Guía Micro 2010-II

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
Mg EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD

LIMA – PERÚ
2010


PROLOGO

La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, está empeñada en realizar importantes
innovaciones en la concepción y práctica educativa con el propósito de brindar a sus
alumnos una formación profesional más competitiva, que haga posible su ingreso
con éxito al mundo laboral, desempeñándose con eficacia y eficiencia en las
funciones que les tocará asumir.

El marco referencial está dado por los cambios significativos de la sociedad
contemporánea, expresados en la globalización y los nuevos paradigmas del
conocimiento, de la educación y la pedagogía así como los retos del mundo laboral.

Uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye el MANUAL DE
PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA el cual ha sido concebido como un material
educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y
destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como
un material de lectura independiente, sirve de información y recreación, desempeña
un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar
conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar
destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de
conocimientos.

El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y
está organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiología Generalidades, Unidad II:
Microbiología Aplicada comprende: Microbiología Clínica, Microbiología Alimentaria,
Microbiología en la Industria Farmacéutica y Cosmética y de un Trabajo de Campo.

Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para
una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada
microorganismo en estudio. Además debe realizar diagramas de flujo de lo
observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de
práctica.

El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tener
los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.

Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
DOCENTE DE MICROBIOLOGÍA

1 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA


INDICE

PRÓLOGO 01

INDICE 02

INTRODUCCIÓN 04

INSTRUCCIONES GENERALES 06

MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS A LAS PRÁCTICAS 08

SISTEMA DE EVALUACIÓN 09

PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 10

UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES 12

PRACTICA N°01

Bioseguridad, Toma de Muestra y Acondicionamiento de Materiales. 13

PRACTICA N°02

Métodos de Esterilización y Desinfección (Antisépticos y Desinfectantes). 20

PRACTICA N°03

Medios de cultivo: Preparación de Medios de Cultivo. 32

PRACTICA N°04

Coloración Gram y Coloración de Bacterias Ácido Alcohol Resistentes. 39

PRACTICA N°05

Análisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano. 59

PRACTICA N°06

Metabolismo Bacteriano. 70



REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 79

ANEXO I: Flora Microbiana del Cuerpo Humano Normal 80

ANEXO II: Fundamentos e Interpretación de Agares y Caldos 83



INTRODUCCIÓN

La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos
microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos
(ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son
considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una
sola célula, es decir unicelulares, así como aquellos que forman agregados celulares
en los cuales todas las células son equivalentes. Los microorganismos pueden ser
Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o
Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los
virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando).

El Químico Farmacéutico y Bioquímico, es el profesional universitario de las Ciencias
Médicas con formación científica, tecnológica y humanística, con capacidad
gerencial, ejecutiva y de liderazgo. Así mismo altamente capacitado para poder
ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacéutica e Industria
Cosmética siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Análisis
Clínicos y Bioquímicos ejerciendo la Microbiología Clínica y del Laboratorio de
Bromatología realizando los Controles Microbiológicos a los Alimentos.

Hoy en día el Profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico es el profesional
responsable de la producción de los medicamentos y de los cosméticos de calidad,
seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiológico se considera
de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones
necesarias para la multiplicación de microorganismos capaces de deteriorar al
producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor.

El cuidado de los alimentos y la industrialización de los mismos se ha convertido en
una ciencia y cada vez más se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Día
a día surgen nuevas técnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos
conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de
métodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para
lograr este objetivo el Químico Farmacéutico y Bioquímico, realiza los Controles
Microbiológicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los
alimentos.



Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de
salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los
costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando
esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados
a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en
evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante
contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el
diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente.

El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro será el
profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico, quien con los conocimientos
presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con
criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de
una Industria Farmacéutica ó Cosmética, como en un Laboratorio Clínico
Microbiológico ó un Laboratorio Bromatológico.



INSTRUCCIONES GENERALES

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

PRINCIPIOS GENERALES

1. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de
los locales en que se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo
2,3,4.

2. En la zona de trabajo del laboratorio o aula de prácticas no se permitirá al
personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosméticos.

3. No pipetear con la boca.

4. Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier
material que no tenga ninguna relación con el trabajo.

5. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar la práctica y en
caso derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas.

6. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarán las manos después de
haber manipulado material infeccioso, así como al abandonar el
laboratorio.

7. Todos los procedimientos de siembra se practicarán de manera que no se
produzca la formación de aerosoles.

8. En el laboratorio se utilizarán obligatoriamente: mandiles, batas, uniformes
u otras prendas apropiadas, esta no se llevará fuera del laboratorio.

9. Utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminación como
sangre, material infeccioso o productos infectados.

10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales
a material infeccioso se notificarán inmediatamente al profesor.



RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCÓPIO

En microbiología el manejo del microscopio es de gran ayuda para el
reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su
correcto manejo.

Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersión, en las
cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo – portaobjetos, el
condensador próximo a la platina y el diafragma abierto para permitir una buena
iluminación. Antes y después de su uso limpie los objetivos con papel para lentes.

DE CÓMO MANIPULAR LOS CULTIVOS Y EL MATERIAL CONTAMINADO

- Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol.
- Nunca dejar tubos ni placas destapadas.
- Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el
agua de condensación la cual puede estar contaminada.
- Mantener los tubos con caldo en posición vertical para evitar que se
mojen los tapones.
- Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y
después de efectuarse el trabajo. No dejar el tapón del tubo sobre la
mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se
contaminen.
- Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente después de
usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el
caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito
de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar asas sobre la mesa
de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre
hacia arriba.
- Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo
bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas
exclusivamente por su extremo posterior, desenvolviéndolas en el
momento de usarlas. No quitar el algodón que llevan, por ser un elemento
de protección para el que la usa. Emplear micropipetas para realizar la
succión. No pipetear con la boca
- Eliminar pipetas, láminas y todo el material contaminado en un recipiente
con solución desinfectante.
- En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con
materiales infectante, contaminación del mandil o de la mesa, etc.
Durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.



DE CÓMO TERMINAR EL TRABAJO DE PRACTICA

1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones:
nombres ó iniciales de los estudiantes, nombre del microorganismo, grupo
de práctica y fecha de siembra.
2. En caso de las placas, todas deben incubarse invertidas a menos que sean
dadas instrucciones contrarias por el profesor.
3. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en gradillas de metal.
4. Los alumnos se responsabilizarán de colocar estos cultivos en estufas a
37° por 24 horas
C

TERMINADA LA PRACTICA, AL FINALIZAR EL TRABAJO

1. Limpiar la mesa de trabajo con algodón embebido en desinfectante.
2. Comprobar que las llaves de gas estén cerradas.
3. Lavarse prolijamente las manos con jabón germicida.
4. Se llevará un cuaderno de laboratorio donde se apuntará todos los
diagramas de flujo.

MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS PARA LAS PRACTICAS

- Dos pliegos de papel kraft (Por alumno).
- Un asa de siembra (Por alumno).
- Aguja de siembra (03 Unidades) (Por alumno).
- Papel Toalla y Encendedor a Gas (Por grupo de práctica).
- Jabón Germicida (Por Grupo de Practica).
- Desinfectante para limpiar las mesas trabajo (Por Grupo de Práctica).
- Plumón Marcador (Por alumno).
- Guantes para cada laboratorio (Por alumno).
- Mascarilla para cada laboratorio (Por alumno).
- Gorro para cada laboratorio (Por alumno).
- Mandil blanco (Por alumno).
- Baja - lengua (04 Unidades) (Por alumno).
- Torundas (04 Unidades) (Por alumno).
- Algodón industrial (No hidrófilo 500 gramos (Por grupo de práctica).
- Un rollo de pavilo (Por grupo de práctica).



SISTEMA DE EVALUACIÓN

Habrá tres evaluaciones como se describe a continuación:

1. La Primera Evaluación es Escrita después de la sexta práctica de Laboratorio.

2. La Segunda Evaluación es Práctica, al finalizar las prácticas programadas.
Comprenderá de un trabajo de campo y la elaboración de un Protocolo de
Análisis Microbiológico; y

3. La Tercera Evaluación es la exposición de sus respectivos resultados. Los
temas del trabajo de campo y el orden de las exposiciones son las siguientes:

a. Microbiología Clínica: Coprocultivo y Antibiograma.
b. Microbiología Clínica: Urocultivo y Antibiograma.
c. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de productos
lácteos Ejemplo: Leche, queso, etc.
d. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de Salsas Ejemplo:
Mayonesa, tomate, Mostaza, etc.
e. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética:
Monitoreo de Ambiente, Superficies y Personal. Ejemplo: Laboratorio
N°06 de la Facultad, etc.
f. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética: Análisis
Microbiológico de Envases. Ejemplo: Cápsulas, Tapas, Potes, Frascos,
etc.

PONDERACIÓN DE LAS EVALUACIONES

1. Primera Evaluación 1A
2. Segunda Evaluación: Protocolo de Análisis Microbiológico 1B
3. Tercera Evaluación: Exposición de los Resultados 1C

PROMEDIO FINAL = 1A + 1B + 1C
3

TIPO DE CALIFICACIÓN: La calificación es vigesimal, de cero a veinte.



PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

PROTOCOLO DE ANÁLISIS DE ENVASES O EMPAQUE

PROTOCOLO N°

CÓDIGO DE ENVASE: ----------------------------------------------------
FORMA: ----------------------------------------------------
LOTE: ----------------------------------------------------
FECHA DE ANÁLISIS: ----------------------------------------------------

ENSAYO ESPECIFICACIONES RESULTADOS TÉCNICA ANALÍTICA

ENSAYO TÉCNICA
ESPECIFICACIONES RESULTADOS
MICROBIOLÓGICO ANALÍTICA

OBSERVACIONES: -------------------------------------------------------------------------------------

FECHA: -----------------------------------------------------------------------------------------------------

ANALISTA JEFE DE CONTROL DE CALIDAD



CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES

AREA: ________________ N°ANALISIS: ____________

MAPA DE PLAQUEO

A1

A2

Puerta de Ingreso

Leyenda:

A1: Placa en el Piso
A2: Placa sobre la mesa o equipo

FECHA: _____________________
RESULTADOS: ___________________________________________________
OBSERVACIONES:___________________________________________________
___________________________________________________________________

REALIZADO POR: ______________ VERIFICADO POR: _____________

Especificaciones: Máximo 500 microorganismos viables permitidos



UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES



PRACTICA N°01
BIOSEGURIDAD, TOMA DE MUESTRA Y ACONDICIONAMIENTO DE
MATERIALES.

Para trabajar en un laboratorio de Microbiología se requieren técnicas específicas y
diferentes a las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en
condiciones asépticas: el material e instrumental que se va a utilizar, así como los
medios de cultivo, deben ser sometidos con algunas excepciones (Caldo Selenito,
Agar XLD) a procedimientos de esterilización, eliminándose de ellos posibles
microorganismos contaminantes. Para mantener las condiciones de esterilidad,
debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un
mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse
utilizando cultivos axénicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola
especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente porque
los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua,
en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las
contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:

• El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles.
• Los tubos o matraces deben ser tapados con algodón hidrófobo estéril o
cubiertos con un capuchón metálico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas Petri deben mantenerse tapadas
mientras no se estén manipulando.
• Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con
los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de
siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.

MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO

ASA E HILO DE SIEMBRA: Antes de su utilización, se esterilizan sometiéndolos a
la acción de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente,
luego se flameará la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse
de nuevo para eliminar los microorganismos que quedan en ellos.

PIPETAS GRADUADAS DE VIDRIO O PLÁSTICO

Se suministran ya estériles a los alumnos, dentro de estuches metálicos o bien
empaquetadas de forma individual (envueltas en papel Kraft o aluminio para
mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del
mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse
ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodón en la boquilla, que
actúa como filtro, para evitar la contaminación y para impedir la llegada de líquido al
sistema de succión. Dicho algodón debe permanecer en la boquilla durante el uso.
Bajo ningún concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiológica.
Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan propipetas o bombillas
que permitan controlar la succión y el dispensado de los líquidos o los dispositivos
semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un
émbolo. También se pueden utilizar micropipetas o pipetas automáticas.



TUBOS DE ENSAYO CON CULTIVOS PROBLEMA Y PLACAS PETRI

Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello sólo los dedos que
quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del
tubo, se toma una pequeña muestra del cultivo con asa de siembra estéril,
previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el
tapón. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es líquido, se debe
agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a
sedimentar. En el caso de que el medio sea sólido (tubos de agar inclinado y placas
Petri), la muestra se obtendrá rozando ligeramente con el asa la zona en la que se
aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el
menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones.

INSTRUMENTOS PARA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

A.- Asa de Siembra C.- Pipeta de Pasteur.
B.- Hilo de Siembra D.- Cayado.

PIPETAS

A.- Pipeta automática de 0,2 - 1mL. C-- Pipeta de vidrio de 10mL.
B.- Pipeta automática de 0,02 - 0,2mL. D.- Pipeta de vidrio de 1mL.

MANEJO DEL ASA
DE SIEMBRA DURANTE
UNA INOCULACIÓN



PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD

La BIOSEGURIDAD es una combinación de procedimientos técnicos uso de
equipos, materiales e infraestructura que se debe practicar diariamente y que no
debe olvidar el personal de laboratorio.

Los procedimientos de BIOSEGURIDAD tienen por finalidad:

- PROTEGER: Al personal de laboratorio contra la exposición innecesaria e
injustificada a microorganismos infecciosos.
- EVITAR: La contaminación de las muestras que puede echar a perder el
trabajo del laboratorista con resultados falsos.
- MANTENER (Contención): Los microorganismos infecciosos dentro del
ambiente del laboratorio.

MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGOS

Es IMPORTANTE conocer los tipos de microorganismos infectantes con los que
trabajamos, para tomar las medidas de BIOSEGURIDAD respectivas.

- La capacidad infectante del microorganismo.
- Los modos de transmisión (por Ej: aerosoles).
- Si son prevenibles por medio de inmunización (vacuna contra la Hepatitis B,
Fiebre amarilla, etc.).
- Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo
infectante (por ejemplo: uso de Antibióticos).

Alerta de Riesgo
Biológico
Alerta de Ondas Alerta de Peligro
Radiales Tóxico



MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

GRUPO DE RIESGO MICROORGANISMO INFECTANTE
RIESGO 1
Agrupa microorganismos que tienen escaso
o nulo riesgo de provocar enfermedades Ej: Plasmodium, helmintos intestinales, etc.
humanas.
RIESGO 2
Agrupa microorganismos que pueden
provocar enfermedades humanas de riesgo
Ej: Entamoeba histolytica, Leishmania,
moderado. Si provoca una infección al
Salmonella typhi, Staphylococcus, etc.
personal de laboratorio, ésta tiene
tratamiento y cura.
RIESGO 3
Agrupa microorganismos que pueden
Ej: Mycobacterium tuberculosis, Taenia
provocar enfermedades humanas graves.
solium, Yersinia pestis, etc.
Tiene tratamiento, cura y se limita.
RIESGO 4
Agrupa microorganismos que provocan
Ej: Virus de la Inmunodeficiencia humana
enfermedades graves en el ser humano. No
(VIH), etc.
hay tratamiento para su cura.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

Grupo de
Nivel de Ejemplos de Equipos de
Microorganismo
Bioseguridad Laboratorio Seguridad
Infectante
Laboratorio de Ninguna.
Laboratorio Básico Enseñanza.
RIESGO 1 Sólo mesas de
Nivel de Bioseguridad 1. Laboratorio Laboratorio al
Universitario descubierto.
Mesa de
Servicio de Atención
Laboratorio al
Laboratorio Básico. Primaria de Salud.
descubierto o
RIESGO 2
Cámara de
Nivel de Bioseguridad 2. Hospital de nivel
Seguridad
primario, diagnóstico.
Biológica.
Cámara de
Seguridad
Laboratorio de
Biológica o
Contención. Diagnóstico
RIESGO 3 Contención
Especial.
Primaria para
Nivel de Bioseguridad 3.
todas las
actividades.
Cámara de
Laboratorio de Seguridad
Contención Máxima. Unidades Patógenas Biológica Clase III
RIESGO 4
Peligrosas. o Ropa de Presión
Nivel de Bioseguridad 4. Especial, Aire
Filtrado.



LABORATORIOS BÁSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2

- Las Reglas Más Importantes:
- Del Ambiente:
- Del Personal:



TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA



Recepción de los pacientes

- Nombres y apellidos
- Tipo de muestra
- Tipo de análisis

Recepción de la orden de análisis

- Toma de muestra
- Orina, sangre, otros

Preparación del paciente para la
toma de muestra

Colocar la ligadura, limpiar la zona de
aplicación, indicar al paciente que
haga puño. Introducir la aguja

Aspirar, retirando suavemente el
émbolo. El ingreso de sangre a la
jeringa nos indicará que estamos en
vena.



PRACTICA N°02
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

En Microbiología se define Esterilización como el proceso por el que se destruye o
elimina de un objeto o de una sustancia todos los microorganismos vivos: virus,
bacterias, esporas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de
esterilidad.

OBJETIVO

Conocer la importancia de la Esterilización y Desinfección familiarizarse con el
manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.

MATERIAL

Mechero Bunsen, horno, autoclaves, equipos de filtración y materiales a tratar.

TÉCNICAS

El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el
calor, entre otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El
calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor
húmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se
requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos
a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los
puentes de hidrógeno responsables de la estructura tridimensional de las proteínas,
haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

En el laboratorio clínico, la esterilización y la desinfección se logra con los siguientes
métodos:

- Calor húmedo: Vapor saturado a presión, olla de presión, ebullición, vapor
fluente

- Calor seco: Horno de aire caliente, flameado.

- Desinfección intensiva por inmersión en productos químicos: Lejía.

- Desinfección por frotación con un producto químico.

- Filtración.

MECHERO DE
BUNSEN



CALOR SECO

FLAMEADO

Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra,
pinzas, espátulas, etc. Consiste en someter
directamente a la acción de la llama de un mechero
Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar.
Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin
embargo no se puede aplicar a objetos
termolábiles.

ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE

Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se
van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez
esterilizados, en el interior de un horno. Este procedimiento se utiliza para esterilizar
material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales
termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy
elevadas (180ºC durante 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para
esterilizar líquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC
comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por encima
del punto de ebullición del agua a presión atmosférica, y a esta temperatura las
endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras
en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología puede
implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la
fuerte evaporación sufrida.

CALOR HUMEDO:

EBULLICIÓN: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada
durante 10 – 20 minutos va a destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a
tratamientos prolongados.



Se podría utilizar el baño María o baño de agua hirviente
(sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando
no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se
dispone de otros métodos mejores, tanto para material
(pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de
cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.

VAPOR FLUENTE

Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se
puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de sus
propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión
atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el
proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los
intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC)
durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero
no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la
muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán
destruidas en los siguientes ciclos. Este método de esterilización se denomina
también Esterilización Fraccionada o Tindalización.

VAPOR SATURADO A PRESIÓN

La esterilización por esta técnica utiliza vapor de
agua saturado que se somete a una atmósfera extra
de presión sobre la presión atmosférica normal,
elevándose con ello el punto de ebullición del agua
de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción
de todos los microorganismos en un tiempo de 15
minutos. Esta temperatura es también necesaria
para la destrucción de las endosporas bacterianas,
que presentan una alta resistencia térmica y que
pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC
durante horas. El vapor de agua difunde por ósmosis
a través de las membranas de las esporas,
coagulando su protoplasma, fenómeno que se
acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión.



Esta técnica de esterilización requiere el uso del Autoclave.

FILTRACIÓN

Es el paso de un líquido o gas a través de un material
filtrante, con poros lo suficientemente pequeños como
para retener células microbianas. Los filtros que se
utilizan en la actualidad son, generalmente, los
denominados filtros de membrana y están integrados por
pequeñas piezas de material sintético, generalmente
Acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener
poros con tamaños de 0,22 y 0,45 µm, diseñados para
retener bacterias. La acción combinada de los poros, la
trama del filtro y la naturaleza química del material
utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido.

ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada
limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material
reciclable y la eliminación del material desechable. Todos los objetos sucios o
contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El
material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material
recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución
desinfectante, como por ejemplo una solución diluida de lejía, en la que
permanecerá antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados
contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgánica (procedente
de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes físicos
o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse
la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por
ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos
más largos de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material
limpio.



Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos,
equipos y material que sean estables al calor, así como de material desechable. A
tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el
autoclave sometiéndolos a la acción del vapor de agua a una atmósfera de
sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de
30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para
eliminar toda materia extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o
utilizando detergentes, mezcla sulfocrómica o cualquier otro procedimiento enérgico,
tanto mecánico como químico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir
y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas,
debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodón
que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados
(portaobjetos, pipetas, etc), después de lavados, se sumergen en una mezcla
sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se
dejan escurrir.

Los portas se secan con un paño de hilo limpio, procurando que no queden hilazas
sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, según las
condiciones del material, durante un tiempo variable con una solución que puede ser
de ácido clorhídrico, nítrico o mezcla sulfocrómica. El resto del material (tubos de
plástico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como
hipoclorito sódico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a
concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.



MANEJO DEL AUTOCLAVE

PROCEDIMIENTO:

− Cerciorarse que el agua desionizada o
destilada cubra la rejilla (aproximadamente 6
litros de agua).

Colocar cuidadosamente en la bandeja el
material a autoclavar (para el caso de placas
colocarlas como si fuera a plaquear y para el
caso de tubos se pueden colocar con sus
gradillas); si es necesario utilizar las dos
bandejas.

− Luego colocar encima de la bandeja la cubierta
protectora.

− Bajar la tapa y colocar todas las manoplas,
después realizar en forma simultanea el ajuste
de las mismas, en forma diagonal o en (cruz).

