Documento de apoyo 2,014
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El documento trata sobre el control de calidad en los análisis microbiológicos. Explica que el control de calidad incluye monitorear diariamente los procedimientos para asegurar resultados precisos y confiables. También describe factores que influyen en la calidad como el cumplimiento de protocolos, la calibración de equipos, y el manejo adecuado de muestras, medios de cultivo e insumos. Finalmente, presenta tablas con ejemplos de cómo controlar el funcionamiento de equipos, medios de cultivo y pruebas
Documento de apoyo 2,014
- 1. Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos LAFYM Profesor: Licda. Ana Rodas de García, QB
- 2. CONTROL DE CALIDAD EN LOS ANALISIS MICROBIOLOGICOS El control de calidad concierne al monitoreo diario de los procedimientos realizados El sistema de calidad lo constituyen las actividades que da a la administración la confianza en que los sistemas de control de calidad están instalados y son capaces de producir resultados analíticos de la máxima calidad. Ambos sistemas o programas están dirigidos a asegurar que se informen resultados confiables, reproducibles, y que se eliminen causas de desempeño insatisfactorio. Su ejecución debe ser racional, práctico, económico y continuo. Involucra desde la recolección, el transporte, la recepción, el análisis de la muestra y el reporte de resultados. No solo es la producción de resultados de alta calidad sino que también su entrega oportuna y aplicación adecuada. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD DE LOS ANALISIS EN MICROBIOLOGIA Cumplimiento de requerimientos de bioseguridad Cumplimiento de los procedimientos operativos estandar (POE) de las diferentes actividades que se realizan Comprobación permanente del buen funcionamiento del equipo. Recolección, recepción y manejo de las muestras Capacidad, experiencia y evaluación del personal Métodos y procedimientos seguidos CALIDAD DE LOS INSUMOS Agua destilada, medios de cultivo, reactivos y antisueros deben ser bien seleccionados y tener características óptimas. Deben guardare de acuerdo con las especificaciones Control de la fecha de recibido, fecha de apertura y fecha de vencimiento CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Los medios de cultivo son esenciales en microbiología, por lo tanto se tiene que asegurar su preparación adecuada. Los controles a realizar deben registrarse y archivarse Y COMPRENDEN: Determinación de pH - El pH es chequeado previo y después de autoclavear el medio de cultivo - El pH de un medio sólido se puede medir con un electrodo de superficie o permitiendo que una porción del agar se solidifique alrededor del electrodo. Si el pH difiere en 0.2 unidades ajuste el pH con ácido o álcali .
- 3. Control de esterilidad - Se toma aleatoriamente un porcentaje de cajas y tubos de cultivo de cada lote. Un 3-5 % de cada lote se somete a control - Se incuba a 35-36°C por 2 días los medios de cultivo para bacterias, y durante 5 días a temperatura ambiente para hongos. El resto se guarda en refrigeración. Si más de dos colonias son vistas por placa, descarte todo el lote. Control de eficacia del medio de cultivo y reactivos - Cepario: El laboratorio debe contar con un stock o banco de cepas para el monitoreo del buen funcionamiento de los medios de cultivo. - Estas cepas pueden obtenerse del trabajo de rutina o de cursos comerciales o de laboratorios de referencia. Respuesta bioquímica. En los medios donde se evalúa la respuesta bioquímica se utiliza un organismo control positivo y un control negativo para verificar la reacción a poner de manifiesto Evaluación de Inhibición o selectividad. Se recomienda sembrar al menos dos a tres tipos de especies. Una especie que no crece en el medio (inhibición de crecimiento) y una o más que deben crecer en el medio - Se recomienda como inoculo, preparar una suspensión de un cultivo puro del organismos a ensayar equivalente al estándar de MacFarland 0.5 (1.5 x 10 9 bacterias/mL). - De la suspensión se prepara una dilución 1:100. Y de esta dilución se siembra una asada de 0.01 ó 0.001 mL como inóculo para obtener colonias separadas y que se puedan observar y contar. - En caso, no se obtengan colonias separadas, se recomienda sembrar diluciones mayores a 1:100. Evaluación de soporte del crecimiento - Se prepara un inoculo con un número conocido de células ( por medio de la siembra de diluciones decimales del mismo se establece el número de células/ mL) - Luego se siembra un inoculo conocido uniformemente en la superficie del medio. Después de su incubación se establece el número de colonias crecidas y se determina el porcentaje de recuperación que presenta el medio. - Esto es útil en los casos donde se desea evaluar diferentes marcas de un medio o en la evaluación de un lote nuevo del medio deshidratado. - Control de fecha de caducidad - Cada medio de cultivo debe identificarse con nombre y la fecha de preparación - Ya existen especificaciones para cada medio en particular, y la mayoría se almacenan en refrigeración. Por lo general: - los medios en cajas duran sin protección alrededor de 15 días y dentro de las bolsas de protección 2 meses.
- 4. - Los medios en tubos con tapón hermético duran en refrigeración un promedio de 2 a 4 meses. CONTROL DE REACTIVOS, COLORANTES, DISCOS Y ANTISUEROS Es importante comprobar el buen funcionamiento de estos insumos, usando cepas "control positivo" y control negativo" Debe mantener un registro de la fecha de su ingreso y caducidad. MANTENIMIENTO DE CEPARIO Es necesario chequear la pureza y verificar la identificación de las mismas. Bacterias no fastidiosas Cultivos a temperatura ambiente por un año - Medio de conservación: agar tripticasa soya, agar nutritivo o agar stock sin inclinación - A partir de un cultivo puro del organismo a conservar, inocule con un asa en hilo 3 veces hasta el fondo del agar - Incube a 35°C por 18-24 h. - Cierre el tubo con corcho con parafina (corchos dentro de parafina derretida). - O los agares de conservación se preparan con una pequeña superficie inclinada, y después del crecimiento bacteriano se le agrega una capa de aceite mineral estéril - Guarde a temperatura ambiente y transfiera cada año Caldo tripticasa con 15 % de glicerol - Medio de conservación: Caldo tripticasa soya con 15 % de glicerol, se distribuye en viales de 1 a 2 mL y se esteriliza en autoclave para su esterilización. - A partir de un cultivo puro crecido en el medio sólido apropiado, hacer una suspensión en el medio de conservación. - Guardar a -20 C - Transferir cada año, tomando una a tres asadas de la suspensión congelada y sembrar en el medio sólido apropiado e incubar para su crecimiento, luego seguir con el procedimiento. Los cultivos para las pruebas de rutina diaria de organismos de rápido crecimiento pueden mantenerse en tubos de agar tripticasa soya con inclinación y con tapadera de rosca. Estos cultivos se guardan en refrigeración y se transfieren cada dos semanas. Bacterias fastidiosas ---Suspensión en leche descremada al 10% a partir de un cultivo puro ---Agar CTA*
- 5. Tales como N meningitidis , N gonorroheae S. pneumoniae* , S pyogenes H. influenzae Anaerobios - Inocule a partir de un cultivo puro siembre tubos con medio de carne cocida (Cooked meat medium) con tapón de rosca hermético - Incube a 35°C por 24 horas - Guarde a temperatura ambiente y transfiera cada 6 meses TABLA 1 EJEMPLOS DE MEDICIONES Y CONTROLES DE EQUIPO Equipo Procedimiento Período Límites de tolerancia Mantenimiento Refrigerador Registrar temperatura Diario 4-8°C Limpieza mensual Descongelar cada 6 meses Congelador Registrar temperatura Diario -18 a -20°C Limpiar y descongelar cada 6 meses Incubadora Registrar temperatura Diario 0.2 de la Temperatura (T) requerida Limpieza mensual e inspección cada 6 meses PH (medidor) Solución Calibradora Cada vez que se use ± 0,2 del pH especificado Limpiar cada vez que se use Autoclave Ajustar el nivel del agua. Registrar tiempo y temperatura Control biológico Diario Cada corrida Semanal Temperatura (generalmente 121 C), tiempo y presión requeridas No crecimiento Limpieza mensual e inspección cada 6 meses Microscopio Limpieza correcta Cada vez que se use Anualmente Jarra de anaeróbicos Indicadores de anaerobiosis Cada vez que se use Prueba positiva de anaerobiosis Reactivo catalizador después de usarse y cambio cada 3 meses Campana de seguridad Flujo de aire y luz UV Cada seis meses 45 a 55 pies/min Limpieza diaria, inspección general y mantenimiento anual
- 6. TABLA 2 EJEMPLOS DE CONTROL DE CRECIMIENTO Y RESPUESTA BIOQUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Medio Controles Reacción a las 24 horas de incubación (35-36°C) Agar Sangre S pyogenes S pneumoniae Beta-hemolísis Alfa hemólisis Agar XLD Escherichia coli Salmonella spp Colonias amarillas Colonias rojas o rosadas con el centro negro Agar MacConkey Escherichia coli Shigella spp Colonias rojas Colonias incoloras Agar TSI Shigella Salmonella spp Enterobacter aerogenes K/A K/A con gas y H2S A/A con gas Crecimiento en Citrato de Simons Escherichia coli Enterobacter aerogenes No crecimiento Crecimiento y color azul TABLA 3 EJEMPLOS DE CEPAS PARA EL CONTROL DE REACTIVOS Y PRUEBAS BIOQUIMICAS Prueba bioquímica Ejemplos de organismos control Reacción Oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Positiva Negativa Indol Escherichia coli Enterobacter aerogenes Positiva Negativa Voges proskauer Enterobacter aerogenes Escherichia coli Positiva Negativa Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes Positiva Negativa Coagulasa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Positiva Negativa
- 7. TABLA.4 FRECUENCIA DE CONTROL DE REACTIVOS Reactivos Frecuencia de control Catalasa (H202) 1 Oxidasa 1 Coagulasa 1 Taxos a tiras (Ej.; Discos ONPG) 1 ó 2 Antisueros 3 Colorantes 2 Medios de cultivo preparados por el laboratorio 4 Otros reactivos (pruebas bioquímicas) 1 ó 2 1= Cada día que se usa 2= Cada nuevo vial o lote y una vez por semana de uso 3= Cada nuevo vial y cada mes de uso 4= Cada nuevo lote y determinar la fecha de expiración
- 8. FACTORES QUE PUEDEN INCIDIR EN PRODUCTIVIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO La exactitud de un reporte de laboratorio está en relación directa con la calidad de los reactivos y medios de cultivos empleados así como el cuidado puesto por el analista para su uso. FACTORES INCIDENCIA AGUA DESTILADA MATERIALES TOXICOS, CONTAMINACION CON SALES INORGANICAS. AGENTES LIMPIADORES TOXICIDAD DE AGENTES RESIDUALES MATERIAL DE VIDRIO CONDICION, LIMPIEZA, ESTERILIZACION FACTORES PERSONALES LIMPIEZA DE MATERIAL DE VIDRIO, PREPARACION DE DILUCIONES, PREPARACION DE MEDIOS, MUESTREO, PLAQUEO, CONTEO CALCULOS CALCULOS SELECCION DE DATOS, CALCULO DE DATOS INCUBACION TIEMPO, TEMPERATURA, HUMEDAD, PLAQUEO FACTOR PERSONA, TIEMPO Y TEMPERATURA, DEFICIENCIA EN LIMPIEZA DE EQUIPO, DILUCIONES, MEZCLAS MUESTREO FACTOR PERSONAL, CONTAMINACIÓN, CONDICION DE EQUIPO, TIEMPO, TEMPERATURA ESTABLE. ESTERILIZACION SOBRE ESTERILIZACION DE MEDIOS, BAJA ESTERILIZACION DE MEDIOS Y DE MATERIAL DE VIDRIO. MEDIOS ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DESHIDRATADOS, PESADO, MALA LIMPIEZA DE MATERIALES DE VIDRIO, AGUA DESTILADA, SOLUCION, ESTERILIZACION DILUCIONES DE BLANCOS SALES INADECUADAS, AGUA DESTILADA, pH, INADECUADA ESTERILIZACION, DILUCIONES INEXACTAS.
