Cooms
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Este documento describe un reactivo para la prueba de Coombs, que permite la detección de anticuerpos o componentes del complemento unidos a los glóbulos rojos mediante la aglutinación de estas células luego de la adición del reactivo. El reactivo contiene anticuerpos policlonales anti-IgG humana y un anticuerpo monoclonal anti-C3d. Se proveen instrucciones para su uso en la prueba de Coombs directa e indirecta, y se describen consideraciones como composición, almacenamiento, muestras, equipo
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- 1. ANTI-HUMAN GLOBULIN PRESENTACION AGH Anti-globulina humana poliespecífica REF 3410010 Anti-Human Globulin 10 mL Ensayo cualitativo para la detección de anticuerpos o componentes del complemento humano. PRUEBA EN TUBO Sólo para uso diagnóstico in vitro FUNDAMENTO ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD La prueba de la antiglobulina o prueba de Coombs, permite 1. Todos estos reactivos son estables hasta la fecha de la detección e identificación de globulinas ligadas caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se inmunológicamente a los hematíes. mantienen bien cerrados a 2-8ºC y se evita la La adición del reactivo antiglobulina a los mismos contaminación durante su uso. No usar los reactivos una ocasionará su aglutinación. vez caducados. 2. No congelar o exponer el reactivo a altas temperaturas. La APLICACIONES conservación del producto a temperatura distinta de la recomendada acelera la perdida de reactividad de producto. Prueba de Coombs Indirecto 3. Estos reactivos deben ser claros y transparentes. La presencia - Detección de anticuerpos irregulares de turbidez puede indicar contaminación microbiana. - Pruebas de compatibilidad 4. Descartar el contenido del vial, en caso de turbidez, rotura o - Determinación de fenotipos pérdida de contenido. - Identificación y titulación de anticuerpos MUESTRAS Prueba de Coombs Directo - Enfermedad hemolítica del recién nacido Las muestras de sangre pueden ser extraídas con o sin - Anemia hemolítica autoinmune anticoagulante. Se debe realizar el ensayo lo antes posible tras - Reacción hemolítica post-transfusional su extracción. Conservar las muestras a 2-8ºC. Ensayar el suero antes de 24 horas, mantenido a 2-8ºC desde la separación del coagulo. COMPOSICION DE LOS REACTIVOS No se debe usar muestras hemolizadas o contaminas. El reactivo de anti-globulina humana es una mezcla de anti- EQUIPO ADICIONAL IgG humana policlonal y C3d monoclonal. El reactivo coloreado verde permite comprobar visualmente - Tubos de vidrio (10x75 mm ó 12x75 mm). la adición del mismo a todos los tubos. - Pipetas Pasteur. - Baño a 37ºC. - Centrifuga Sero-fuge o similar. ANTI-HUMAN Suero de conejo anti-IgG humana GLOBULIN purificada. REACTIVOS ADICIONALES Anticuerpo monoclonal anti-C3d (murino). Tampón estabilizante. Azida sódica <0,1%. Colorantes: Patent Blue y Tartrazine. - Tampón Fosfato (PBS): 8,5-9,0 g/L NaCl (0,145 mol/L–0,154 mol/L) pH 7,0 ± 0,2 a 22 ± 1ºC. - Hematíes control: Negativo (hematíes Rh negativos sensibilizados Precauciones: Se aconseja manipular los reactivos y las con Anti-D) y Positivo (hematíes Rh positivos sensibilizados muestras con las precauciones debidas. Usar guantes y con Anti-D débil). ropa protectora. TECNICA Aviso: Los reactivos contienen azida sódica. Evitar el contacto con la piel y mucosas. I Test de Coombs Indirecto 1. En un tubo de hemólisis depositar 1 gota de suero problema. PREPARACION DE LOS REACTIVOS 2. Añadir 1 gota de suspensión de hematíes lavados (como mínimo 1 vez) al 3% en PBS. Los reactivos están listos para su uso. 3. Mezclar e incubar a 37ºC durante 30-60 minutos. 4. Lavar la mezcla 3 veces con abundante PBS. Lavado (Nota 1): llenar el tubo con PBS (aprox. 4 mL) y centrifugar los hematíes el tiempo adecuado para que sedimenten bien los hematíes, decantar el QUALITY SYSTEM CERTIFIED LINEAR CHEMICALS S.L. Joaquim Costa 18 2ª planta. 08390 Montgat, Barcelona, SPAIN ISO 9001 ISO 13485 Telf. (+34) 934 694 990 Fax. (+34) 934 693 435. website www.linear.es