− Encender el equipo (llave principal – pared)
“ON” y posteriormente girar la perilla
AUTOMATICO en “HI” y la perilla RELOJ
hasta 50 minutos.

− Cuando el equipo se encuentre aproximadamente entre 90° C – 100° C
cerciorarse si por la espita ya no sale aire y que en su lugar salga “VAPOR” se
puede corroborar colocando un pedazo de papel a la salida de la espita si se
humedece entonces cerrar la espita.

− Simultáneamente el equipo empezará a elevar la presión y cuando se
encuentre entre 15 a 17 libras de presión, entonces girar la perilla
AUTOMÁTICO a “3” para mantener la presión constante a partir de ese
momento controlar 15 minutos (121°C por 15 libras por 15 minutos).

− Terminado el equipo apagarlo y girar la perilla AUTOMÁTICO en “OFF” y la
perilla RELOJ “O” y finalmente la llave principal – pared “OFF”.

− Esperar que la presión comience a disminuir por si sola y cuando llegue a
“CERO” entonces proceder a abrir por completo la llave de la espita,
posteriormente aflojar las manoplas y retirarlas: como precaución mantenerse
atrás del autoclave para la apertura de la tapa (cuidándose del vapor).

− Retirar el material autoclavado.



DESINFECCIÓN INTENSIVA POR INMERSIÓN EN PRODUCTOS QUÍMICOS

DESINFECTANTES QUÍMICOS: Las fórmulas de los
productos desinfectantes presentan grandes diferencias.
Es esencial, por lo tanto, que las diluciones se hagan de
acuerdo con lo recomendado por los fabricantes.

HIPOCLORITO DE SODIO: Es un agente químico barato
y fácil de adquirir, mata bacterias y virus. Tiene dos
inconvenientes importantes: se deteriora y es corrosivo.

CLORAMINA: Es más estable que el hipoclorito de sodio.
Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el
calor excesivo. Puede obtenerse en forma de polvo o de
tabletas.

DESINFECCIÓN POR FROTACIÓN CON UN PRODUCTO QUÍMICO

La frotación con un desinfectante adecuado es un procedimiento aceptable en el
caso de superficies (mesas, etc.) y de salpicaduras de sangre. Cuando éstas son
visibles, se empezará por derramar desinfectante sobre la superficie; luego se
retirará la mezcla de sangre y desinfectante. El hipoclorito de sodio (lejía) es el
desinfectante más indicado.

AGENTES QUÍMICOS

La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan:

- Concentración: Varía con el tipo de agente y de
microorganismo, pues una misma concentración del agente
puede producir un efecto diferente en distintos
microorganismos.

- Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un
agente en la misma forma, por lo que no todos los
microorganismos mueren al mismo tiempo.

- PH: Afecta tanto a los microorganismos como a los
agentes químicos.

Alcoholes
Yodo
Antisépticos Agentes catiónicos,
aniónicos y anfóteros
Órgano mercuriales



Cloro y compuestos
clorados
Desinfectantes y/o Aldehídos
Esterilizantes Oxido de etileno
Compuestos fenólicos
Ácidos y álcalis

CLASIFICACION DE DESINFECTANTES

Basados en las diferencias existentes entre los desinfectantes en uso, se estableció
tres niveles de acción microbicida, cuyo reconocimiento servirá de fundamento para
establecer los procedimientos de desinfección efectiva en cada laboratorio.

Los términos que se define son: alto nivel, nivel intermedio y bajo nivel de
desinfección.

A. DESINFECCIÓN DE ALTO NIVEL

Algunos instrumentos o materiales no resisten la exposición al calor y es
necesario someterlos a desinfección utilizando agentes químicos. Los
desinfectantes de alto nivel se diferencian de los demás por su capacidad
esporocida, siendo su principal desventaja el largo tiempo de exposición que
debe tener el material (hasta 24 horas). Este método requiere de técnicas de
limpieza rigurosa para reducir al máximo la contaminación microbiana de los
instrumentos y eliminar residuos orgánicos que inactivan los desinfectantes.

B. DESINFECCIÓN DE NIVEL INTERMEDIO

Los desinfectantes de nivel intermedio no son capaces de destruir las esporas
bacterianas, pero tienen la capacidad de inactivar el bacilo tuberculoso, que
es más resistente a los germicidas en solución acuosa que las bacterias
vegetativas comunes. También son efectivos contra los hongos (esporas
asexuadas, pero no siempre clamidosporas secas o esporas sexudas) y
contra los virus con cubierta lípidica de tamaño mediano y algunos virus sin
cubierta lípidica de tamaño pequeño.

C. DESINFECCIÓN DE BAJO NIVEL

Los desinfectantes de bajo nivel son aquellos que no tienen capacidad para
actuar sobre las esporas bacterianas, el Mycobacterium tuberculosis, o los
virus no lipídicos de tamaño pequeño. Pueden ser útiles en la práctica por
tener una acción rápida sobre las formas vegetativas comunes de las
bacterias y varios tipos de hongos, así como sobre los virus de tamaño
mediano y con cubierta lipídica.

Algunos de estos desinfectantes, a mayor concentración, pueden elevar su
acción microbicida al nivel intermedio, como los yodóforos y fenoles. En
cambió, otros no tienen esta propiedad.



CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS DESINFECTANTES

CLASE CARACTERÍSTICAS
Glutaraldehído Solución Esporocida, bactericida, tuberculicida, tóxico, solución
Acuosa activada activada inestable. Fecha de expiración 14 días desde
su activación.

Peróxido de Hidrógeno Esporocida, sol. En uso estable hasta 6 semanas,
estabilizado tóxico para ojos y vía oral, menos tóxico para piel.
Escasa inactivación por materia orgánica.

Formaldehído + Alcohol Esporocida, tóxico, volátil. Emanaciones nocivas.

Yodo + Alcohol Acción rápida, corrosivo, inflamable. Irrita la piel,
mancha

Alcohol Acción microbicida rápida, excepto esporas
bacterianas y algunos virus resistentes. Volátil,
inflamable. Seca e irrita la piel.

Compuestos de Cloro Acción rápida, inactivado por materia orgánica.
Corrosivo, irrita la piel.

Compuestos de Fenol Estable, corrosivo, irritante para la piel. Escasa
inactivación por materia orgánica.

Yodóforos Algo inestables, escasa irritación de la piel. Corrosivo.

Poco irritante, inactivado por jabón y compuestos
Compuestos Amonio aniónicos, absorbido por telas. Soluciones diluidas o
Cuaternario antiguas permiten el crecimiento de Bacterias Gram
Negativas.

Poco irritante, muy inactivadas por materia orgánica,
Compuestos Mercuriales débilmente bactericidas.



NIVEL DE AGENTES QUÍMICOS

Clase Concentración Nivel de Actividad
Glutaraldehído Sol. acuosa 2% Alto
Peróxido de hidrógeno 6 – 10% Alto
Formaldehído + Alcohol 8% + 70% Alto
Formaldehído Sol. Acuosa 3 – 8% Alto a Inter.
Yodo + Alcohol 0.5 – 1% + 70% Intermedio
Alcohol 70% Intermedio
Compuestos de Cloro 0.1% Intermedio
Compuestos de Fenol 0.5 – 3% Inter. a Bajo
Yodo, Sol. Acuosa 1% Intermedio
Yodóforos 0.007 – 0.015%** Intermedio
Compuestos Amonio Cuaternario 0.1 – 0.2% Bajo
Hexaclorofeno 1% Bajo
Compuestos Mercuriales 0.1% - 0.2% Bajo

LAVADO DE MANOS

PROCEDIMIENTO CORRECTO

1. Acercarse al lavatorio, sin permitir que el
uniforme toque el lavadero durante el método
de lavado.
2. Quítese los anillos, reloj, pulsera o
acostumbrarse a usar bien arriba de la
muñeca.
3. Abrir la llave del agua, regular el flujo (para
que no se disperse) y temperatura (tibia).
4. Mójese las manos, tomar la pastilla de jabón,
enjabonarse bajo el chorro de agua
frotándose vigorosamente con el jabón las
manos, muñecas, hasta la parte media del
antebrazo; manteniendo las manos bajas en
relación al antebrazo y codo, con las manos
enjabonadas lavar la llave del agua.
5. Enjuagar el jabón y guardar sin tocar la
jabonera.
6. Por medio del frotamiento enérgico produzca espuma, realizar frotamiento
firme y movimientos circulares de: antebrazo, muñeca, palmas, dorso, cada
dedo, cada área interdigital. Limpiar las uñas, mínimo una vez al día antes de
comenzar a trabajar.
7. Enjuagarse en sentido distal: antebrazo, muñeca y manos; manteniendo las
manos por debajo del antebrazo. Enjuagar la llave del caño al tocarla.



8. Repetir los pasos 4, 5 y 6 (volver a repetir según el
grado de contaminación).

9. Enjuáguese en sentido proximal
individualmente dejando correr el agua
de los dedos a la muñeca y antebrazo,
quedando con la mano y antebrazo por
encima del codo. Con una toallita se
secará con golpecitos suaves las manos
muñecas y antebrazos.

10. Cerrar la llave del caño.



CONCEPTOS BÁSICOS

Asepsia: Ausencia de microorganismos patógenos.

Microorganismos Patógenos: Es causante de enfermedad.

Contaminación: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo,
prendas de vestir o artículos sucios (no constituye infección).

Infección: penetración y desarrollo o multiplicación de un agente infecciosos en el
organismo de una persona o animal.

Enfermedad infecciosa: Enfermedad clínicamente manifiesta del hombre
resultados de una infección.

Asepsia médica: Normas ideadas para reducir el número de transmisión de
microorganismos patógenos, ej: lavado de manos.

Desinfección: proceso por el que se da muerte a microorganismos patógenos pero
no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte).

Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfección, ej: alcohol yodado,
sablón.

Antisepsia: Proceso de lisis o inhibición del crecimiento bacteriano sobre la
superficie de tejidos vivos.

Antiséptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es
inocuo en las personas ej: alcohol 70° agua oxigen ada.
,

Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una
especie de cápsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que más tarde
en situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej: Clostridium tetan, causante del
tétanos.

Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en
superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente
se usa agua y detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir
el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la
destrucción de éstos.

Bactericida: Sustancia química que elimina todas las bacterias, patógenas y no
patógenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas.

Bacteriostático: Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero
no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre
bactericida y bacteriostático únicamente depende de las condiciones de aplicación:
tiempo, temperatura, pH.



PRACTICA N°03
MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores
de crecimiento y otros componentes, preparados en el
laboratorio, que suministran los compuestos necesarios
para el desarrollo de los microorganismos. Algunas
bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi
cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan
medios especiales y existen algunas que no pueden crecer
en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los
distintos tipos de medios de cultivo varían según las
necesidades de los microorganismos objeto de estudio,
pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:

- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del
microorganismo que se siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
- Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos
categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura,
el pH y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentran
el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el
oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento.
- Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y
condiciones adecuadas.