- 9. FUNCIONAMIENTO DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO CONSTITUYENTES ACTIVOS MODO DE ACCION APARIENCIA DE COLONIAS 1. BPLS Selectivo para Salmonella sp 2. CALDO EC Selectivo para E. coli y bacterias coliformes 3. AGAR ENDO Selectivo para coliformes y E. coli de varios materiales 4. CALDO LAURIL SULFATO. Selectivo para prueba presuntiva para coliformes en agua. 5. MACCONKEY. Selectivo para Salmonella, Shigella y coliformes. VERDE BRILLANTE ROJO DE FENOL LACTOSA SACAROSA LACTOSA SALES BILIARES SULFITO DE SODIO FUCSINA LACTOSA LACTOSA LAURIL SULFATO DE SODIO LACTOSA SALES BILIARES CRISTAL VIOLETA ROJO NEUTRO VERDE BRILLANTE INHIBE CRECIMIENTO DE FLORA ACOMPAÑANTE. Salmonella ES LACTOSA Y SACAROSA NEGATIVO SALES BILIARES INHIBEN CRECIMIENTO DE GRAM POSITIVOS. LACTOSA FAVORECE CRECIMIENTO DE LACTOSA POSITIVOS SULFITO Y FUCSINA INHIBEN GRAM POSITIVOS. COLIFORMES FERMENTAN LACTOSA A ACIDO Y ALDEHIDO LO QUE LIBERA FUCSINA Y DA COLOR ROJO. LAURIL SULFATO INHIBE CRECIMIENTO DE BACTERIAS INDESEABLES. SALES BILIARES Y CRISTAL VIOLETA INHIBE GRAM POSITIVOS. ROJO NEUTRO DETECTA FERMENTACIÓN DE LACTOSA. Rojas rodeadas de zona roja: lactosa y sacarosa negativo (Salmonella sp). Amarillo-verde rodeados de zona verde: lactosa o sacarosa positivo ( E. coli, Citrobacter, Proteus, Klebsiella) Formación de gas a 44.5C (E. coli) Gas solo a 35C (bacterias coliformes pero no E. coli) Rojas: lactosa positivo Rojas con brillo metálico: E. coli Rojas a rosadas: Enterobacter-Klebsiella Formación de gas de lactosa Incoloras: Salmonella, Shigella Grandes, rodeadas de halo turbio: E. coli Grandes, rosadas, mucoides: Enterobacter, Klebsiella. FUNCIONAMIENTO DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO CONSTITUYENTES ACTIVOS MODO DE ACCION APARIENCIA DE COLONIAS 1. MANITOL SAL. Selectivo para Estafilococos patógenos 2. CETRIMIDA. Aislamiento y diferenciación de Pseudomona aeruginosa 3. SS. Aislamiento de Shigella y Salmonella 8. VOGEL-JOHNSON. Detección de estafilococos manitol sal positivos CLORURO DE SODIO MANITOL ROJO DE FENOL CETRIMIDA LACTOSA VERDE BRILLANTE CITRATO DE SODIO TIOSULFATO DE SODIO CITRATO AMONICO FERRICO ROJO NEUTRO MANITOL CLORURO DE SODIO TELURITO DE POTASIO CLORURO DE LITIO ROJO DE FENOL GLICINA SOLO MICROORGANISMO HALOTOLERANTES CRECEN EN EL MEDIO. ROJO DE FENOL INDICA DEGRADACIÓN DE MANITOL A ACIDO CETRIMIDA INHIBE CRECIMIENTO DE FLORA ACOMPAÑANTE. FAVORECE LA PRODUCCIÓN DE PIGMENTO VERDE BRILLANTE, TIOSULFATO Y CITRATO INHIBEN FLORA ACOMPAÑANTE. LA PRODUCCIÓN DE SULFURO SE DETECTA CON SALES DE HIERRO. EL ROJO NEUTRO INDICA LA DEGRADACIÓN DE LACTOSA POR COLIFORMES. FLORA ACOMPAÑANTE SE INHIBE CON TELURITO, GLICINA Y LITIO. EL MANITOL ES DEGRADADO POR ESTAFILOCOCOS PATÓGENOS QUE TAMBIEN REDUCEN EL TELURITO A TELURO METALICO. Colonias rodeadas de zona amarillo brillante: manitol sal positivo( S. aureus) No cambio de color: manitol sal negativo ( S. epidermidis y otros) Pseudomona aeruginosa produce pigmento amarillo-verdoso que fluoresce con luz ultravioleta. Incoloras: Shigella, Salmonella Incoloras con centro negro: Proteus y Salmonellas. Rosadas a rojas: E. coli Colonias grandes mucoides de rosado a blanco: Enterobacter Pequeñas, negras, rodeadas de zonas amarillas ( S. aureus). Pequeñas, grices, no rodeadas por zonas amarilllas ( S. epidermidis).
