-batch) en que depende únicamente de las
- 16. condiciones iniciales del cultivo; esto por cuanto, no existe alimentación (F1). Una vez cargado el biorreactor e inoculado el medio de cultivo, la concentración de la biomasa aumenta gracias a los nutrientes, pero una vez que el sustrato que limita el crecimiento se haya agotado, el crecimiento ya no es posible y finaliza el cultivo. Por este motivo, el tiempo que dura el cultivo dentro de un biorreactor con un modo de operación discontinuo se llama tiempo de cultivo (tc). 1.9.4. BALANCES INDIVIDUALES Los principales balances por componente en su forma individual son: Balance de Biomasa: d (VX) / dt = FiXi + VrgX – FoXo – VrcX Velocidad de crecimiento celular rgX = µX velocidad de muerte celular rcX = kdX Balance de Sustrato: d (VS) / dt = FiSi – FoSo – VrcS rcS = qSX / YX/S = µX / YG + m X + qPX / YP Balance de producto: d (VP) / dt = FiPi – FoPo – VrgP rgP = qP X Balance de Oxígeno: d (VCL) / dt = FiCLi – FoCLo – VrcO2 + VNiO2 Balance de Anhídrido Carbónico: d(VCCO2) / dt = FiCCO2i – FoCCO2o + VrgCO2 – VNoCO2
- 17. NOMENCLATURA V: Volumen del líquido en el biorreactor, L t: Tiempo, h y: Concentración del componente y en el líquido dentro del biorreactor, g/L X: Concentración de biomasa en el líquido dentro del biorreactor, g/L S: Concentración de sustrato en el líquido dentro del biorreactor, g/L P: Concentración de producto en el líquido dentro del biorreactor, g/L CL: Concentración de oxígeno en el líquido dentro del biorreactor, g/L C*: Concentración de oxígeno en el líquido en equilibrio con el gas, g/L CCO2: Concentración de CO2 en el líquido dentro del biorreactor, g/L F: Velocidad de flujo de líquido, L/h Ni: Velocidad de transferencia de un componente del gas al líquido, g/Lh No: Velocidad de transferencia de un componente del líquido al gas, g/Lh rg: Velocidad de generación, formación o producción, g/Lh rc: Velocidad de consumo o utilización, g/Lh µ: Velocidad específica de crecimiento celular, h-1 qS: Velocidad específica de consumo de sustrato, g/gh qP: Velocidad específica de formación de producto, g/gh m: Velocidad específica de consumo de sustrato para mantenimiento celular, g/gh Kd: Velocidad específica de muerte o declinación celular, h-1 YP: Coeficiente (estequiométrico) de rendimiento de producto basado en el consumo de sustrato consumido para formación de producto, g/g YP/S: Coeficiente de rendimiento de producto basado en el consumo total de sustrato, g/g YG: Coeficiente de rendimiento de biomasa basado en el consumo de sustrato para crecimiento, g/g YX/S: Coeficiente de rendimiento de biomasa basado en el consumo total de sustrato, g/g kLa: Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, h-1 SUBÍNDICES i = Ingreso o = Salida S = Sustrato P = Producto O2 = Oxígeno CO2 = Anhídrido carbónico
- 18. II. TECNOLOGIA ENZIMÁTICA La tecnología enzimática tiene como objetivo la superación de todos aquellos inconvenientes que parecen retrasar la aplicación de las enzimas en estos procesos a escala industrial, las enzimas son proteínas cuya función biológica es catalizar las reacciones que suceden en las células. Esta área tiene aplicaciones desde tiempos remotos como la fermentación, actualmente en diferentes industrias a diferentes niveles, ya que implica la utilización de sistemas enzimáticos diversos que optimizan el procesamiento en la obtención de detergente, aditivos alimenticios, productos químicos y farmacéuticos. La tecnología enzimática se presenta como alternativa biotecnológica basada en que las industrias desarrollen productos de calidad homogénea, aprovechen óptimamente sus materias primas, aceleren sus procesos de producción, minimicen desperdicios y disminuyan el deterioro del medio ambiente. 2.1. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industriaquímica. Son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presión, pH, etc. Son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de un compuesto quiral, Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga varias posiciones modificables. 2.2. APLICACIONES INDUSTRIALES En relación con las enzimas, la tecnología moderna contribuye al ahorro. Por ejemplo, permite la utilización del excedente de suero derivado de la fabricación del queso. La lactosa transforma el azúcar del suero en una mezcla de glucosa y galactosa con un sabor más dulce. Así, se refina el producto y se concentra en una especie de jarabe cuyo sabor recuerda el de la miel, con lo que las aplicaciones en el sector de la confitería industrial se hacen innumerables. Se usan también