Requerimientos para el desarrollo
bacteriano: Las bacterias pueden ser divididas
en autótrofas y heterótrofos. Las primeras
comprenden las bacterias del suelo y el agua
que obtienen carbono y nitrógeno de la
atmósfera y de la materia inorgánica simple. Las
bacterias heterótrofas requieren compuestos
orgánicos más complejos como fuente de
carbono y nitrógeno, así como proteínas o sus
derivados, también requieren carbohidratos y
grasas. Este último grupo de organismos es el
más importante en bacteriología médica.

- Proteínas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran
disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con
enzimas pépticas, consisten en polipéptidos, dipéptido y aminoácidos.
- Carbohidratos: Suministran carbono para las síntesis, y además su
fermentación libera energía utilizable en el metabolismo.



- Factores accesorios de crecimiento: Son
también requeridos por algunas bacterias.
Entre ellos están las vitaminas del complejo
B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina,
botina). Estas sustancias son necesarias y
las bacterias no las pueden sintetizar. Otros
factores necesarios para algunas bacterias
son obtenidos de nutrimentos más
complejos, como el suero, la sangre la
yema del huevo, etc.
- Sales minerales: Elementos como potasio,
sodio, calcio, etc. También son requeridos
por algunas bacterias en su desarrollo.
- Atmósfera: Microorganismos aerobios
obligados, anaerobios obligados,
anaerobios facultativos, etc.
- Presión osmótica: Las células pueden
encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en
soluciones hipertónicas, inversamente, se
rompen (plasmoptisis) por entrada de agua,
en las soluciones hipotónicas.
- Temperatura: Para la mayoría de bacterias patógenas del hombre la
temperatura óptima de crecimiento es de 37°C.
- Luz: La mayoría de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta
puede ser letal.
- Reacción: La mayoría de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente
alcalino (pH 7,2- 7,6).

OBJETIVOS

Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el
laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando
algunos sólo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden
clasificarse:

a) POR SU CONSISTENCIA:

1. Medios Líquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.



2. Medios Sólidos: Contienen nutrientes
disueltos en agua pero se les añade un
agente solidificante. El Agar es un
polisacárido complejo que se obtiene de
algas rodofíceas de origen marino
cuyas propiedades son de gran utilidad
en la preparación de medios de cultivo
sólidos: No es degradado
enzimáticamente por los
microorganismos (a excepción de
algunos microorganismos de ambientes
marinos), funde aproximadamente a
100ºC y permanece en estado líquido
mientras la temperatura no descienda
por debajo de 45-50ºC.

Además, una vez solidificado se puede
incubar a temperaturas elevadas sin
que se licúe. Generalmente el Agar se
añade, para solidificar un medio líquido,
en una concentración del 1,5%. Los
medios con Agar se envasan en tubo o
en placa de Petri.

3. Medios Semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la
concentración del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo
que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan,
por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos.

b) POR SU COMPOSICIÓN

1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el
crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos
los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de
cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradación
parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que
son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y minerales. Ejemplos
de dichos componentes son las peptonas o triptonas (proteínas animales
digeridas enzimáticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura.
Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares
pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa.
Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene
peptona y extracto de carne.



2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma
de productos químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones
conocidas. Así, un medio definido que permita el desarrollo de un
microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería contener
sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H,
glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y
cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los
productos químicos antes citados, en cantidades suficientes para el
crecimiento.

c) POR SU UTILIZACIÓN:

Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los
que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos
requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario
aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo
número y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un
número más elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que
ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva,
favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:

1. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el
crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los
demás. Algunos de estos medios contienen un
agente selectivo como antibióticos, productos
químicos, colorantes, etc.

Entre los agentes selectivos podemos citar el SS AGAR
cloruro sódico, que en concentración elevada
inhibe la mayoría de los microorganismos excepto
los microorganismos halotolerantes, como son los
estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el
crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse
al hierro de la porfirina del sistema citocromo,
permitiendo seleccionar los estreptococos, que
carecen de este sistema, así como otros Gram
positivos.
AMS
De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a
los que se añaden en selectivos para Salmonella ya que, además de inhibir a
los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben
también a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes,
como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas,
siendo también inhibidor para la mayoría de las bacterias intestinales excepto
para Salmonella.



Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el
aislamiento de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos
pueden serlo también por su pH, así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado
a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que
las bacterias.

2. Medios Diferenciales: Son aquellos
diseñados para distinguir unos
microorganismos de otros, a partir de
una población mixta, por la apariencia
distinta que toman sus colonias. Estos
medios de cultivo ponen de manifiesto
propiedades que un determinado tipo
de microorganismo posee. Por
ejemplo, los medios diferenciales
llevan incluido un indicador de pH, que
pone de manifiesto la degradación de
un nutriente específico (generalmente
un azúcar) por el cambio de color que
se origina cuando éste es
metabolizado, como en el caso del
medio CLED.
Agar Mac Conkey

Los medios diferenciales pueden ser
además selectivos, si se añaden agentes
que inhiben el crecimiento de determinados
microorganismos. En este caso va a ser
posible distinguir diferentes tipos
microbianos dentro del limitado grupo de
microorganismos que pueden crecer. Así, el
medio EMB de Levine es selectivo para las
bacterias Gram negativas por contener dos
colorantes, eosina y azul de metileno, que
inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas.
EMB

Es también un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan
la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. La formación de
ácidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie
de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como
ocurre en el caso de E. coli, las colonias presentan además un brillo metálico.
El Agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La
presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias
no entéricas; la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos
hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.



PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de medios de cultivo se ha simplificado
en gran medida por la comercialización de medios
deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se
encuentran ya mezclados en las debidas
proporciones, siendo sólo necesario la adición de la
cantidad correcta de agua destilada para disolver sus
componentes. Cuando se prepara un medio líquido se
debe disolver totalmente todos sus componentes en
agua destilada.

A continuación el caldo se envasa en los
recipientes adecuados (matraces o
tubos), tapando los mismos y
esterilizándolos. La preparación de un
medio sólido puede hacerse de dos
maneras: Preparar el caldo y añadir Agar
al 1,5% o bien utilizar un medio sólido
comercial. Independientemente de la
forma elegida para hacerlo, la
preparación de los medios de cultivo
sólidos requiere procedimientos
especiales, ya que el Agar es insoluble en
agua. Por ello, una vez añadida el agua,
se debe calentar la mezcla hasta 100ºC,
para permitir que el Agar se funda y
quede incorporado al resto de los
nutrientes disueltos. El medio fundido se
dispensa en tubos o matraces, que se
tapan y se esterilizan.

Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical,
si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al
solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor
superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de
cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en
placas vacías en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la
llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el
medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se
fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas.

Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o
antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo
previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En
todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservación de
los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible
conservarlos a 4ºC para retrasar su deshidratación.



PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO



PRACTICA N°04
COLORACIÓN GRAM Y COLORACIÓN BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL
RESISTENTES

La morfología de los microorganismos puede
examinarse de dos formas: observando
microorganismos vivos sin colorear (en
fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes.
Klebsiella pneumoniae

El examen en fresco de los microorganismos permite
conocer algunas de sus características (morfología, tamaño,
movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos
son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al
microscopio óptico normal cuando se encuentran
suspendidos en agua, de ahí que se utilicen colorantes para
incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de
esta forma hacerlos visibles. Los colorantes pueden
emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o
para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

El Colorante es aquella sustancia que tiene la
propiedad de comunicar color a otros cuerpos de
cualquier naturaleza. De acuerdo a su Origen los
colorantes pueden ser Naturales como por ejemplo
el carmín o Artificiales como el cristal violeta. De
acuerdo a su Composición Química los colorantes
pueden ser Básicos como la fucsina básica y
Ácidos como el anaranjado de metilo y Neutros
como el Wright o Giemsa.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después que
la célula haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante por sí mismo. Esta
sustancia se denomina Mordiente; un mordiente
habitual es el Lugol. El mordiente se combina con
un constituyente celular y lo altera de tal modo que
ahora sí podrá atacar el colorante.
Cristal Violeta

Carmín



EL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento óptico que
amplifica la imagen de un objeto pequeño
Actualmente existen dos tipos de
microscopios: el óptico y el electrónico.

MICROSCOPIO OPTICO

Los microscopios de este tipo generalmente
producen un aumento de 1000 veces el
tamaño original. El límite lo tienen en unas
2000 veces. Las lentes de un microscopio
óptico son el condensador, el objetivo y el
ocular. La luz que entra en el sistema debe
enfocarse sobre la preparación y para esto se
utiliza el condensador. Elevando o bajando el
condensador puede alterarse el plano del foco
de luz y elegirse una posición que consiga el
foco preciso. El objetivo es la lente situada
cerca del objeto que se observa. El aumento
primario del objeto es producido por la lente
objetivo y la imagen se transmite al ocular,
donde se realiza el aumento final. Los
microscopios que se usan normalmente en
microbiología están equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de
inmersión.



MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de
electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener
un poder de resolución muy elevado. La longitud de
onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003
nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 -
750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio
electrónico resolver objetos separados por una
distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de
uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un
millón de veces. A causa de la naturaleza de este
instrumento sólo pueden examinarse objetos muy
delgados; incluso una sola bacteria es demasiado
gruesa para ser observada directamente.

OBJETIVOS

- Ejecutar las técnicas básicas de coloración.
- Interpretar los procesos de coloración de las técnicas estudiadas.
- Observas diferentes formas, tamaños y agrupaciones que permitan los
microorganismos.

EXAMEN MICROSCÓPICO

OBJETIVO

- Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro.
- Estudiar su morfología y agrupación, apreciar las diferencias de tamaño entre
organismos procarióticos y eucarióticos y aprender a diferenciar el movimiento
browniano de la movilidad de los microorganismos.

TÉCNICA

- Para la observación de microorganismos sin teñir se realiza el montaje húmedo.
- Depositar una gota de la muestra tomada con asa de siembra previamente
flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos
presionando suavemente.
- Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la
cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando
el condensador. Un exceso de luz dificultará la observación de los
microorganismos, ya que poseen el mismo índice de refracción que el medio
circundante (el vidrio del portaobjetos y el líquido en el que se encuentran
suspendidos).
- Para reducir la evaporación de la muestra con el calor desprendido por el foco
luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la
operación rápidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con parafina.
- Observar la forma y el tamaño de los microorganismos.



- Describir su movilidad, diferenciando el
movimiento browniano, debido a la colisión
de los microorganismos con las moléculas
del líquido que los rodea, de la verdadera
movilidad. La movilidad se manifiesta por el
desplazamiento de los microorganismos a
grandes distancias y en una dirección
determinada, aunque a veces pueden
apreciarse rotaciones o giros. Los
desplazamientos cortos y sin sentido se
deben al movimiento browniano.

GRAFIQUE LO OBSERVADO

10 Aumento 40 Aumento

MÉTODOS DE COLORACIÓN

1. TINCIÓN SIMPLE: Aquella en la que
sólo se utiliza un colorante, que
generalmente tiñe a los
microorganismos. Este tipo de tinción
se denomina directa. Si el colorante
proporciona una coloración al fondo,
sin alterar el aspecto de las células,
que permanecen sin teñir, la tinción se
denomina negativa. La tinción simple
permite observar morfología celular,
tamaño y agrupación de los
microorganismos.