- 10. FUNCIONAMIENTO DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO CONSTITUYENTES ACTIVOS MODO DE ACCION APARIENCIA DE COLONIAS 9. XLD. Aislamiento y diferenciación de patógenos entéricos, especialmente Shigella y Salmonella. 10. TCBS. Aislamiento y cultivo selectivo de V. Cholerae y otros vibrios enteropatógenos. XILOSA LISINA LACTOSA SACAROSA TIOSULFATO DE SODIO CITRATO AMONICO FERRICO ROJO DE FENOL CITRATO DE SODIO TIOSULFATO DE SODIO BILIS SACROSA AZUL DE TIMOL AZUL DE BROMOTIMOL LA DEGRADACIÓN DE XILOSA, LACTOSA Y SACAROSA PRODUCE CAMBIO DE COLOR DEL INDICADOR. LA PRODUCCIÓN DE SULFURO SE OBSERVA POR PRECIPITADO CON HIERRO. DESCARBOXILACION POR COLORACIÓN PÚRPURA TIOSULFATO, CITRATO Y ALTA ALCALINIDAD INHIBEN CRECIMIENTO DE ENTEROBACTERIAS. SALES BILIARES INHIBEN ENTEROCOCOS. COLIFORMES NO METABOLIZAN LA SACAROSA. LA MEZCLA DE INDICADORES CAMBIAN COLOR A AMARILLO CUANDO SE FORMA ACIDO EN UN MEDIO FUERTEMENTE ALCALINO. Amarillo rodeado de zonas amarillas con precipitados opacos: E. Coli, Enterobacter, Klebsiella. Amarillas rodeadas de zona amarilla, traslucente con centro negro: Proteus. Color del medio, traslucentes con centro negro: Salmonella. Color del medio, traslucentes: Shigella, Providencia. Planas, de 2-3 mm de color amarillo: V. Cholerae Pequeñas , con centro azul verde: V. Parahaemolyticus. Azules: pseudomonas, aeromonas. FUNCIONAMIENTO DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO CONSTITUYENTES ACTIVOS MODO DE ACCION APARIENCIA DE COLONIAS 11. BAIRD PARKER. Aislamiento y enumeración de S. aureus 12. BISMUTO SULFITO. Para aislamiento y diferenciación de Salmonella typhi y otras Salmonellas. 13. GSP. Para detectar Pseudomonas y Aeromonas. CLORURO DE LITIO PIRUVATO DE SODIO GLICINA TELURITO DE POTASIO EMULSION DE YEMA DE HUEVO GLUCOSA SULFATO DE HIERRO VERDE BRILLANTE BISMUTO SULFITO GLUTAMATO ALMIDON ROJO DE FENOL LITIO Y TELURITO INHIBE CRECIMIENTO DE FLORA ACOMPAÑANTE. PIRUVATO Y GLICINA FAVORECE CRECIMIENTO DE A. Aureus QUE PRODUCE ZONAS Y ANILLOS COMO RESULTADO DE LIPÓLISIS Y PROTEOLISIS. LA REDUCCIÓN DEL TELURITO PRODUCE COLORACIÓN NEGRA. VERDE BRILLANTE Y BISMUTO INHIBE LA FLORA ACOMPAÑANTE. PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIERRO. LA REDUCCIÓN DE LOS IONES DE BISMUTO A BISMUTO METALICO PRODUCE UN LUSTRE METALICO ALREDEDOR DE LAS COLONIAS. UNICOS NUTRIENTES SON EL GLUTAMATO Y EL ALMIDON. AEROMONAS DEGRADA EL ALMIDON A ACIDO CON CAMBIO A AMARILLO. PSEUDOMONA NO LO HACE. Negras, rodeades de zona clara. Anillos opacos entre la zona clara aparecen después de 48 horas de incubación: S. aureus. Negras, irregulares, zonas opacas alredodor de las colonias después de 24 horas: S. epidermidis. Centro negro, rodeados de un precipitado negro con brillo metálico (llamado ojo de conejo u ojo de pescado) Salmonella, con excepción de S. parathyphi A y S. pullorum. Pequeñas, verdes a cafés: bacterias coliformes, Proteus y otras. Azul violeta, rodeadas de zona rojo violeta: Pseudomonas. Amarillas, rodeadas de zona amarilla. Aeromonas. FUNCIONAMIENTO DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO CONSTITUYENTES ACTIVOS MODO DE ACCION APARIENCIA DE COLONIAS 14. OXFORD LISTERIA. Selectivo para aislamiento y detección de L. monocytogenes. CLORURO DE LITIO ESCULINA CITRATRO AMONICO FERRICO AGAR COLUMBIA CLORURO DE LITIO, ACRIFLAVINA, COLISTINA, CEFOTETAN SUPRIMEN CRECIMIENTO DE GRAM NEGATIVOS Y LA MAYOR PARTE DE GRAM POSITIVOS. L. monocytogenes HIDROLIZA LA ESCULINA Y FORMA COMPLEJOS NEGROS CON EL HIERRO. Café verdes con halo negro
- 11. TECNICAS DE NUMERACION DE MICROORGANISMOS Existen varios procedimientos que permiten numerar o estimar la densidad tanto de microorganismos indicadores como de microorganismos patógenos. El uso de cualquiera de ellos depende de sus ventajas y desventajas particulares, de las características del material en estudio y del grado de contaminación esperado. Los laboratorios de análisis deben de contar con el equipo, materiales, medios de cultivo y la metodología que les permitan realizarlos en forma correcta. Los procedimientos mas comúnmente empleados son: el recuento heterotrófico en placa y la técnica de los tubos múltiples. Este último procedimiento emplea tablas para estimar la densidad de la población bacteriana. Para realizar los procedimientos de numeración de microorganismos deben considerarse las siguientes suposiciones básicas: Los microorganismos se distribuyen uniformemente en la muestra Los microorganismos existen como entidades simples Los microorganismos no se repelen unos con otros Cada porción de la muestra cuando se incuba en un medio adecuado exhibe crecimiento si el inóculo contiene uno o mas microorganismos. El recuento heterotrófico en placa se puede realizar empleando tres variantes: Vaciado (RAP) esparcido filtración por membrana. La técnica de los tubos múltiples puede ser por: fermentación crecimiento Se presenta una breve descripción de cada uno de los procedimientos Recuento heterotrófico en placa por vaciado Se colocan en cajas de Petri alícuotas de muestra (1 ó 0.1 ml) después se vierten 15 ó 20 mililitros de medio de recuento fundido y mantenido entre 44-45C, se mezcla y se deja solidificar, se incuba, y se cuenta de acuerdo a ciertas reglas. El procedimiento presenta las ventajas de ser rápido, sencillo y permite contar colonias(UFC). Las desventajas son que se puede producir un shock térmico a bacterias estresadas y que a veces el medio muy rico disminuye la recuperación de bacterias lesionadas. Recuento heterótrofico en placa por esparcido Se vierten alícuotas de muestra (0.1 a 0.4 ml) sobre el medio solidificado y parcialmente deshidratado, se esparce sobre la superficie moviendo de un lado para otro la caja de Petri o empleando una varilla de vidrio en forma de L. Las ventajas que presenta con relación al procedimiento de vaciado es que se evita el shock térmico, evita confusión con burbujas de aire o partículas y permite el conteo de colonias (UFC). Las desventajas se relacionan con los pequeños volúmenes de muestra que pueden ser utilizados y que para que el medio absorba el inóculo se debe deshidratar parcialmente colocando las cajas de petrie en un horno o incubadora unas horas antes de la siembra. Recuento heterotrófico en placa por filtración por membrana Se filtra un volumen de muestra a través de una membrana de una porosidad menor al tamaño de las bacterias. La membrana se coloca sobre un medio de agar y se incuba. Las colonias crecen sobre el filtro. Este procedimiento presenta las ventajas que se pueden analizar grandes volúmenes de muestra, es rápido y permite el conteo de colonias (UFC). Sin embargo no se pueden analizar muestras turbias y la capacidad de recuperación depende de la efectividad del
- 12. filtro. Pueden haber problemas en el recuento si el medio empleado está contaminado. Con alguna frecuencia aparecen crecimientos confluentes. Técnica de tubos múltiples de fermentación Se colocan alícuotas de muestra (100, 10, 1, 0.1ml) en series de 3 ó 5 tubos que llevan en su interior una campana invertida para observar la producción de gas como resultado de la fermentación lactosa. El procedimiento se realiza en tres fases, la presuntiva, la confirmativa y la completa. En la fase confirmativa se hacen estudios a dos temperaturas a partir de los tubos positivos de la primera fase. Los tubos se incuban, se leen y se anotan los resultados de los tubos positivos. La combinación de los tubos permite establecer el NMP en una tabla. Las tablas recomendadas para su uso contienen solamente las combinaciones que ocurren con mas frecuencia y que tienen significado estadístico. Las ventajas que tiene el procedimiento es que se puede usar para el estudio de diferentes tipos de muestras (leche, agua, alimentos), es bastante conocido, sencillo, está bien estandarizado y puede ser utilizado con muestras particuladas (turbidez). Los mejores resultados se obtienen cuando en una serie de tubos se obtienen todos positivos a bajas diluciones y todos negativos a altas diluciones. Presenta las desventajas que solo se puede usar para muestras con bajos recuentos. No es un recuento sino una estimación de la densidad de la población. Técnica de tubos múltiples de crecimiento Es una variante de la técnica de tubos de fermentación, la diferencia estriba en que no se pretende observar formación de gas, sino turbidez que evidencia crecimiento bacteriano. Por lo tanto no se desarrolla en varias fases sino solamente en una. Presenta similares ventajas y desventajas. CONCEPTOS GENERALES SOBRE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MEDICAMENTOS Importancia del Control microbiológico: En el campo farmacéutico se ha establecido la necesidad de incluir en los ensayos de control de rutina la determinación del número y tipo de microorganismos para evitar variaciones de un medicamento en cuanto a su aspecto, color, sabor, consistencia, composición, tolerancia y actividad. El fabricante está obligado a evitar que en el uso apropiado de los medicamentos se produzcan consecuencias nocivas que sobrepasen las medidas tolerables. Factores de contaminación de productos terminados: La contaminación está regida por la calidad microbiológica de la materia prima empleada, las condiciones de los procedimientos de manufactura y las formas farmacéuticas y su composición. Clasificación de materias primas de acuerdo al riesgo de contaminación: No. 1 Riesgo elevado, productos de origen animal que presentan contaminación primaria y secundaria. No. 2 Riego moderado a elevado, productos de origen vegetal que presentan contaminación secundaria. No. 3 Riesgo escaso, productos de origen sintético que presentan contaminación secundaria.