- 19. muchos otros tratamientos de las enzimas en la producción de edulcorantes modernos. Por ejemplo, EE.UU. se puede constatar que el jarabe del almidón de maíz tiene un alto contenido en fructosa, razón por la cual ha llegado a eclipsado a la sacarosa. Las enzimas presentan muchísimas aplicaciones. Con los procedimientos modernos de fabricación de alimentos, benefician tanto a los sectores industriales como a los consumidores. Sus características específicas permiten a los industriales ejercer un control de calidad más estricto. Con un menor consumo de energía y unas condiciones de tratamiento más ligeras, su eficacia favorece el entorno. Pueden utilizarse para tratar los desechos biológicos resultantes de la fabricación de alimentos, puesto que las propias enzimas son biodegradables. Mediante una rápida absorción natural, las enzimas son el típico ejemplo de "tecnología verde". 2.2.1. ALIMENTOS La utilización empírica de preparaciones enzimáticas en la elaboración de alimentos es muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la elaboración de quesos desde la prehistoria, mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el zumo de la papaya. Los enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de síntesis y degradación que tienen lugar en ellos. La utilización de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas, además de las de índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen los enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Para garantizar la seguridad de su uso deben tenerse en cuenta no obstante algunas consideraciones: en aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos no deben ser patógenos ni sintetizar a la vez toxinas, antibióticos, etc. Los microorganismos ideales son aquellos que tienen ya una larga tradición de uso en los alimentos (levaduras de la industria cervecera, fermentos lácticos, etc.). Además, tanto los materiales de partida como el procesado y conservación del producto final deben ser acordes con las prácticas habituales de la industria alimentaría por lo que respecta a pureza, ausencia de contaminantes, higiene, etc. 2.2.2. INDUSTRIAS LÁCTEAS El cuajo, que está formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jóvenes. Estos enzimas rompen la caseína de la leche y producen su coagulación. Actualmente empieza a ser importante también la lactasa, un enzima que rompe la lactosa,
- 20. que es el azúcar de la leche. Muchas personas no pueden digerir este azúcar, por lo que la leche les causa trastornos intestinales. 2.2.3. PANADERÍA En panadería se utiliza la lipoxidasa, simultáneamente como blanqueante de la harina y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la que se añade es usualmente como harina de soja o de otras leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la acción de la levadura, se añade amilasa, normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos países se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la adición de malta altera algo el color del pan. A veces se utilizan también proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este tratamiento es importante en la fabricación de bizcochos. 2.2.4. CERVECERÍA Un proceso fundamental de la fabricación de la cerveza, la rotura del almidón para formar azúcares sencillos que luego serán fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en la malta, que pueden añadirse procedentes de fuentes externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta permita transformar aún más almidón del que contiene. Cuando esto es así, las industrias cerveceras añaden almidón de patata o de arroz para aprovechar al máximo la actividad enzimática. 2.2.5. FABRICACIÓN DE ZUMOS A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean turbios y demasiado viscosos, produciéndose también ocasionalmente problemas en la extracción y en su eventual concentración. Esto es debido a la presencia de pectinas, que pueden destruirse por la acción de enzimas presentes en el propio zumo o bien por enzimas añadidas obtenidas de fuentes externas. Esta destrucción requiere la actuación de varios enzimas distintos, uno de los cuales produce metanol, que es tóxico, aunque la cantidad producida no llegue a ser preocupante para la salud. 2.2.6. FABRICACIÓN DE GLUCOSA Y FRUCTOSA A PARTIR DEL MAÍZ. Una industria en franca expansión es la obtención de jarabes de glucosa o fructosa a partir de almidón de maíz. Estos jarabes se utilizan en la elaboración de bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostería, etc. en lugar del azúcar de caña o de remolacha. Se obtiene por hidrólisis enzimática, que permite obtener un jarabe de glucosa de mucha mayor calidad y a un costo muy competitivo. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro azúcar más dulce, utilizando el enzima glucosa- someraza, usualmente inmovilizado en un soporte sólido.