2. TINCIÓN DIFERENCIAL: Es aquella que emplea secuencialmente dos
colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en función de
diferencias en su estructura y composición química. La tinción de Gram y la
Ácido-Alcohol-Resistente, basadas en las propiedades de la pared celular
bacteriana, son las más utilizadas.



TINCIÓN GRAM

3. TINCIÓN ESTRUCTURAL: Se utiliza
para identificar y estudiar
determinadas estructuras que pueden
estar presentes en los
microorganismos. En las tinciones
estructurales se colorea únicamente
una parte de la célula. Se utilizan este
tipo de tinciones para poner en
evidencia la presencia de cápsulas,
endosporas, flagelos o inclusiones
(almidón, polifosfato, etc.). Tinción de Capsula

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA TODA COLORACIÓN

En la mayoría de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a
continuación:

- EXTENSIÓN: Realizar una extensión con el asa de siembra esterilizada, para
ello se toma una pequeña gota de cada uno de los cultivos y se extiende en
un portaobjeto limpio. Si el cultivo procede de un medio sólido, se coloca una
gota de agua o NaCl 0,9% en el portaobjeto y se mezcla con una pequeña
porción de la muestra hasta formar una suspensión homogénea,
extendiéndola con el fin de obtener una fina película. Posteriormente, se deja
secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe
eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden
distorsionarse las células.

TÉCNICA DE EXTENSIÓN DE UNA MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS



- FIJACIÓN: La fijación tiene como finalidad coagular el citosol de las células y
hacer que se adhieran al portaobjeto, siendo el calor el método más utilizado
para la fijación, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol
(metanol) u otros compuestos químicos. La fijación con calor se recomienda
cuando se trabaja con muestras de un cultivo sólido; en muestras obtenidas
de un cultivo líquido es mejor hacer la fijación con metanol ya que se retienen
en el portaobjetos un mayor número de células. Es necesario que la extensión
se haya secado antes de proceder a la fijación, por ello se debe esperar hasta
que el líquido de la misma se evapore. La fijación por calor se lleva a cabo
pasando varias veces la preparación seca a través de la llama de un
mechero, con la extensión hacia arriba. El calor desnaturaliza las proteínas y
suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso,
para evitar que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que
el portaobjeto se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado.

- COLORACIÓN O TINCIÓN: Para ello es necesario cubrir la preparación con
abundante colorante y dejarlo actuar durante algún tiempo. Pasado ese
tiempo, lavar con agua las preparaciones teñidas para eliminar el exceso de
colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del
portaobjeto, que se mantendrá inclinado durante este proceso. No se debe
dirigir el agua con demasiada fuerza sobre la preparación para no arrastrar la
muestra. Eliminar el exceso de agua del portaobjeto golpeándolo ligeramente
por el extremo; este proceso debe realizarse con cuidado. Permitir que se
seque la preparación, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien
dejándola secar al aire, aunque lleva más tiempo. Examinar la preparación al
microscopio, con el objetivo de inmersión (100x), colocando, previamente,
una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

TINCIÓN SIMPLE

OBJETIVO: Estudiar las características de los microorganismos en cultivo, es decir:
tamaño, forma y agrupación de las células.

TÉCNICA

- Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y
proceder a su fijación.
- Realizar la coloración cubriendo la preparación con abundante colorante y
dejarlo actuar durante algún tiempo. Para el azul de metileno un minuto.
- Lavar con agua las preparaciones teñidas y continuar con la técnica tal y como
se indica previamente.
- Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión. Observar
la forma y disposición de los microorganismos teñidos con el colorante.

MUESTRA



EXTENSIÓN Y FIJACIÓN DE LA MUESTRA

TINCIÓN DE LA MUESTRA

(Medio Ambiente)

Tinción con Azúl de Metileno



TINCIÓN DE GRAM

Es uno de los procedimientos de tinción más útiles en la identificación de
microorganismos, ya que divide a éstos en dos grandes grupos: Gram positivos y
Gram negativos.

En 1884, Hans Christian Gram, un Médico danés que
laboraba en Berlín, accidentalmente descubrió un método
para teñir y diferenciar bacterias. Empleaba cristal violeta
como colorante y una solución yodada potásica como
mordente. Mientras examinaba preparaciones de tejido
pulmonar de pacientes que habían muerto por neumonía,
descubrió que el colorante era retenido por algunas
bacterias y otras permanecían incoloras después de lavar el
frotis con etanol y agua. Clasificó a las primeras como
Gram-positivas y Gram-negativas a las segundas.

Posteriormente Carl Weigert introdujo la modificación por la cual se incorporaba
safranina como colorante de contraste al método facilitando la diferenciación entre
positivas (violeta) y negativas (rosa/naranja).

1. Un primer colorante básico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre
la muestra y que reacciona con las células (cargadas negativamente),
coloreándolas.

2. Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las
células. Parece ser que el mordiente (solución diluida de yodo) se combina
con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior
de la célula.

3. Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcohol – acetona
(1:1), que son disolventes orgánicos capaces de eliminar el primer colorante
de algunas bacterias, decolorándolas.

4. Un colorante de contraste, igualmente de carácter básico pero de distinto
color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de
color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teñirá
sólo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que
resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecerán
de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos.
Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloración, se
clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo
colorante, la safranina.

Las diferencias químicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la
salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una
pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglicano, mientras que en
Gram negativas, aunque la pared está también constituida por péptidoglicano, es
más delgada y presenta además una membrana externa con lipopolisacáridos.



Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una
deshidratación y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal
violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipídica más
externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglicano. La tinción de
Gram es más reproducible cuando se aplica a cultivos jóvenes de bacterias, ya que
las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden
aparecer como Gram negativas.

OBJETIVO

Aprender una técnica de coloración diferencial e interpretar los resultados obtenidos
en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas.

TÉCNICA

Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que deberán encontrase en
fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la
fijación, siguiendo la técnica ya descrita. Para la coloración se seguirá el siguiente
protocolo:

Equipo para realizar la tinción de gram

Colorantes: Cristal Violeta, Lugol y Safranina.
Solvente: Alcohol-Cetona.
Puente de tinción.
Asa bacteriológica o hisopo.
Piceta o Frasco lavador.
Muestra bacteriana sólida (agar), líquida
(caldo) o especímen clínico.

Extensión y fijación de la
muestra

Después de llevar la lámina al
puente de tinción Cubrir la
preparación con Cristal Violeta
por 60 segundos y enjuagar
suavemente con agua
destilada.



Cubrir la preparación con Lugol
por 60 segundos y enjuagar
suavemente con agua.

Cubrir la preparación con
Alcohol-Cetona durante
algunos segundos (5-10) y
enjuagar suavemente con
agua.

Cubrir la preparación con
Safranina por 30 segundos y
enjuagar suavemente con
agua. Secar y Observar en
100x (inmersión).

Es conveniente secar el exceso de
agua en el frotis cuidadosamente
con un paño suave o papel
desechable para proceder a la
observación al microscopio
empleando el objetivo de inmersión

Bacterias Gram Bacterias Gram
Negativas Positivas



TINCIÓN DE GRAM MORFOLOGÍA BACTERIANA

Estafilococos Grampositivos Diplococos Gramnegativos

Estreptococos Grampositivos Cocobacilos Gramnegativos

Bacilos Grampositivos Espirilos

Levaduras Espiroquetas



Diplococos Grampositivos Vibrios

Cápsula Esporas

Otras Tinciones Bacteriológicas

Simple, que emplea un solo colorante
Compuesta o múltiple como el Gram,
Ziehl Neelsen Especial para visualizar
algunas estructuras bacterianas:

Gray para flagelos
Argéntica para flagelos
Tinta China para cápsulas
Anthony para cápsulas
Albert para gránulos metacromáticos
Schaeffer-Fulton para esporas
Bacilos Ácidos Alcohol Resistentes Fontana-Tribondeau para espiroquetas.



COLORACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES (BAAR)

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por
tener una pared celular completamente diferente a las restantes Eubacterias. La
pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace
impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se
tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no
pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son
teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o
Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y
ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la
decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol
Resistentes (BAAR). Los microorganismos del género Mycobacterium contienen
una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las
restantes Eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido
Peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina.

Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido
covalentemente al Arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la
porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos
micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos
son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc)
que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican
periféricamente en la pared. Los micolatos de Trehalosa (llamados factores de
cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones
serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de
Mycobacterias más virulentas. El Lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto
que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado
como el equivalente Mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas
debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos.



En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está
recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no
virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir
como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared
celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con
fines diagnósticos (PPD).

El Mycobacterium tuberculosis es el
agente etiológico de la tuberculosis, una
enfermedad que primariamente produce
lesiones en los pulmones y que puede
causar la muerte si nos es tratada en
forma adecuada.

Existen otras Mycobacterias capaces de
producir infecciones en el hombre. El M.
bovis también causa tuberculosis,
mientras que las infecciones producidas
por M. avium, M. kansakii, M.
fortuitum y M. chelonei son
consideradas oportunistas y no
tuberculosas.

La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un
parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias
mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los
nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribución mundial pero con
consecuencias devastadoras en los países en desarrollo. En el año 1993 la
Organización Mundial de la Salud (OMS - WHO World Health Organization)
declaró a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de
la población mundial está infectada con el M. tuberculosis, y que en la próxima
década serán infectadas más de 300 millones de personas de las cuales 90
millones desarrollarán la enfermedad y 30 millones morirán por ella.

Micrografía Electrónica del
Mycobacterium tuberculosis



COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

FUNDAMENTO

► La capacidad de formar complejos coloreados con los derivados de
trifenilmetano que resiste la acción del etanol-ácido (ácido-alcohol resistente), es
propiedad característica de las Micobacterias.

MUESTRAS

► Expectoración (esputo).
Se requiere de 2 muestras.
El envase debe ser de boca ancha y de material descartable. Tendrá
cierre hermético (tapa rosca) para evitar aerosoles. Su capacidad será de
30 – 50 ml y de paredes rotulables.

► Lavado Gástrico.
Se requiere 3 muestras.
Utilizar envases de 50 – 100 ml.
Se extraerá por sondeo gástrico bucal o nasal.

► Lavado Bronquial.
Por Broncoscopía.

► Orina
Se requiere 3 muestras.
Recolección de toda la orina de la mañana previa higiene.
Envase 300 – 500 ml. Boca ancha.

► Líquido Cefalorraquídeo.
Recoger la muestra sin anticoagulante en un envase estéril.
Se recomienda cultivar inmediatamente.

► Otros Líquidos de punción y pus.
Son líquidos recogidos en forma estéril
Se recomienda cultivar inmediatamente.

OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA

► Toda muestra se debe procesar inmediatamente.
► Se puede conservar en refrigeración (2-8ºC) durante 7 días.