- 13. Higiene en los procedimientos de manufactura: La calidad microbiológica de los productos está directamente relacionada con la observacia de precauciones con respecto a la limpieza de equipo, la higiene del personal y la observancia de las buenas prácticas de manufactura. Formas farmacéuticas y composición: La contaminación microbiana es baja en formas farmacéuticas secas, semisólidas o líquidas que contienen en su composición sustancias que no favorecen el crecimiento como azúcar, alcohol o antisépticos. Categorías de medicamentos: 1. Inyectables 2. Preparaciones oftálmicas 2ª. Preparaciones para aplicación tópica especial y para cavidades corporales libres de gérmenes.y preparaciones orales que contienen antibióticos 3. Preparaciones tópicas de alto riesgo de contaminación. 4..Preparaciones para uso oral y otras que no contienen antibióticos. Características de productos farmacéuticos no estériles: Soluciones orales Soluciones acuosas de uno o mas fármacos con o sin saborizantes o agentes colorantes. SuspensionesFármacos no disueltos finamente divididos o dispersos en vehículos líquidos. Es necesario agitar para asegurar homogenización del sólido en el vehículo. Pueden incluir agentes antimicrobianos en su formulación. CápsulasEl fármaco está incluido en un contenedor o cubierta soluble de gelatina. Los contenidos pueden ser sólidos, líquidos o de consistencia pastosa. ComprimidoPreparaciones sólidas que contienen una dosis por unidad de uno o mas fármacos adicionados o no de aditivos. Se obtienen por compresión o moldeo de las partículas. Ungüento o Pomada Preparaciones de uso externo, que pueden contener una o mas drogas activas incorporadas a una grasa animal o vaselina de consistencia blanda. PastasPreparaciones sólidas de consistencia blanda, que contienen una alta proporción de sólidos de dos tipos; una base de gel de una sola fase como la pectina hidratada y la otra pueden ser pastas que no fluyen a la temperatura del cuerpo y sirve como recubrimiento protector. SupositoriosFormas sólidas a base de una sustancia fusible a la temperatura corporal, a base de manteca de cacao, glicerina solidificada, aceites hidrogenados, polietilenglicol, glicogelatina. Métodos de análisis microbiológicos de productos farmacéuticos no estériles: Determinación del número de gérmenesPuede hacerse por las técnicas de a) agar vertido en placa, b) tubos múltiples combinado con NMP y c) filtración a través de membrana. Determinación del tipo de microorganismosse emplean a) enriquecedores no selectivos, b) enriquecedores selectivos, c) siembra en agares específicos y d) pruebas de identificación. Límites microbianos en productos farmacéuticos: Categoría 1 Esterilidad
- 14. Categoría 2: Esterilidad Categoría 2ª: Ausencia de microorganismos viales en 1 gramo o 1 mililitro Categoría 3: No mas de 10 2 microorganismos viables en 1 gramo o mililitro. Ausencia de enterobacterias, P. aeruginosa, y S. Aureus Categoría 4: No mas de 10 3 UFC de microorganismos aerobios por gramo o mililitro y no mas de 10 2 UFC de hongos y levaduras. Ausencia de enterobacterias, S. Aureus y P. aeruginosa MANEJO Y PREPARACION DE MUESTRAS DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS NO ESTERILES (Muestra representativa para análisis microbiológicos) Manejo y preparación del material de análisis Las muestras, luego de ser tomadas, deben tratarse de tal forma que hasta el momento de análisis el número y tipo de microorganismos presentes originalmente en la muestra no experimenten modificaciones. Las muestras se deben colocar en envases impermeables al agua y al aire y previamente esterilizados (frascos de vidrio con tapón de rosca).Los envases se deben conservar bien cerrados, protegidos de la luz y en refrigerador. Preparar las muestras por tratamiento apropiado de acuerdo a sus características físicas, para obtener una solución o suspensión de todo o parte de ellas, adecuadas a los procedimientos que se realizarán. Para el examen del número de gérmenes, la muestra se diluye en forma rápida y homogenea bajo condiciones estériles y se coloca inmediatamente en los medios de cultivo. El medio de dilución no deberá contener sustancias nutritivas ni actividad nociva sobre los posibles gérmenes existentes en el material (se obtienen mejores resultados con soluciones tamponadas bacterio-isotónicas). El radio de dilución de la muestra es de 1:10. Considerar las siguientes situaciones: Si la muestra es un líquido que consiste en una solución verdadera, o es una suspensión acuosa o hidroalcohólica con menos del 30% de alcohol o es un sólido que se disuelve rápido y completamente: diluír con buffer de fosfatos, caldo lactosado y caldo tripticasa soya y proceder al recuento aeróbico total, mohos y levaduras y a la identificación de microorganismos indicadores Si la muestra es un sólido que no se disuelve completamente pero si en su mayor parte, suspenderla en: buffer de fosfatos, caldo lactosado y caldo tripticasa soya, agregar a cada uno Tween 80 al 0.1% y desintegrarla, y proceder al recuento aeróbico total, mohos y levaduras y a la identificación de microorganismos indicadores Si la muestra es un fluido inmiscible en agua, aceite, crema o cera preparar una suspensión con buffer de fosfatos, caldo lactosado y caldo tripticasa soya, agregar a cada uno Tween 80 al 0.1%, agitar y calentar a una temperatura no mayor a 45C si es necesario, y proceder al recuento aeróbico total, mohos y levaduras y a la identificación de microorganismos indicadores. ANÁLISIS MCIROBIOLOGICO DE MUESTRAS DE AGUA ENVASE, VOLUMEN Y ETIQUETADO Las personas encargadas de recolectar las muestras deben estar bien entrenadas Los envases para recolectar muestras de agua son botellas de vidrio con tapón esmerilado o con tapaderas de rosca de un material no tóxico ni corrosivo. El envase utilizado deberá ser estéril. También se utilizan bolsas plásticas estériles selladas de 200 ml.
- 15. AGENTES NEUTRALIZANTES Si el agua que se va a analizar contiene cloro, cloramina u ozono, es necesario agregar antes de la esterilización de los frascos 0.25 mililitros de una solución de tiosulfato de sodio 0.01 N para un volumen de 100 ml de muestra. Esta concentración de tiosulfato neutraliza alrededor de 15 mg/litro de cloro residual. Si se van a analizar aguas de desecho con altas concentracines de metales pesados, agregar a los frascos 0.2 mililitros de una solución de etilendiaminotetraacetato (EDTA) al 15 % a un pH de 6.5. El volumen mínimo de muestra es de 100 ml. Las muestras deben tener una etiqueta con los datos de su origen (localidad, fuente, punto de muestreo), la fecha y hora de recolección y datos sobre su transporte. TIPOS DE MUESTRAS Y PROCEDIMIENTO DE MUESTREO Y RECOLECCION Cuando se toman muestras para análisis bacteriológico es necesario adoptar todas las precauciones para evitar contaminación accidental durante el proceso. Durante la toma nada debe tocar el tapón ni el cuello del frasco, que debe sujetarse cerca del fondo y sin necesidad de enjuagarlo. Agua Potable: Si el agua va a ser recolectada de un sistema de distribución, seleccione chorros que estén directamente conectados al servicio de distribución y no de los que están servidos de cisternas o tanques de almacenamiento. Muestras de chorro: En un sistema de distribución de agua, los exámenes bacteriológicos deben realizarse en muestras de puntos representativos del sistema de distribución cuidadosamente seleccionados. Deben incluirse muestras de puntos finales para demostrar la calidad bacteriológica a través de toda la red y asegurar que no ocurran problemas de ruptura en las líneas de distribución o reducción de la presión positiva. Para la toma de muestra se abre completamente el chorro y se deja correr el agua durante 2 ó 3 minutos, después se cierra. La abertura de salida y sus inmediaciones deben limpiarse cuidadosamente, primero frotándolo con algodón humedecido con alcohol y luego debe flamearse con una llama fuerte. Se abre de nuevo el chorro y se regula al grosor de un lápiz dejando que el agua corra a flujo constante durante 10 minutos y se llena la botella. Aguas superficiales: Suministros de aguas crudas (rios, lagos), aguas superficiales y recreacionales. Las muestras se obtienen en diferentes puntos de acuerdo con el objetivo de los análisis y se establece la frecuencia del muestreo. En aguas superficiales la frecuencia del muestreo debe reflejar las condiciones del cuerpo de agua. Por ejemplo para evaluar descargas se muestrea cada 4-6 horas, alrededor de 7-10 días. Aguas profundas: Se sumerge un frasco o botella esterilizada unos 30 cm a 1 metro(lagos) de profundidad y se gira hasta que el cuello quede con la boca contra corriente, si no hay corriente, se mueve la botella horizontalmente. Cuando se llena se saca rápidamente y se tapa. Existe equipo especial para realizar muestreos en aguas profundas. Sedimentos y lodos: Estas muestras son importantes en tanques de suministros o aguas recreacionales para tener conocimiento sobre la calidad general del agua Se extraen unos 300 mililitros de muestra. Los frascos no deben llenarse completemente con el propósito de poder agitar bien el contenido antes de realizar los procedimientos microbiológicos. Luego las botellas se cierran y se rotulan. TRANSPORTE Y RECEPCION DE MUESTRAS Las muestras deben ser enviadas sin demora al laboratorio para su análisis. Si las muestras no van a ser procesadas una hora después de su recolección deben transportarse cuidadosamente en frío(debajo de 10ºC). A su llegada al laboratorio, las muestras deben registrarse y revisar que
- 16. estén rotuladas con los datos necesarios. Luego refrigerarse y procesarse dentro de las siguientes 2 horas. Un tiempo de 6 horas entre la recolección y procesamiento es aceptable, en caso esto no es posible, el tiempo máximo entre la recolección y análisis es de 24 horas. Las muestras de agua que estén refrigeradas deben ser precalentadas en un Baño de María a 35C antes de efectuar los análisis. CALIDAD DEL AGUA PARA CONSUMO HUMANO Para exámenes de rutina de la mayoría de abastos de agua potable, particularmente los que han sido desinfectados, el objeto de la prueba de coliformes es determinar si se cumple con la norma como una medida de la eficiencia del tratamiento de la planta de operación o la posibilidad de contaminación bacteriana. Una alta proporción de ocurrencias de coliformes se atribuye no a fallo en el tratamiento sino a recrecimiento bacteriano. Como es difícil distinguir entre recrecimiento y nueva contaminación de coliformes la precaución sugiere que se considere como signo de nueva contaminación. La estrategia de la potabilidad se basa en el conocimiento de la condición sanitaria de los abastos determinada por monitoreo bacteriano. Deben usarse 5 tubos de fermentación conteniendo 10 ml de muestra. Si se usan 100 ml de muestra deben usarse 5 botellas. Debido a que las aguas tratadas pueden no contener coliformes por 100 mililitros, los laboratorios de plantas de agua pueden considerar usar 10 tubos de fermentación con 10 ó 100 mililitros.para obtener un mejor estimado estadístico. CALIDAD DE AGUAS NO POTABLES El objetivo del análisis de agua no potable generalmente es estimar la densidad de contaminación bacteriana, determinar las fuentes decontaminación, reforzar los estándares de calidad o trazar la sobrevivencia de los microorganismos. COLIFORMES TOTALES Bacterias en forma de bacilos Gram Negativo, que crecen en presencia de sales biliares u otros agentes tensoactivos, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24- 48 horas. La mayoría son especies de Enterobacteriaceae. COLIFORMES FECALES Son organismos que pueden encontrarse en el intestino humano y heces de animales y se consideran el principal indicador de contaminación fecal de agua de uso doméstico, industrial y otros. Su presencia en el agua es el estándar de calidad bacteriológica. Bacterias que fermentan la lactosa a 44C. Comprenden mayormente al género Escherichia. ESCHERICHIA COLI Es el indicador mas preciso de contaminación fecal. Su diferenciación del resto de coliformes es en base al IMViC y a la -galactosidasa y a -glucuronidasa. DETERMINACIÓN DEL NUMERO TOTAL DE GERMENES Es el número total de UFC detectable en una cantidad determinada (1 gramo o 1 mililitro) de material bajo condiciones definidas de cultivo y en un medio de cultivo determinado.