- 21. 2.2.7. ENERGÍA. Un ejemplo clásico de biocombustible es el alcohol obtenido por fermentación de material rico en azúcares y almidón, o de residuos orgánicos varios, incluyendo los forestales. El principal obstáculo para la viabilidad de esta propuesta es el costo, puesto que el petróleo sigue siendo más barato. Sin embargo, los avances tecnológicos están permitiendo acortar la brecha. 2.2.8. PRODUCTOS MÉDICOS Y FARMACÉUTICOS 2.3. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Y CÉLULAS. El uso de enzimas suspendidas libremente tiene las desventajas siguientes: Muchas de las enzimas son lábiles bajo las condiciones normales de operación y por ello tienen una vida muy limitada. Debido a que las enzimas son solubles en agua, son difíciles de separar en sus sustratos y productos, por lo que su reutilización es difícil. Esto aumenta los costos de producción. La utilización de un proceso de enzimas inmovilizadas tendrá las siguientes ventajas: Se ha mostrado que la inmovilización de una enzima en partículas insolubles en agua aumenta su estabilidad considerablemente. La capacidad para separar con facilidad la enzima de los productos y sustratos permite su reutilización, o bien, el establecimiento de un proceso continuo con el que se logra mejorar la economía. Las desventajas de las enzimas inmovilizadas es que la naturaleza heterogénea de un catalizador como éste impone limitaciones de difusión que reducen y alteran su actividad. El uso de células inmovilizadas en lugar de aquellas cultivadas en un proceso intermitente normal tiene ventajas similares a las de las enzimas inmovilizadas. Las fermentaciones en lote se pueden reemplazar por reacciones continuas. Las células inmovilizadas permiten el uso de una densidad celular considerablemente mayor, con lo que se logra la intensificación del proceso. Muchas enzimas o metabolitos solo son activos en la fase celular estacionaria o de reposo; en un sistema de inmovilización las células se pueden retener en este estado. Las desventajas de las células inmovilizadas son similares a las de las enzimas inmovilizadas, donde el sistema impone las limitaciones de difusión. Las ventajas y desventajas de las enzimas inmovilizadas comparadas con las células inmovilizadas dependen del sistema en cuestión, pero pueden ser las siguientes: El uso de células inmovilizadas elimina la necesidad de extraer y purificar la enzima. A menudo el sistema celular completo es menos sensible a cambios en las condiciones de operación como el PH.
- 22. Las células inmovilizadas permiten una carga alta de soporte, que con las enzimas aisladas, puede reducir la actividad debido a las interacciones proteína – proteína. Si el sistema de reacción utilizado necesita muchas enzimas y también la renovación del cofactor, el sistema celular inmovilizado es la mejor opción. La desventaja del sistema celular inmovilizado es que impone barreras difusionales adicionales (pared celular) de modo que se puede requerir de la permeabilización de las células. En este caso, puede ser difícil el mantenimiento de la integridad celular. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS. A. UNIÓN COVALENTE A SOPORTES SÓLIDOS. Las enzimas se inmovilizan uniéndolas covalentemente a soportes insolubles. Se ha usado una variedad de materiales soporte incluyendo vidrio poroso, cerámicos, acero inoxidable, arena, carbón, celulosa, polímeros sintéticos (nylon) y óxidos metálicos. La inmovilización utiliza dos grupos amino o carboxilo presentes en la proteína enzimática. En la mayoría de los casos la inmovilización consiste en por lo menos dos etapas: la activación del soporte y la reacción de acoplamiento específica. B. ADSORCIÓN EN SOPORTES SÓLIDOS. Fue la primera técnica usada en la inmovilización donde la alumina y el carbón eran usadas como soporte. Los intercambiadores de iones absorben rápidamente la mayoría de las proteínas y se han usado para la purificación de enzimas. Soportes como los intercambiadores de aniones dietilamino – etil celulosa o el intercambiador catiónico carboximetil celulosa se han usado para la absorción de enzimas. C. CAPTURA EN UNA RED TRIDIMENSIONAL DE POLÍMEROS. Las enzimas se pueden inmovilizar dentro de una red de polímeros mediante la adición de las enzimas a los monómeros antes de la formación del gel. Los polímeros usados para la formación de los geles pueden ser orgánicos naturales o sintéticos, por ejemplo; agar agarosa, colágeno, gelatina, quitosano, celulosa.
- 23. BIBLIOGRAFÍA ARIAS, HOYOS Y OROZCO ( 2002).” CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES EN BIORREACTORES:UN SISTEMA POTENCIAL PARA LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS”. Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.55, No.1.p.1473-1495 SCRAGG, Alan (2002). “BIOTECNOLOGÍA PARA INGENIEROS: SISTEMAS BIOLÓGICOS EN PROCESOS TECNOLÓGICOS”. Editorial Limusa. Mexico. VAZQUEZ, OROZCO Y LEOBARDO (2007). “MANUAL DE PRÁCTICAS: LABORATORIO DE BIORREACTORES”. Instituto Politécnico Nacional. Colombia. WARD, Owen P. (1991). “BIOTECNOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN: PRINCIPIOS, PROCESOS Y PRODUCTOS”. Editorial Acribia. Zaragoza España.