MATERIALES REACTIVOS
► Microscopio. ► Fucsina básica
► Laminas portaobjetos nuevos. ► Azul de metileno
► Aplicadores o palitos de madera. ► Fenol al 5%
► Mechero. ► Ácido clorhídrico
► Lápiz para marcar vidrio. ► Alcohol de 95.



METODO

1 2
Nunca tome
muestras de
esputo dentro
de la clínica o
laboratorio.
Es más seguro tomar las
muestras fuera de éstos.

3 4
AREA 1
¡Las mascarillas
quirúrgicas no Un espacio bien iluminado con un
evitan el lavabo o tarja con agua corriente
contagio de para preparación y tinción de los
TBC! extendidos,

5
AREA 2

Una mesa para microscopio; de no haber
electricidad, esta mesa debe colocarse
directamente enfrente de una ventana, y

6
AREA 3

Una mesa para registrar resultados y
almacenar portaobjetos.

7
Recolección de muestras

8
Rotular los envases de las muestras
sobre la mesa de trabajo.

9
Para una mejor detección de los bacilos de
la tuberculosis, se recomienda tomar tres
muestras. Por lo menos una debe ser “la
primera muestra de la mañana”.



10 11
Enumerar las láminas portaobjetos
con un lápiz para marcar vidrio en el
tercio proximal de la lámina. En los
2/3 distales se realizará el extendido.

Siempre lávese las manos con agua y jabón
Después de manejar muestras y recipientes.
12
Abra despacio el recipiente, esto evita
La producción de aerosoles.

Dividir un aplicador de madera en dos
Y tomar parte de la muestra eligiendo Un aplicador de Madera

Aquella de características
Mucopurulentas.

Con el aplicador, extender la muestra
Tomada sobre el portaobjetos con un Un Asa
Movimiento de vaivén hasta lograr un
Equilibrio homogéneo.

13
NO LOS FLAMEE para inducir el secado.
Esto también produce aerosoles.

Ya secos, fije los portaobjetos usando
La llama azul de un mechero Bunsen.
Con pinzas, y con el extendido hacia arriba,
Pase brevemente el portaobjetos a través
De la llama 3 veces.

14
Colocar sobre el soporte de coloraciones
La lámina fijada. Cubrir la totalidad de la
Superficie del extendido con el colorante
Fucsina básica fenicada previamente filtrada.

Flamear el frotis con la llama de un hisopo
De algodón embebido en alcohol por tres
Veces consecutivas, hasta que se observe
La emisión de vapores. Se debe cuidar que
El calentamiento sea suave y que no se
Produzca la ebullición del colorante. Si el
Volumen del colorante disminuye se debe
Agregar más para cubrir el extendido. El
Tiempo mínimo de coloración con fucsina
Es de 5 minutos.



15
Lave suavemente el colorante de
Cada portaobjetos con agua corriente
Fría hasta que toda la tinción libre
Quede lavada. Siempre lave
Suavemente de manera que el
Extendido no se barra del portaobjetos.

16
Incline individualmente cada
Portaobjetos para drenar todo el
Exceso de agua. Esto evita que quede
Agua remanente sobre el portaobjetos
Que pueda diluir el próximo reactivo.
Cubra cada portaobjetos con la
Solución decolorante, tal como
Alcohol ácido y manténgalo sobre el
Portaobjetos durante 3 minutos.
17 18
Lavar con agua corriente y a baja presión. Vuelva a enjuagar con un leve chorro
Cubrir el portaobjetos con la solución de de agua e incline cada portaobjetos
Azul metileno la que se dejará por un minuto hasta drenar el exceso de agua.

19

Dejar secar a temperatura ambiente.
Realizar la lectura en un microscopio con
Lente de inmersión, leyendo de izquierda a
Derecha un mínimo de 100 campos útiles
Durante 5 minutos. Un campo útil es
Aquel que contiene elementos celulares
De origen bronquial leucocitos, fibras
Mucosas y células ciliadas.

20

Después de examinar el portaobjetos detenidamente,
Desmóntelo cuidadosamente de la platina del
Portaobjetos. Verifique otra vez el número de
Identificación del portaobjetos e inmediatamente
Anote el resultado en el registro del laboratorio.



21

Antes de examinar el próximo portaobjetos, limpie
El lente de inmersión con el papel para limpiar
Lentes; esto evita la transferencia de organismos
Que pueden crear una lectura falsa positiva.

INTERPRETACIÓN

► Los bacilos ácido alcohol resistentes
(BAAR) aparecen teñidos de rojo
Sobre un fondo de azul claro.

INFORMES DE LOS RESULTADOS

(-) No se encuentran bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) en
100 campos microscópicos.
(+) < 1 BAAR por campo en promedio, en 100 campos
observados.
(++) De 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados.
(+++) > 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.

Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados,
observar 100 campos más. Si persistiera igual, realizar otro extendido eligiendo otra
zona de la misma muestra. Proceder según los resultados encontrados.

22

Los bacilos de la tuberculosis
Semejan delgados bastoncillos
Rojos que resaltan contra el fondo
Azul. Pueden ser un poco
Encorvados granulados y
Presentarse individualmente, en
Pares o en grupos.



PRACTICA N°05
ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO BACTERIANO

SIEMBRAS

OBJETIVOS

- Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo,
agar inclinado y medio semisólido sembrado en profundidad.
- Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo.
- Observar el crecimiento de microorganismos en ausencia de oxígeno.
- Comprobar la movilidad de determinados microorganismos.

MATERIAL

Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensión
de microorganismos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido inclinado y
semisólido.

TÉCNICA

a) En medio líquido con asa: Transferir asépticamente,
con el asa de siembra, una pequeña muestra de los
microorganismos, desde el tubo que contiene el
material problema al tubo con medio de cultivo estéril.
Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender
y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en
estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de
crecimiento.



b) En medio líquido con pipeta:
Introducir asépticamente la pipeta
Pasteur o la pipeta graduada en el
medio líquido que contiene los
microorganismos y, aspirando de
forma adecuada, sacar una cantidad
establecida de material que se
transfiere al tubo con medio de
cultivo estéril.

Incubar en estufa durante 24-48
horas a la temperatura más
adecuada.

c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa de siembra estéril tomar los
microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de
zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando
hacia arriba por el área inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la
temperatura más adecuada.

TRIPLE AZUCAR HIERRO LISINA HIERRO AGAR



d) En medio semisólido: La siembra en este
tipo de medio, que contiene una proporción
menor de agar que los medios sólidos y
que se envasa en tubos, se lleva a cabo
con un hilo de siembra esterilizado, con el
cual se toma la muestra. El medio queda
inoculado al introducir el hilo en
profundidad hasta el fondo del tubo,
retirándolo posteriormente por la misma
trayectoria utilizada al realizar la picadura.
Una siembra con asa o con un cierto
movimiento de vaivén podría originar un
patrón de crecimiento que se interpretaría
erróneamente como movilidad bacteriana.
Incubar durante 24-48 horas a la
temperatura óptima de crecimiento.

Prueba de Movilidad en
Agar Semisólido

1. Microorganismo Móvil
2. Microorganismo Inmóvil
3. Tubo Control sin Inocular



RESULTADOS

a y b) En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto se
examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de
una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del
tubo, etc. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una
población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser
utilizados posteriormente.

GRAFIQUE LO OBSERVADO

c) En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la
aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo
de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Además, se utiliza para
almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a temperaturas de 4ºC.

d) En medio semisólido se podrá comprobar si
el microorganismo es o no móvil, ya que en el
primer caso se observará que el crecimiento
difunde alrededor de la zona donde se hizo la
picadura, detectándose turbidez. Por eso es
tan importante que, al inocular el medio de
cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a
sacar el hilo por el mismo sitio de inoculación.
Los microorganismos inmóviles crecerán
únicamente a lo largo de la picadura.

Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro de método de
conservación de microorganismos anaerobios facultativos.



INOCULACIÓN DE DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO

DESARROLLO BACTERIANO EN CALDO DE CULTIVO

DESARROLLO BACTERIANO EN TUBOS CON AGAR INCLINADO



AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCIÓN

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados,
sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y
trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo
axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido,
una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta,
se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas
durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio
líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de
microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch
introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie
del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para
diferenciar distintas especies microbianas.

OBJETIVOS

- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de
aislamiento en placa de Petri.
- Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos.
- Estudiar la morfología de cada colonia.

MATERIAL

Asa de siembra, cayado, placas de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de
microorganismos.

TÉCNICAS

Existen distintas técnicas que pueden ser usadas:

a) Extensión en superficie con cayado: Depositar sobre la superficie de una
placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del
cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado,
previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté
completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura
deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La
posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la
superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Es una
técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el
recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el
volumen de muestra sembrado.



EXTENSIÓN EN SUPERFICIE CON CAYADO



b) Estría múltiple en superficie: Con un asa de siembra, previamente
esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende
sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma
de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se flamea
el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este
proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de
las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura
adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen
colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de
bacterias.

c) Dilución en masa: En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño
volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo
(agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan
ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se
distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el
desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variación de esta
técnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado,
contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La
homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del
tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, tras
homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio
y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición
invertida). Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas,
generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos
viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o
microaerófilos.



INTERPRETACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE SIEMBRA

a) Extensión en superficie: Tras el período de incubación se examinarán las
placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente
si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las
colonias de acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc. Esta técnica de
siembra, además de permitir que se distingan las colonias por su morfología,
permite el recuento de microorganismos viables. La expresión de este recuento
se hace en “unidades formadoras de colonias” (UFC) ya que cada una procede
de un sólo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en
algunos casos éstos tienden a formar agregados). A partir de las colonias
aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo
para su estudio.

b) Por estría múltiple en superficie: Tras la
incubación, se observarán las colonias
aisladas en alguna región de la placa
inoculada. Con esta técnica se logra la
separación de los microorganismos que se
encuentran en un cultivo mixto, o bien que
proceden de muestras homogéneas, pero en
las que existe un elevado número.

En las zonas donde existen colonias
aisladas se puede estudiar la morfología
colonial.

c) Dilución en masa: Aparecen las colonias
distribuidas por toda la masa del agar.
Aquellas que están en la superficie tendrán
distintas características, dependiendo del tipo
microbiano, mientras que las colonias que se
desarrollan en el interior, bajo la superficie
del agar, tienen forma lenticular, aunque los
microorganismos que formen las distintas
colonias sean de distinto tipo.
Por tanto, las colonias que aparecen en la
profundidad del agar son siempre biconvexas
y no se diferencian unas de otras por su
morfología.



ESTRÍA MÚLTIPLE EN SUPERFICIE

2

Esterilizar el aro o
aguja de siembra
sometiéndolos
directamente a la
acción de la llama
1 de un mechero
Bunsen
Seleccionar aro o aguja de siembra

3
4

6
5

7



DILUCIÓN EN MASA

1
2 3

5

4

6

7

ASPECTOS MÁS COMUNES DE LAS DIVERSAS COLONIAS MICROBIANAS
AISLADAS SOBRE MEDIO SÓLIDO.