- 17. Metodos Vertido en placa Filtración por membrana Indicación de resultados El número total de gérmenes (número de colonias) es referido a 1 mililitro de agua examinada. Si el valor es 100, se redondea a decenas enteras y si es 1000, se redondea a centenas enteras. DETERMINACION DEL TITULO DE COLIFORMES Y E. coli Es la cantidad más pequeña de agua expresada en mililitros, en que las bacterias son todavía detectables. Para la determinación del título de coliformes y E. coli se mezclan volúmenes decrecientes de agua con una solución que contiene lactosa. Luego se examinan con respecto a enturbiamiento y eventualmente a la producción de ácido y gas. Indicación de Resultados Se indica el volumen mas pequeño de agua en que aún son detectables las bacterias mediante los métodos descritos. Se indican el medio de cultivo y la temperatura de incubación. DETERMINACIÓN DEL NUMERO DE COLIFORMES Y E. coli Es el número de UFC de coliformes generales y fecales ( E. coli ) que se detectan en una cantidad determinada de agua, bajo condiciones definidas de cultivo y en medios determinados. Metodos Dilución en tubos(fermentación de los tubos múltiples), NMP Filtración por membrana. RECUENTO DE COLIFORMES GENERALES Y FECALES POR EL METODO DE TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACION PROPOSITO Es un procedimiento extremadamente útil que permite apreciar la calidad sanitaria del agua y la efectividad de los procesos de tratamiento. Se puede usar para examinar aguas de bebida, aguas naturales y efluentes. PROCEDIMIENTO Prueba de orientación(presuntiva) Inocular una serie de tubos con caldo Lauril sulfato caldo Lactosado, con cantidades decimales apropiadas(múltiplos y submúltiplos de un mililitro) de la muestra. El tamaño de los tubos y su número varían de acuerdo a las características del agua a analizar.
- 18. Prueba de confirmación Trabajar con todos los tubos primarios que presenten formación de gas incluso antes de las 48 horas. Agitar suavemente o rotar los tubos de fermentación que presenten gas. Sembrar una asada(asa de 3 mm de diámetro) a partir de cada tubo positivo a gas en la prueba presuntiva, a tubos de fermentación que contengan caldo Bilis Verde Brillante para coliformes totales y otra asada a caldo E. Coli (Bilis Verde Brillante) para coliformes fecales. Incubar los tubos de Bilis Verde Brillante inoculados para coliformes totales por 483 horas a 350.5C. Incubar los tubos de caldo C. Coli (Bilis Verde Brillante) para coliformes fecales por 24 2 horas a 44.50.2C en un baño de agua entre los 30 minutos después de haberlos inoculado. Interpretar la presencia de gas en cualquier cantidad para coliformes totales y fecales como una prueba confirmativa positiva. Anotar el número de tubos positivos de cada dilución sembrada e incubada a las dos temperaturas Prueba complementaria Se realiza a partir de los tubos de la prueba confirmativa. Establece en definitiva la presencia de coliformes y es un control de calidad de los datos. Puede hacerse por la doble confirmación de caldo Bilis Verde Brillante y caldo E.coli Estriar una asada del 10% de los tubos positivos a agar MacConkey e identificar. Interpretación (estimación de la densidad bacteriana)) La combinación de tubos positivos se busca en las tablas para obtener el NMP por 100 mililitros de muestra analizada. RECUENTO TOTAL BACTERIAS AERÓBICAS POR EL METODO DE VERTIDO EN PLACA PROPOSITO Puede ser de utilidad en el control y modificación del límite de turbidez o para evaluar los cambios durante el tratamiento y distribución. Procedimiento Fundir el agar Plate Count Agar estéril en agua hirviendo. Evitar exposición prolongada a altas temperaturas durante y después de la fundición. Mantener fundido el medio en un Baño de María entre 44-46C. (En un recipiente separado colocar un termómetro en agua o medio que ha sido expuesto a la misma temperatura de calentamiento o enfriamiento. No depender del sentido del tacto ) Colocar con pipetas estériles porciones de 1 y 0.1 mililitros de la muestra no diluida y 1 ml de una dilución 10 2 en cajas de Petrie estériles(la mayoría de muestras de agua potable permiten el conteo esas diluciones) Añadir 15 mililitros de agar Plate Count aún líquido y mantenido a 44-46C C(Baño de María) Mezcle cuidadosamente la muestra de agua con el agar, con movimientos en forma de ocho. Dejar solidificar el agar e invertir las cajas con el fondo hacia arriba. Incubar a 35-36por 24-48 horas Interpretación(conteo) Seleccionar las cajas que presenten entre 30 y 300 colonias Compute los conteos bacterianos por mililitro multiplicando el promedio de colonias por caja por el recíproco de la dilución usada. Cuando no se obtiene crecimiento en ninguna de las cajas, se debe informar como menos de la dilución menor sembrada.
- 19. Cuando no hay cajas con conteos entre 30 y 300 colonias, y una o mas cajas tienen mas de 300 use las cajas que tienen conteos cerca de 300 colonia, multiplique el promedio por el recíproco de la dilución y reporte como recuento estimado de UFC/ml. Cuando hay mas de 300 colonias en todas las placas, seleccione las de menor dilución y cuente las colonias en 13 cuadros de 1 centímetro cuadrado (del contador de colonias). Si es posible selecciones 7 cuadros consecutivos horizontales y 6 cuadros consecutivos horizontales y obtenga un promedio. Multiplique este promedio por el área total de la caja que puede ser de 57 centímetros cuadrados para cajas de plástico o 65 centímetros cuadrados para cajas de vidrio y por el factor de dilución para obtener las UFC/ml. Cuando las cajas presentan crecimientos mayores que 100 colonias/ cm 2 reportar el resultado como mayor que 6500 ó 5700 veces el recíproco de la mas alta dilución cuando se usen cajas de vidrio o plástico respectivamente. Si el valor es mayor que 100 se redondea a decenas enteras y si es mayor que 1000 se redondea a centenas enteras. Reporte de resultados Reporte todos los conteos como UFC/ml. Método de vertido en placa- 35C/48 horas, Agar Plate Count RECUENTO DE COLIFORMES GENERALES Y FECALES POR EL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PROPOSITO Es un procedimiento extremadamente útil en el monitoreo de emergencia de agua potable y en el examen de una variedad de aguas naturales PROCEDIMIENTO Esterilizar el aparato de filtración flameando la parte interior y la pieza de unión del embudo de metal y la frita de metal. Dejar que se enfríe el aparato Colocar sobre la frita de metal con una pinza estéril, los filtros de membrana Colocar la parte superior del embudo empleando el cierre de bayoneta Llenar dos embudos hasta la marca de 100 mililitros con el agua a examinar (menor cantidad si la muestra es turbia). Un volumen ideal dará crecimientos entre 50 y no mas de 200 colonias. Para aguas de beber analice porciones duplicadas del mismo volumen. Para otro tipo de aguas analice tres volúmenes diferentes(diluidos o no )dependiendo de la densidad bacteriana esperada. Cuando se filtran menos de 20 ml de muestra(diluida o no) deben agregarse aproximadamente 10 ml de agua estéril, lo cual ayuda a la dispersión de la bacteria sobre toda la superficie efectiva del filtro. Filtrar las muestras Colocar los filtros de membrana con la parte inferior hacia abajo sobre la superficie del agar Endo, con un movimiento de enrollado para evitar que quede aire atrapado. Incubar las cajas de Petrie en posición invertida a 35 1.5C durante 20 4 horas para coliformes generales y a 44.50.2C en Baño de María para coliformes fecales. Lavar el sistema de filtración con agua destilada. Interpretación (recuento) Cuente las colonias típicas (color rosado a rojo con brillo metálico verde-dorado ), con la ayuda de un estereomicroscopio en forma perpendicular al plano del filtro. El área de brillo puede variar en tamaño, desde pequeños puntos hasta cubrir en forma completa la superficie de la colonia. Las colonias que carecen de brillo metálico pueden ser rosadas, rojas o blancas y se consideran no coliformes. Las colonias de coliformes totales pueden ser rosadas, rojas o