- 2. el sobrenadante. Repetir la operación 2 veces más. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Decantar completamente tras el último lavado. 5. Añadir 2 gota de Anti-globulina humana. - El lavado inadecuado de los hematíes, la 6. Mezclar y centrifugar a 1000 f.c.r. durante 20 contaminación de los reactivos con trazas de suero, segundos o por una fuerza y tiempo equivalentes tiempos de incubación y centrifugado incorrectos, mal (Nota 2). control de la temperatura e inadecuada conservación u omisión de los reactivos dan reacciones negativas II Prueba de Coombs Directo falsas. - Los hematíes problema, tanto de pacientes como de 1. Preparar una suspensión de hematíes problema 3% donantes, con Pruebas Directas positivas darán un en PBS. falso resultado positivo si se les practica la Prueba de 2. Depositar 1 gota de la suspensión en un tubo de la antiglobulina Indirecta. hemólisis. - El suero usado no debe ser conservado mas de 24 h a 3. 1. Proseguir según lo indicado en los apartados 3 al 5 2-8ºC o 1 mes a –20ºC ya que el anti-Complemento del Test de Coombs Indirecto. puede perder su actividad. - El reactivo no aglutina los hematíes sensibilizados con fragmentos C4d. Lectura (Nota 3) - Ningún test es capaz individualmente de detectar Golpear suavemente el tubo para desprender el sedimento todos los anticuerpos clínicamente significativos. y examinar la presencia o ausencia de aglutinación. - El reactivo debe ser usado tal como se suministra, sin - Reacción negativa: diluir y sin adiciones. La resuspensión de los hematíes es homogénea. - El reactivo ha sido formulado y validado usando tubos - Reacción positiva: de vidrio. Los hematíes positivos permanecen aglutinados una - El uso e interpretación de los resultados debe llevarse vez resuspendidos. a cabo por personal formado y cualificado, de acuerdo con la normativa de cada país. Interpretación - Reacción positiva: REFERENCIAS La aglutinación de los hematíes problema es indicativa de la presencia de anticuerpos, teniendo en cuenta las - Coombs R.R.A., Mourant, A.E. y Race, R.R. Lancet limitaciones del procedimiento. ii:15 (1945). - Reacción negativa: La ausencia de aglutinación de los - Coombs R.R.A., Mourant, A.E. y Race, R.R Brit J Exp. hematíes problema es indicativa de un resultado Path. 26:225 (1945). negativo, teniendo en cuenta las limitaciones del - Pirofsky B. American Association of Blood Banks:59 procedimiento, y confirma la ausencia anticuerpos en (1972). los hematíes ensayados. CONTROL DE CALIDAD Para confirmar la validez de los resultados negativos añadir una gota (50 μL) de hematíes sensibilizados con anti D (Hematíes Control de Coombs), centrifugar y leer en busca de aglutinación (ver Apartado 6 y Lectura de la Prueba en tubo). Si los hematíes no aparecen aglutinados, el ensayo es invalido y debe repetirse. NOTAS Nota 1. Efectuar el lavado de los hematíes sin interrupción. Nota 2. Centrifugar y leer los resultados inmediatamente después de la adición de la Anti-globulina. Retrasos en la lectura pueden provocar disociación del complejo antigeno-anticuerpo, dando falsos resultados negativos o reacciones débiles. Nota 3. Leer los tubos inmediatamente después de su centrifugación. CARACTERISTICAS FUNCIONALES - Los reactivos han sido ensayados, según lo especificado en el apartado de TÉCNICA. - Antes de aprobar cada lote Linear Chemicals prueba el reactivo frente a hematíes sensibilizados. G3410-2/0407 R1.cas QUALITY SYSTEM CERTIFIED LINEAR CHEMICALS S.L. Joaquim Costa 18 2ª planta. 08390 Montgat, Barcelona, SPAIN ISO 9001 ISO 13485 Telf. (+34) 934 694 990 Fax. (+34) 934 693 435. website www.linear.es