PRACTICA N°06
METABOLISMO BACTERIANO

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos durante la actividad metabólica realizan una serie de acciones
bioquímicas. De las diferentes reacciones obtienen la energía que se consume en
síntesis, crecimiento y otras actividades. El objeto de esta práctica es hacer conocer
al alumno algunas de las reacciones principales que se utilizan para reconocer,
diferenciar e identificar los productos formados por microorganismos durante su
metabolismo: ácidos, productos de putrefacción, toxinas, enzimas, etc.

I. ACCIÓN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO

Las bacterias pueden utilizar diferentes tipos de hidratos de carbono, desde
polisacáridos (almidón, celulosa) hasta monosacáridos (pentosa – xilosa,
hexosa – glucosa) produciendo diversos tipos y cantidades de ácidos.

La fermentación de carbohidratos, se basa en que muchas especies de
microorganismos actúan sobre el substrato hidrocarbonato, produciendo la
acidificación del medio, el cual se detecta por cambio de pH (con el indicador) y
la presencia de gas (CO2 e H2) por la presencia de burbujas o rotura del medio
de cultivo.

MATERIALES

- Cultivo de microorganismos en medio semisólido con lactosa e indicador
de pH, incubado a 37° . por 18 – 24 horas.
C
- Cultivo de microorganismos en medio semisólido con glucosa e indicador
de pH, incubado a 37° . por 18 – 24 horas.
C

PROCEDIMIENTO

Observar los cultivos presentados y notar los cambios producidos en el medio de
cultivo.

Producción de ácidos y acetil metil carbinol

a) Prueba del rojo de metilo

Esta prueba es cuantitativa para la producción de ácidos formados por
microorganismos que utilizan principalmente la vía de fermentación mixta,
con producción de ácido láctico, formico, acético y mantiene el pH por
debajo de 4,4, luego de una incubación prolongada (48 – 72 horas)
contrarrestando el sistema estabilizador del medio MR – VP.

Algunos microorganismos que degradan la glucosa, tienen la capacidad
de formar ACETIL METIL CARBINOL (acetoína).



La acetoína es un subproducto neutro de la vía del butilenglicol.

En la practica se detecta la acetoína utilizando hidróxido de potasio al 40%, el cual
es presencia de oxigeno atmosférico se convierte en DIACETILO y el alfa naftol
actúa como catalizador para revelar un complejo rojo.

MATERIALES

- Cultivo de bacterias sembradas en tubo con medio MR – VP.
- Reactivo de rojo de metilo.
- Reactivos de hidróxido de potasio y alfa naftol.

PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

a) Para la prueba de rojo de metilo, añadir en el cultivo de 48 – 72 horas,
unas gotas del indicador pH que es el rojo de metilo, cuyo rango de viraje
está entre pH 4,4 (ROJO) y pH 6,0 (AMARILLO). Prueba positiva: color
rojo estable en la superficie del medio. Prueba negativa: Incoloro, amarillo
o naranja.

b) Para la prueba de Voges – Proskauer, añadir al cultivo de 18 – 24 horas,
0.6 mL (12 gotas) de alfa naftol al 5% y 0,2 mL (4 gotas) de KOH al 40%.
Agitar el tubo por un minuto y dejarlo en reposo por 15 minutos. Es
esencial añadir los reactivos en el orden señalado. Prueba positiva: color
rojo dentro de los 15 minutos (colocados en la mitad superior o en todo el
tubo). Prueba negativa: ausencia del color rojo.

Es importante que la lectura no se realice después de una hora, porque
los cultivos de VP pueden presentar un color cobrizo dando una
interpretación falsa positiva.

II. ACCIÓN SOBRE LAS PROTEÍNAS

a) Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)

Su liberación ocurre por la acción enzimática de ciertos microorganismos
sobre la peptona, polipéptidos y aminoácidos como la cisteina, metionina,
cistina que contienen azufre. Para su comprobación se puede hacer en
medios sólidos o semisólidos a base de peptonas e indicador (acetato de
plomo, por ejemplo) y en contacto con éste, se produce sulfuro de plomo,
dando un precipitado de color negro, en la superficie y puntura de
siembra.


Observar los cultivos sembrados en agar peptona – subacetato de plomo
compararlos con el tubo de control. Prueba positiva: se manifiesta por la aparición
de un precipitado de color negro insoluble en la superficie y puntura de siembra.



b) Producción de indol

Ciertas bacterias tienen la capacidad de desdoblar la molécula de
aminoácido triptófano (presente en la peptona) mediante un complejo
sistema de enzimas aminolíticas dando lugar a ácido pirúvico, amoníaco y
metabolitos: Indol, escatol e indolacético, productos de putrefacción.

El indol se detecta en el medio observándose el desarrollo del color rojo
(en forma de anillo) luego de añadir un reactivo que contiene p-
dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich o Kovac). El alcohol
amílico empleado como diluyente en el reactivo de kovac extrae
suficientemente el indol del medio acuoso para producir una reacción
positiva.

MATERIALES

- Cultivo de la bacteria en caldo peptona.
- Reactivo de Kovac.


Añadir 5 gotas del reactivo de Kovac por las paredes del tubo al cultivo de 18 – 24
horas. Prueba positiva: desarrollo de un color rojo vivo en forma de anillo en la
superficie del tubo. Prueba negativa: se forma un anillo del color del reactivo.

III. HIDRÓLISIS DE LA UREA

Muchas especies de microorganismos poseen la enzima ureasa, la cual actúa
hidrolizando la urea con la formación de amoniaco y dióxido de carbono. Estos
reaccionan en solución para formar carbonato de amonio que alcaliniza el
medio. Este efecto se manifiesta debido a la presencia de un indicador de pH
que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 6,8 (amarillo) y 8,4
(rojo) incluido en el medio de urea de Christensen.

MATERIAL

- Cultivo de la bacteria sembrado en agar de urea de Christensen.

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

- Observar los cultivos sembrados en el medio de urea de Christensen,
incubados a 37° . por 18 – 24 horas.
C
- El carbonato de amonio producido en una reacción positiva, confiere
reacción alcalina al medio, lo cual se demuestra por el viraje del indicador
del pH (rojo de fenol) a rosado.



IV. UTILIZACIÓN DEL CITRATO

Algunas bacterias pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación
de hidratos de carbono, utilizando el citrato como única fuente de carbono.

La prueba de utilización del citrato (en el medio de Citrato de Simmons) es
positiva si hay viraje del medio hacia el color azúl o si se nota desarrollo
aunque no haya viraje de color.

MATERIAL

- Cultivos de bacterias en medio de agar citrato de Simmons.

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

Observar los cultivos sembrados en agar citrato de simmons, incubado a 37° por
C
18 -24 horas. Prueba positiva: color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la
superficie del medio. Prueba negativa: no hay cambio de color ni crecimiento.

V. PRODUCCIÓN DE TOXINAS

- Acción de la Hemolisina

Algunos microorganismos elaboran una serie de enzimas y sustancias
tóxicas que ayudan al poder invasivo por cuanto lesionan el mecanismo
de defensa del huésped. La actividad hemolítica de enzimas que actúan
en cultivos sobre placas de agar sangre y causan la lisis completa de los
eritrocitos, se denomina: beta hemólisis y la que produce la destrucción
parcial de los glóbulos rojos: alfa hemólisis

MATERIAL

- Placa con bacteria beta hemolítica sembrada en agar sangre.


Observar la presencia de beta hemólisis en el cultivo bacteriano sembrado en la
mitad de la placa con agar sangre de carnero, con aclaración total del medio
alrededor de la colonia.



UTILIZACIÓN DEL CITRATO: Agar citrato de simmons

En la figura aparecen de izquierda a derecha:

Tubo sin inoculación de bacterias, resultado

Negativo y resultado positivo a la derecha.

ACCIÓN DE LA HEMOLISNAS



ACCIÓN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO

TRIPLE AZUCAR HIERRO
NUMERO DE TUBO 1 2 3 4 5
Desaminación de los
aminoácidos (Reacción alcalino + + + + +
aerobio.)
Fermentación de la glucosa
(Reacción ácida de menor – + + + +
importancia.)
Fermentación de la lactosa y/o
de la sacarosa (Reacción ácida – – – + +
importante.)
Producción del H2S (color negro) – – + – +
Gas – – – + +
C: tubo control



LISINA HIERRO AGAR

NUMERO DEL TUBO 1 2 3 4*
Desaminación de aminoácidos
+ + + +
(Reacción alcalino aerobio.)
Desaminación de la Lisina
– + – –
(pico de flauta rojo oscuro)
Descarboxilación de la Lisina
– – + +
(Reacción alcalino anaerobio.)
Fermentación de la glucosa
+ + + +
(Reacción ácida)
H2S – – – +
C: tubo control



PRODUCCIÓN DE INDOL




Producto de la degradación

Del Aminoácido triptófano

PRUEBA DE LA UREASA

Detecta presencia de la
Enzima ureasa

Hidrólisis de la urea libera
Amoniaco

PRUEBA DE LA MOVILIDAD

Movilidad positiva

Sin inocular

Movilidad negativa



PRUEBA DEL ROJO DE METILO




Producción de ácidos a partir de la glucosa.

PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER


tubo sin inoculación de bacterias, resultado

negativo y resultado positivo a la derecha.

Producción del acetil-metilcarbinol ó acetoína

Complejo rojo com alfa naftol y creatina.



REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

- Microbiology.
Davis B, Dulbecco R, Eisen H, Gisnberg H 4th Edition 1984. Harper & Row Pub.

- Microbial Life
Perry J, Staley JT, Lory S. Sinauer Ass Publishers Inc. MA. 2002.

- Ecología microbiana y Microbiología ambiental
Atlas R M, Bartha R Pearson Educación. Madrid, 4a ed. 1998.

- Microbial ecology and infectious disease
Rosenberg E ed. ASM Press. Washington . 1999.

- Biología de los microorganismos.
Brock T D, Madigan M T, Martinko J M, Parker J. 8° Ed, Prentice Hall Madrid, 1999.

- Zinsser. Microbiología.
Joklik W K, Willett H P, Amos D B, Wilfert C M. 20° edición. Panamericana. 1996.

- Microbes in action: A laboratory Manual of Microbiology.
Seeley H W, Vanderrmark P J, Lee J, Freeman W H. 4th edition 1991.

- General Microbiology.
Schlegel H G 7th edition Cambridge University Press UK 1997.

- Bacteria in Biology, Biotechnology and Medicine.
Singleton J. 3rd Edition Ed. Wiley & Sons, USA. 1995.

- Encyclopedia of Microbiology.
Lederberg J. Academic Press, Inc. USA. 1992.

- Microbiología en Práctica
Vullo D L, Wachsman M B, Alché L E Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2000.

- Introducción a la Microbiología
Tortora G J, Funke B R, Case C L. Editorial Acribia SA, Zaragoza España, 1993.

- Diagnostic Microbiology
Koneman E W, Allen S D, Janda W M, Schreckenberger P C, Winn W C Jr. 5 th
Edition, Lippincott, Philadelphia, 1997.