- 20. blancas. Normalmente pocas colonias de coliformes no fecales se observan, debido a la acción selectiva de la temperatura elevada. El conteo total de colonias (coliformes y no coliformes) en agar tipo Endo no tiene relación con el número total de bacterias presentes en la muestra original. Verifique como mínimo 5 colonias típicas(algunas veces pueden ser producidas por no coliformes) transfiriendo el crecimiento a tubos paralelos de caldo lactosado y caldo bilis verde brillante que se incuban a 350.5C por 48 horas.. La producción de gas en caldo bilis verde brillante entre 48 horas verifica los coliformes. Se puede hacer una verificación en 4 horas con citocromooxidasa(-) y -galactosidasa(+) Las colonias que presentan brillo verde metálico, se purifican en cualquier otro agar (tripticasa, MacConkey, etc.) se incuba 24h a 35°C, y se realiza posteriormente IMVIC. Calcular la densidad de coliformes en membranas con crecimientos entre 20 y 80 coliformes y no mas de 200. Calcular la densidad de crecimientode coliformes fecales en membranas que presenten entre 20 y 60 colonias de coliformes fecales. Este rango de densidad es mas restrictivo que para coliformes generales. Se puede emplear la siguientes fórmula Colonias de coliformes contadas X 100/ml de muestra filtrada Si se obtienen crecimientos que cubren el área total de filtración reporte los resultados como crecimiento confluente con (o sin) coliformes totalesy fecales. Si el número total de colonias (coliformes y no coliformes) excede los 200 por membrana o si las colonias no se distinguen para realizar recuentos exactos reportar como “muy numeroso para contar MNPC. Si se hicieron análisis duplicados de una muestra de 50 mililitros cada una y en un se obtuvo 5 y en otra 8 colonias de coliformes reportar 13 colonias de coliformes por 100 mililitros de acuerdo a la siguiente fórmula (5+8) X 100/(50+50) INDICACIÓN DE RESULTADOS Reporte todos los conteos como Unidades Formadoras de Colonias UFC/100ml. Método de filtración por membrana-44 0.2C –Agar Endo C. INSTRUCCIONES PARA TOMA DE MUESTRA EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE AGUA El envase utilizado deberá ser estéril de vidrio resistente el calor, de boca ancha. Este es proporcionado por el Laboratorio. El volumen mínimo de muestra es de 100 centímetro cúbicos (mililitros). Las muestras deben tener una etiqueta con los datos de su origen (localidad, fuente, punto de muestreo), la fecha y hora de recolección y datos sobre su transporte. Muestras de chorro: Para la toma de muestra, utilice un mechero de alcohol, o bien humedezca un algodón con alcohol sostenido con una pinza, flamee directamente el chorro. Abra completamente el chorro y se deje correr el agua durante 2 ó 3 minutos, regule al grosor del flujo de agua dejándolo correr constante durante 5 minutos y se llene la botella. Aguas superficiales: Suministros de aguas crudas (rios, lagos), aguas superficiales y recreacionales. Las muestras se obtienen en diferentes puntos de acuerdo con el objetivo de los análisis y se establece la
- 21. frecuencia del muestreo. En aguas superficiales la frecuencia del muestreo debe reflejar las condiciones del cuerpo de agua. Por ejemplo para evaluar descargas se muestrea cada 4-6 horas, alrededor de 7-10 días. Aguas profundas: Se sumerge un frasco o botella esterilizada unos 30 cm a 1 metro(lagos) de profundidad y se gira hasta que el cuello quede con la boca contra corriente, si no hay corriente, se mueve la botella horizontalmente. Cuando se llena se saca rápidamente y se tapa. Existe equipo especial para realizar muestreos en aguas profundas. Sedimentos y lodos: Estas muestras son importantes en tanques de suministros o aguas recreacionales para tener conocimiento sobre la calidad general del agua Se extraen unos 300 mililitros de muestra. Los frascos no deben llenarse completamente con el propósito de poder agitar bien el contenido antes de realizar los procedimientos microbiológicos. Luego las botellas se cierran y se rotulan. Transporte: Deben ser enviadas al laboratorio sin demora al Laboratorio y en refrigeración (temperatura menor de 10 ºC). ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS MANEJO DE MUESTRAS DE ALIMENTOS Se debe observar la condición física general de la muestra y anotar si su temperatura es apropiada. El almacenamiento apropiado es esencial si la muestra no va a ser analizada inmediatamente. Una muestra congelada, ya sea que va a ser analizada inmediatamente o después deberá ser descongelada de una manera que minimice cambios en la población microbiana. Después las muestras sólidas y líquidas deberán ser mezcladas para lograr una uniforme distribución de los organismos. El paso final en la preparación de la muestra es la homogenización. El licuado ha sido aceptado como un método adecuado en la preparación de la muestras. Debe tomarse mucho cuidado en estas etapas iniciales de la preparación de la muestra para mantener su integridad MATERIALES Y EQUIPO Stomaker o licuadora mecánica Frascos de vidrio estériles o jarras de metal de 1000 mililitros con tapadera. Balanza de 2000 gramos de capacidad con una tolerancia de 0.1 gramos. Botellas estériles de 250 mililitros con tapón de rosca. Pipetas estériles graduadas de 1.0, y 10 mililitros. Cuchillas, tenedores, espátulas, forceps, tijera, cucharas y abatelenguas RECIBO DE MUESTRAS 1. Condiciones de los recipientes que contienen las muestras Chequear los contenedores para detectar defectos físicos gruesos. Cuidadosamente inspeccione las bolsas plásticas y botellas para observar marcas de punción. Si las muestras fueron colectadas en botellas de plástico chequearlas para fracturas y pérdida de líquidos. Si se
- 22. usaron bolsas plásticas para el muestreo asegurarse que los cierres no puncionaron alrededor de las bolsas. Puede resultar una contaminación cruzada de uno o mas defectos descritos que pueden invalidar la muestra y se debe notificar al colector. 2. Etiquetado y reporte Cada muestra deber ser acompañada por una copia del reporte de recolección y deberá ser oficialmente sellada con tape, mostrando el número de la muestra, el nombre del recolector y la fecha. Cada unidad de muestra que comprende la muestra deberá tener número individual. 3. Control de temperatura Si la muestra es perecedera y no congelada anote su temperatura. Las muestras enviadas congeladas deberán ser congeladas cuando se reciban en el laboratorio. Las muestras frescas perecederas deberán registrar temperatura entre 0 y 4C. Notar cualquier discrepancia en la hoja. 4. Apego al plan de muestreo La mayoría de comidas son colectadas bajo planes de muestreo diseñados específicamente. Las comidas a ser examinadas para Salmonella, sin embargo, son muestreadas de acuerdo a planes de muestreo estadístico designados exclusivamente para uso con este patógeno. Dependiendo de la comida y del tipo de análisis a realizar determine si la comida ha sido muestreada de acuerdo al mas apropiado plan de muestreo. 5. Almacenamiento Idealmente las muestras deben ser examinadas inmediatamente cuando se reciben en el laboratorio. Prácticamente sin embargo la iniciación de los análisis puede ser pospuesta. Almacene congeladas las muestras a -20C mientras son examinadas. Refrigera las muestras perecederas a 0-4C por no más de 24 horas. Almacene las muestras no perecederas, envasadas o de baja humedad a T. Ambiente mientras se realiza el análisis. 6. Notificación a los muestreadores Si en su opinión la muestra no será analizada porque no llena los criterios, debe notificarse para que se obtenga una muestra válida para el análisis y también para reducir la posibilidad de que sucedan las mismas situaciones. DESCONGELAMIENTO Use una técnica aséptica durante la manipulación del producto. Antes de cualquier manipulación o análisis de la muestra, limpie el área inmediata y alrededor del área de trabajo. Además pase un algodón con etanol al 70% o un agente germicida comercial. Si la muestra está congelada, deshiele en el contenedor original en el que fue recibido en el laboratorio. En lo que sea posible, procurar no transferir la muestra a un segundo contenedor para el deshielo. Si la muestra puede ser fácilmente manipulada sin deshielo, ejemplo: helado de crema, proceda directamente al siguiente paso. Si la muestra debe ser descongelada, hacerlo de tal forma que minimice la destrucción o proliferación de la microflora. Normalmente la muestra puede ser descongelada a 2-5C entre 18 horas. Si se desea un descongelado rápido puede hacerse a menos de 45C por no más de 45 minutos. Cuando deshiele a temperatura elevada, agite la muestra frecuentemente o preferiblemente en forma continua. El descongelamiento rápido es mejor llevarlo a cabo en un baño de María a temperatura controlada.
- 23. MEZCLADO Varios grados de distribución no uniforme se esperan en muestras de comida. De acuerdo a esto, es necesario, mezclar manualmente la muestra antes del tomar la unidad analítica de la muestra unitaria. Las muestras líquidas deben agitarse. Pesar asépticamente polvo, granulados con cucharas u otros utensilios convenientes. PESADO Tarar el vaso, entonces asépticamente pesar 25 ó 50 gramos del espécimen en la jarra. Si la muestra completa pesa menos de la cantidad requerida según el análisis pese una porción equivalente a la mitad de la muestra y agregue una cantidad de diluyente requerido para hacer una dilución 10 -1 LICUACION Y DILUCION Agregue 225 ó 450 mililitros del diluyente al frasco conteniendo 25 0 50 gramos la unidad analítica. Pase la muestra por el stomacher en el tiempo y rpm programados o licue por unos pocos segundos a baja velocidad y entonces pasar a alta velocidad para un tiempo total de licuación que no exceda 2 minutos. Esto da una dilución de 10 -1 . Hacer diluciones en forma rápida del homogenizado original, usando pipetas que pueden servir el volumen requerido en forma exacta. No dispense menos del 10% del volumen total de una pipeta. Prepare todas las diluciones decimales con 90 mililitros de diluyente estéril mas 10 mililitros de la dilución previa, a menos que se especifique otra cosa. No deben de pasar mas de 15 minutos desde que la muestra fue licuada hasta que todas las diluciones se colocan en los medios apropiados.
- 24. IMPORTANCIA DE MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS DE CONSUMO DETERIORANTES INDICADORES PATOGENOS ACIDOFILAS pH 3.8 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus (producción) TERMORRESISTENTES Resisten pasteurización(lácteos y cárnicos) Bacillus, Clostridium, Micrococcus, Lactobacillus, Enterococcus. PSICROTROFOS Crecen a T. de refrigeración(alimentos refrigerados no estériles) Pseudomonas, Lactobacillus, Vibrios, Micrococcus, Mohos, Levaduras, Patógenos (C. perfringes, C. botulinum, V. cholerae, L. monocytogenes, Salmonella sp, S. aureus HALOFILICAS 3% débil 3%-15% moderadas 15%-30% extremas Vibrios, Micrococcus, Bacillus ESPOROFORMADORES Mesófilos y term´filos(alimentos enlatados) Bacillus, Clostridium HOLOTOLERANTES Ausencia o presencia de sal(12%) Staphylococcus Coliformes totales Coliformes fecales o termorresistentes E. coli Bacterias heterotróficas aerobicas(deteriorantes y patógenas. Mohos y levaduras(general) Salmonella sp Shigella sp E. coli =O:154 H:7 L. monocytogenes S. aureus C. botulinum C. perfringes B. cereus V. cholerae V. parahemolyticus V. vulvificus
- 25. FACTORES DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS GRUPO, GENERO O ESPECIE AGUA DISPONIBLE PH Bacterias (general) Levaduras (general) Mohos (general) levaduras osmófilas Salmonella V. cholerae E. coli 0.91(carne fresca, leche) 0.88(conecentrado de jugo de frutas) 0.80 (jaleas) 0.60(frutas secas) 4.0 - 9.0 5.0 - 10 4.3 - 10 MICROORGANISMOS PATOGENOS MICROORGANISMO Salmonella sp Shigella sp E. coli 0:157 H:7 L. monocytogenes ENFERMEDAD ENTEROCOLIT IS AGUA DISENTERIA BACILAR COLITIS ENTEROHEMO RRAGICA ENCEFALITIS MENINGITIS SEPTICEMIA ABORTO PERIODO DE INCUBACION 6 – 72 HORAS 12 – 96 HORAS 5 A 5 DIAS TRANSMISION FECAL ORAL , POR ALIMENTOS CONTAMINAD OS AGUA, FOMITES, ALIMENTOS, PERSONA A PERSONA CARNE CONTAMINAD A CON HECES DE BOVINOS LACTEOS VEGETALES ALIMENTOS PROCESADOS DOSIS INFECTIVA 100 a 1000 células 10 – 100 CELULAS ¿ ¿ SINTOMAS dolor abdominal diarrea, nausea, vómitos, fiebre fiebre, nausea, vómitos
- 26. MICROORGANISMOS PATOGENOS MICROORGANISMO S. aureus C. botulynum C. perfringes B. cereus ENFERMEDAD INTOXICACIO N INTOXICACIO N GASTRO ENTERITIS GASTRO ENTERITIS PERIODO DE INCUBACION HORAS HORAS 7-15 HORAS 6 A 16 HORAS TRANSMISION ALIMENTOS ALTO CONTENIDO PROTEICO, EMBUTIDOS, LACTEOS ALIMENTOS ENLATADOS MAL PROCESADOS CARNES COCIDAS Y PRODUCTOS DE POLLO DEJADOS A T. AMBIENTE ARROZ FRITO, CREMA DE LECHE, CARNES COCIDAS, SOPAS, PUDINES, ENSALADAS DOSIS INFECTIVA 1 A 10 MILLONES DE CELULAS 1 MILLON DE CELULAS/G 100,OOO O MAS CELULAS SINTOMAS vómitos , diarrea parálisis neuromuscular, dolores abdominales, diarrea diarre, náusea, vómitos MICROORGANISMOS PATOGENOS MICROORGANISMO Vibrio cholerae Vibrio pahaemolyticus Vibrio vulvificus ENFERMEDAD COLERA GASTRO ENTERITIS SEPTICEMIA, DERMATITIS DE CONTACTO PERIODO DE INCUBACION TRANSMISION AGUA, PRODUCTOS MARINOS CRUDOS O MAL COCINADOS VEGETALES Y OTROS PRODUCTOS CONTAMINAD OS ALIMENTOS MARINOS QUE SE CONSUMEN CRUDOS O MAL CONCINADOS OSTRAS CONTAMINAD AS Y OTROS ALIMENTOS MARINOS DOSIS INFECTIVA 100,000 A UN MILLON DE CELULAS 1 MILLON DE CELULAS POR GRAMO ¿ SINTOMAS diarrea y vómitos diarrea y vómitos
- 27. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MANOS 1. IMPORTANCIA Asegurar la calidad en la producción de alimentos inocuos para el consumo humano o cualquier otro producto elaborado. Determinar la presencia de microorganismos indicadores de una mala técnica de desinfección de manos en el personal. Determinar la presencia de microorganismos patógenos. 2. CONTAMINACIÓN POR PERSONAL Tener en cuenta que la base del éxito de un programa de calidad es la capacitación del personal. El personal no debe ser un foco de contaminación durante la elaboración. Las personas que recolectan, transportan, almacenan, procesan o preparan el producto son responsables frecuentemente de la contaminación microbiana. Los manipuladores infectados o colonizados por agentes patógenos pueden contaminar los productos que tocan. 3. TRANSMISIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Transmisión de microorganismos patógenos desde el hombre hasta los productos. Los patógenos transportados pueden proceder de personas infectadas en situaciones diversas, incluido el período de incubación previo a las manifestaciones clínicas de una enfermedad. Al no existir enfermedad visible durante este período, la prevención depende de los hábitos de higiene. Contaminación cruzada. Los patógenos presentes sobre algún producto pueden ser transferidos a través de las manos a otros que son tocados posteriormente. Este tipo de contaminación cruzada solamente puede evitarse si el personal esta entrenado para no manipular productos con las manos que no hayan sido perfectamente descontaminadas. 4. EN EL PERSONAL Enfatizar la importancia que tienen en los procesos de elaboración de un producto. Deben: usar ropa de trabajo adecuada. cofia, calzado antideslizante, guantes. Al usar guantes no olvidar cambiarlos o limpiarlos como si se tratara de sus propias manos.
- 28. No fumar, no comer. En caso de tener alguna herida cubrirla con material impermeable. 5. HIGIENE EN EL PERSONAL. La contaminación de los alimentos puede evitarse o, al menos, reducirse al mínimo mediante una buena higiene personal, como son: Lavado de las manos Empleo de antisépticos cutáneos Cubrecabezas Mascarillas Ropa limpia Prohibición de comer, fumar y masticar en la zona de manipulación y/o producción Higiene personal general Instalaciones sanitarias apropiadas 6. OBJETIVO Detectar portadores de Staphylococcus aureus. Detectar otros microorganismos como E. coli o Coliformes fecales. METODO PARA LA TOMA DE MUESTRA DE LAS MANOS DE MANIPULADORES Humedecer el hisopo en el diluyente (Caldo Letheen modificado) y rotarlo en la palma de la mano, incluyendo la zona entre los dedos y las uñas. Lavar el hisopo en el diluyente y dejar la porción con algodón dentro del tubo. Repetir la misma operación para la otra mano. Siembra para S. aureus: 1. Incubar la muestra por 30-60 minutos 2. Agitar fuertemente el hisopo en los tubos con el diluyente, utilizando un agitador tipo Vortex, para lograr un buen lavado de los hisopos. 3. Sembrar 1 ml del líquido en dos placas con agar VRB y PCA por vertido 4. Sembrar en la superficie de cada una de las 2 placas con agar Baird Parker (con telurito y lecitina) 0.5 ml del líquido del lavado por esparcido. 5. Incubar las placas en posición invertida a 35-37 ºC durante 30 y 48 horas. 6. 1º lectura a las 30 horas de incubación: elegir las placas que contengan entre 25 y 250 colonias aisladas y contar todas las colonias que muestren las reacciones características. 7. Para Coliformes observar y contar colonias rosadas con halo y sin halo, picar e inocular un tubo con caldo BVB con campanilla e incubar a 35°C/24 horas; observar fermentación e interpretar como positivo para Coliformes Totales. Esas mismas colonias inocular caldo EC e
- 29. incubar a 44°C/24 horas e interpretar como Coliformes Fecales. A partir de este tubo resembrar en Agar MacConkey y realizar IMVIC, para confirmar E. coli 8. En Agar Bair Parker se producen halos y anillos característicos de margen estrecho y blanco (por precipitación de sales de Ca y Mg, por los ácidos grasos liberados) y que aparezcan rodeadas por zonas claras (por reducción de la lecitina) que contrastan con la opacidad del medio y debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrolla una colonia negra. 9. La reacción con la yema del huevo y la reducción del telurito se presentan con notable paralelismo con la prueba de coagulasa (positiva). 10. Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas hasta 48 hs. 11. 2º lectura, a las 48 hrs. de incubación: contar todas las colonias que presentan el aspecto mencionado. 12. Llevar a cabo la prueba de coagulasa con colonias sospechosas de corresponder a S. aureus.
- 30. NEGATIVA: no se observa evidencia de la formación de fibrina. 1. aparecen coágulos muy pequeños desorganizados. 2. aparece un coágulo pequeño organizado. 3. aparece un gran coágulo organizado. 4. aparece coagulado todo el contenido del tubo. El coágulo se mantiene aún cuando se invierte el tubo. Nota: Puede sustituirse el Agar PCA por Agar tripticasa soya; el Agar Bair-Parker por Manitol sal y el Agar VRB por MacConkey. CONCEPTOS GENERALES SOBRE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE COSMETICOS Importancia del Control microbiológico La industria cosmética se preocupa de los microorganismos que pueden causar cambios químicos en sus productos o posibles daños en los usuarios. El aislamiento de microorganismos de productos cosméticos se basa los siguientes procedimientos microbiológicos: a) cultivos de enriquecimiento, b) diluciones directas, c) y métodos de plaqueo. Los productos que no son solubles en agua, inicialmente se tratan para hacerlos miscibles antes de los procedimientos de enriquecimiento y dilución. Los sistemas preservativos que se encuentran normalmente en los productos cosméticos, se inactivan parcialmente en los medios de enriquecimiento y en los procedimientos de plaqueo. Los microorganismos aislados se identifican por procedimientos microbiológicos comunes. Higiene En Los Procedimientos De Manufactura La calidad microbiológica de los productos está directamente relacionada con la observancia de precauciones con respecto a la limpieza de equipo, la higiene del personal y la observancia de las buenas prácticas de manufactura. MANEJO Y PREPARACION DE MUESTRAS DE PRODUCTOS COSMETICOS 1. Manejo del material de análisis Analizar las muestras lo más pronto posible. Si es necesario, las muestras deben almacenarse a temperatura ambiente. No deben incubarse, refrigerarse o congelarse antes o después del análisis. Inspeccionar cuidadosamente las muestras antes de abrirlas y registrar cualquier irregularidad en el recipiente que las contiene. Desinfectar la superficie del contenedor con una mezcla acuosa de etanol al 80% y ácido clorhídrico al 1% antes de abrir y remover la muestra. Secar la superficie con una gaza estéril antes de abrir. Usar una porción representativa del contenido. Si es posible, usar 10 gramos de muestra. Para productos que pesan menos que 10 gramos analizar el contenido completo. Si solo una unidad de muestra está disponible y deben realizarse mucho análisis, la sub- muestra para examen microbiológico debe tomarse antes.
- 31. 2. Preparación de la muestra Líquidos: No se requiere preparación especial. El Líquido debe agregarse directamente al caldo Letheen modificado. Sólidos y Polvos: Pesar asépticamente 10 gramos de la muestra agregar 1 mililitro de Tween 80 estéril y agregar a 90 mililitros de caldo Letheen modificado y mezclar vigorosamente. Cremas y productos a base de aceite: Pesar asépticamente 10 gramo de la muestra en un tubo de 20X150 mm con tapón de rosca, que contenga 1 mililitro de Tween 80 estéril. Dispersar el producto con una espátula estéril. Agregar a 90 mililitros con caldo Letheen modificado estéril. Aerosoles de polvos, jabones líquidos y otros materiales: Después de decontaminar la salida del bote de aerosol, expeler un 1 gramo del producto en una botella de dilución previamente tarada, con 9 mililitros de caldo Letheen modificado. Mezclar vigorosamente y repesar. Cuando se haya obtenido una suspensión usar el contenido total EVALUACION MICROBIOLOGICA DE PRODUCTOS COSMETICOS 1. Principio La prueba consiste en inocular 1 mililitro de la suspensión de la muestra en: caldo Letheen modificado, b) caldo dextrosa Saboureaud, c) caldo tioglicolato y en confirmar el crecimiento por plaqueo en agar Letheen y en Agar Dextrosa Papa en condiciones aeróbicas y agar Letheen en anaerobiosis. 2. Propósito Establecer si existen contaminantes microbianos aeróbicos en productos cosméticos, y contaminantes aeróbicos y anaeróbicos en talcos y otros polvos. 3. Procedimiento Sembrar un mililitro de la suspensión del producto en cada uno de los frascos conteniendo caldo Letheen, caldo Dextrosa Sabouraud y caldo Tioglicolato si el producto es talco u otro polvo. Se realizan diluciones seriadas. Incubar el caldo Letheen y el caldo Dextrosa Sabouraud a 302C por 7 dias Incubar el caldo Tioglicolato a 352C durante 24 horas. Transferir 1 mililitro del caldo Letheen a agar Letheen, 1.0 mililitro del caldo Dextrosa Sabouraud a agar Dextrosa Papa. Esparcir el inóculo sobre la superficie de los agares usando un esparcidores. Incubar las cajas de agar letheen y agar dextrosa Para por 4 dias a 302C Interpretación Si se observa crecimiento en alguna de las cajas después del período de incubación, debe realizarse el recuento aeróbico en placa en la muestra de cosmético. Si no se observa crecimiento en ninguna de las cajas debe reportarse que la muestra no contiene microorganismos viables. RECUENTO DE Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas sp. EN MUESTRAS DE PRODUCTOS COSMETICOS POR EL METODO DE ESPARCIDO EN PLACA Se toma una alícuota a partir del Caldo Letheen dil 1:10 y se inoculan cajas por esparcido (los agares a utilizar son Vogel Jhonson, Cetrimida, MacConkey)
- 32. UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA PROGRAMA DE EXPERIENCIAS DOCENTES CON LA COMUNIDAD –EDC- LABORATORIO DE ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS –LAFYM- ENTEROBACTERIAS Reacciones Microorganismo TSI S/F, g, H2S LIA S/F, g, H2S MIO Citrato Urea Malonato Rojode Metilo Voges Proskauer Xilosa Lactosa ONPG OLA M I O O L A Escherichia coli A/K/A, ±,- K/K-A, ±, - ± ± ± - - - + - + ± + + ± ± Shigella dysenteriae K/A, -, - K/A, -, - - ± - - - - + - - - - - - ± Shigella flexneri K/A, ± , - K/A, -, - - ± - - - - + - - - - - - ± Shigella boydii K/A, -, - K/A, -, - - ± - - - - + - - - ± ± - ± Shigella sonnei K/A, -, - K/A, -, - - - + - - - + - - - - + - ± Salmonella typhi K/A, -, - K/K, -, ± + - - - - - + - ± - - - + - Salmonella enteritidis K/A, +, + K/K-N, -, - + - + ± - - + - + - - + + ± Salmonella cholerasuis K/A, +, ± K/K, -, + + - + ± - - + - + - - + + + Arizona hinshawii K/A, +, + K/K-N, ± + - + + - - + - - - + + + ± Citrobaccter freundii A-K/A, +, ± K/A, +, ± + - ± + ± - + - + ± - ± - ± Citrobacter diversus A-K/A, +, - K/A, -, - + + + + ± ± + - + + + + - ± Citrobacter analenaticus A-K/A, +, - K/A, +, - + + + + - ± + + + + - + - ± Proteus vulgaris A-K/A, ±, + R/A, -, - + + - + + - + - + - ± - - - Proteus mirabilis A-K/A, ±, + R/A, -, - + - + + ± - + ± + - - + - - Morganella morganii K/A, ±, - K-R/A, -, - ± + + - + - + - + - - + - - Providencia rettgeri K/A, ±, - R/A, -, - + + - + + - + - - - - - - - Providencia alcalifacions K/A, ±, - R/A, -, - + + - + - - + - ± - - - - - Providencia stuarti K/A, -, - R/A, -, - ± + - + ± - + - ± - - - - - Klebsiella pneumoniae A/A, +, - K/N, ±, - - - - ± + + - + - + + - + - Klebsiella ozanae A/A, +, - K/K-N, ±, - - - - ± - - - - - + - - + - Klebsiella rhinoescleromatis A/A, +, - K/A, -, - - - - - - - - - - - - - - - Klebsiella oxycota A/A, +, - K/K-N, +, - - + - ± - - NR NR - + + - + - Hafnia alvei A-K/A, ±, - K/K-N, ±, - + - + ± - ± + ± ± + + + + - Enterobacter aurogenes A/A, +, - K, K-N, -, - + - + + - - - + + ± + + + - Enterobacter cloacae A-K/A, +, - K/A, ±, - + - + + ± ± - + + + + + - + Enterobacter agglomerans A-K/A, ±, - K/A, ±, - ± ± - ± + ± ± ± + ± + - - - Enterobacter zakazabii A/A, +, - K/A, +, - + ± + + - ± ± + + + + - - + Enterobacter gargoviae A/A, +, - K/K-A, +, - + - + + + - ± + + + + - + - Serratia marcescens A-K/A, ±, - K/K-N, -, - + - + + ± - ± + - - + + + - Serratia liquefaciens A-K/A, ±, - K/K-N, -, - + - + + ± - ± ± + - + + + - Serratia rubidea A/A, ±, - K/K-N, -, - ± - - + ± ± ± ± + + + - + - Edwarsiella tarda K/A, +, + K/K-N, -, -