- Antibiotics in Laboratory Medicine
Lorian, Victor Editor, Williams & Wilkins, Baltimore USA, 1980.

- Inmunología e Inmunoquímica
Margni R A, 5°edición Editorial Médica Panamerican a 1996.

- Inmunología. Fundamentos Roitt, I M, Delves, P J, 10a Edición, Editorial Médica
Panamericana, 2003.

- Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica
MacFaddin 3ra Edición, Editorial Médica Panamericana, 2003.



ANEXO I: FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO
NORMAL



FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO NORMAL

Los seres humanos son bombardeados de forma constante por las miríadas de
microorganismos que ocupan el medio ambiente. Sin embargo, por fortuna los seres
humanos no constituyen un hábitat favorable para la mayoría de estos saprófitos
porque deben competir con la flora comensal ya adaptada al medio humano. Los
microorganismos que constituyen la flora normal deben superar las barreras para la
colonización producidas por el flujo de jugos corporales, la depuración mucociliar y
mecanismos inmunitarios locales. Además, la persistencia de varios
microorganismos en sus nichos específicos puede depender de su unión a las
células del huésped en esas áreas.

La piel.
Conjuntivas
Nariz y nasofaringe.
Boca y orofaringe.

Tracto intestinal
- Estómago e intestino delgado.
- Intestino grueso.

Tracto genitourinario
- Genitales externos y uretra anterior.
- Vagina.

Sangre y tejidos.
FLORA NORMAL PREDOMINANTE EN DIFERENTES SITIOS DEL CUERPO

SITIOS DEL CUERPO FLORA MICROBIANA
Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium,
Piel.
Propionibacterium, Micrococcus, Levaduras.
Conjuntivas. Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,
Nariz y nasofaringe.
Streptococcus spp.
S. epidermidis, Estreptococo no grupo A,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis,
Boca y orofaringe. salivarius, Neisseria, Haemophilus, Veillonella,
Bacteroides, Fusobacterium, Treponema,
Lactobacillus, levaduras
Lactobacillus, Streptococcus spp, Enterococcus,
Tracto intestinal: intestino delgado.
Veillonella, Actinomicetos, levaduras.
Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium,
Tracto intestinal: intestino grueso. Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus,
Peptostreptococcus, Enterococcus, Enterobacterias.
Corynebacterium, Estreptococos alfa y no
hemolíticos, Staphylococcus epidermidis,
Tracto genitourinario.
Enterococcus, Lactobacillus, Mycobacterium
smegmatis, Enterobacteriaceae, Bacteroides,
Sangre y líquido cefaloraquídeo. Estéril.
Tejidos, vejiga, útero y trompas de falopio,
Estéril.
oído medio, senos paranasales.



INFECCIONES NOSOCOMIALES

SITIO DE INFECCIÓN PORCENTAJE AGENTES MÁS COMUNES
Escherichia coli, Enterococcus, Proteus,
Tracto urinario. 40%
Klebsiella, Pseudomona aeruginosa.
Staphylococcus aureus, Staphylococcus
Herida Quirúrgica. 20%
epidermidis, Escherichia coli.
Klebsiella, Pseudomonas, Escherichia coli,
Pulmonares. 10%
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, Staphylococcus
Bacteriemia primaria. 5 – 10%
epidermidis, Bacilos G (-)
Otras. 20 – 25% Staphylococcus aureus, Escherichia coli

CONDICIONES DIVERSAS QUE COMPROMETEN LAS DEFENSAS DEL
HUÉSPED

Fármacos: inmunosupresores, antibióticos, anestésicos
Alcoholismo
Desnutrición
Infecciones virales: influenza, sarampión, etc.
Alteraciones de las barreras mucosas cutáneas normales
Procedimientos iatrogénicos
Prótesis: Catéteres intravenosos, sondas vesicales
Aparatos de asistencia respiratoria:
nebulizadores, respiradores, etc.



ANEXO II: FUNDAMENTOS E INTERPRETACIÓN DE
AGARES Y CALDOS



AGARES Y CALDOS

► La preparación debe cumplir con las exigencias indicadas por el fabricante.
En el caso de medios comerciales se deben tener las características optimas
(pH, control de esterilidad, vigencia).

MEDIO DE TRANSPORTE

MEDIO DE CARY-BLAIR: FUNDAMENTO

► Para la conservación y transporte de muestras de microorganismos
patógenos, como Salmonella, Shiguella, Haemophilus, Estreptococos,
Corynebacterium, con considerable conservación de la composición de la
flora de gérmenes.
► La carencia de una fuente de nitrógeno impide considerablemente la
multiplicación de gérmenes. La composición del medio garantiza una
supervivencia suficientemente larga de los microorganismos. El medio goza
de anaerobiosis.

PREPARACION

► Disolver 12 grs. por litro y distribuir hasta aproximadamente 7 cms de altura
en tubos con tapón de goma o cierre de rosca. Esterilizar en autoclave por
15 minutos a 121ºC, luego enfriarlos en posición vertical. pH final = 7.4 ± 2.

USO

► Utilizar para el recojo del material a estudiar un hisopo de algodón estéril,
eventualmente impregnado con una suspensión de carbón vegetal.
► Introducir el hisopo en el medio de transporte hasta la mitad de su longitud.
Cerrar herméticamente el tubo y conservarlo en frió hasta su transporte.

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO

CALDO SELENITO

PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES

► El caldo Selenito se recomienda para el aislamiento de bacterias del género
Salmonella en muestras como: heces, orina o aguas cloacales con
abundante concentración de mixtura bacteriana.

Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA


► El selenito de sodio es inhibidor de E. Coli y de muchos otros coliformes,
incluyendo cepas de Shiguella.
REACCIONES E INTERPRETACION

► Dado que los coliformes y otros organismos de la flora intestinal pueden en
pocas horas superar el desarrollo de las especies patógenas, se recomienda
subcultivar luego de 8 a 12 horas en Agar Salmonella-Shiguella o Sulfito de
Bismuto.
► A las pocas horas de inocular la muestra, el caldo se enturbiará.
► Al sobrecalentar el Caldo durante la preparación, se producirá un precipitado
visible que lo hace insatisfactorio para el uso.

CALDO CEREBRO CORAZÓN (MEDIO BRAIN HEART INFUSION):
FUNDAMENTO

► Este medio de cultivo se basa en el
principio del caldo de Rosenow preparado
con trozos de cerebro y es adecuado para
el cultivo de muchas bacterias exigentes,
como estreptococos, neumococos,
meningococos y otros.

► El caldo cerebro–corazón es especialmente
adecuado para el cultivo de estafilococos
destinados al ensayo de la
plasmocoagulasa y para la realización de
hemocultivos.

► El rendimiento del caldo para gérmenes anaerobios o microaerófilos resulta
decisivamente mejorado por la adición de pequeñas cantidades de Agar.
(Aprox. 0.05 – 0.2 % )
PREPARACION

► Disolver 37 gramos por litro y esterilizar en autoclave (15 minutos a 121ºC)
pH: 7.4 ± 0.2.
► El medio es ligeramente parduzco y con aspecto claro.

AGUA DE PEPTONA: FUNDAMENTO

► Para el enriquecimiento previo y no selectivo. Se usa especialmente en
enterobacterias patógenas a partir de alimentos y otros materiales. El
enriquecimiento previo en este caldo conduce a mayores concentraciones
enterobacterias patógenas, en especial si existen bacterias ligeramente
dañadas.

► El Caldo es rico en sustancias nutritivas lo que provoca una alta cuota de
sobrevivencia de bacterias ligeramente dañadas y un crecimiento intenso.



REACTIVOS

Composición (1 litro)

► Peptona de carne 10.0 gr.
► Cloruro sódico 5.0 gr.
► Cloruro sódico 5.0 gr.
► Tampón de fosfato 10.0 gr.

PROCEDIMIENTOS

► Sembrar el medio de cultivo con el material de muestra.
► Incubación: Aproximadamente 18 hrs. a 37ºC.
► A continuación se siembra en medios nutritivos de enriquecimiento selectivo.

CALDO DE TIOGLICOLATO: FUNDAMENTO

► Para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos, de
gérmenes microaerófilos y para ensayo de esterilidad.

► Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteína,
proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para
anaerobios exigentes.
► Debido a sus grupos sulfhidrílicos, son inactivados los
compuestos de arsénico, mercurio y de otros metales
pesados por lo que los medios con tioglicolato son
adecuados para la investigación de materiales que
contengan materiales pesados.
► La elevada viscosidad del medio de cultivo impide la
penetración rápida de oxigeno. El eventual aumento del
nivel en oxígeno se manifiesta por un viraje a rojo del
indicador.
REACTIVOS

► Preparar del medio comercial 29 gr por litro, distribuir en tubos, esterilizar en
autoclave 15 minutos a 121ºC y a un pH = 7.1. ± 0.2
► Los medios de cultivo varían de un color amarillento hasta parduzco.
► De ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recién preparados.
► El medio no puede utilizarse cuando presenten una coloración rosa en más
del tercio superior de la altura del tubo debido a la penetración de oxigeno.
Tampoco cuando dicha coloración no quede eliminada por la ebullición.

PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA

► El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de
cultivo. A continuación puede superponerse una capa de aproximadamente
1 cm de altura de parafina estéril.



INCUBACION

► Varios días a temperatura según requiera el germen a investigar.

INTERPRETACION

► Los gérmenes anaeróbicos crece en la parte inferior del tubo de cultivo.

MEDIOS MEJORADOS DE AISLAMIENTO NO SELECTIVO

AGAR CHOCOLATE: FUNDAMENTO

► La liberación de hemoglobina por el hematíe es producto de la acción del
calor sobre el medio. El hematíe lisado por el calor aporta al agar chocolate,
el factor X (hemina o hematina) que es termoestable y el factor V (NAD –
Nicotinamida Adenina Dinucleótido) termolábil, factores que potencian el
crecimiento de algunos gérmenes.

PREPARACION

► Para su preparación se utiliza los agares base y
sangre.
► Cuando los medios base se encuentren entre
60 a 80ºC, añadir la sangre y agitar
frecuentemente manteniendo el medio de
cultivo a aproximadamente 80ºC en baño María
o estufa bacteriológica durante unos 10 minutos
hasta que adquiera un color pardo o
“achocolatado”.

UTILIZACION

► Para el desarrollo de bacterias del género Neisseria, Haemophilus, cocos
gram positivos, etc.

INTERPRETACION

COLONIA MICROORGANISMOS

Pequeñas, grises,
traslúcidas, de bordes
enteros o festoneados. A
las 40 h visibles y opacos.

Neisseria gonorrhoeae



INTERPRETACION


Pequeñas, transparentes,
puntiformes (como rocío).
Desarrollan alrededor de
estría estafilocócica.

Haemophilus influenzae

Opacas, blanquecinas, a
veces amarillentas y con
bordes irregulares. Pueden
encontrarse colonias
mucosas.

Neisseria. meninigitidis

Medio sin inocular

MEDIO BIFÁSICO (RUIZ CASTAÑEDA): FUNDAMENTO

► Medio de cultivo que consta de 2 fases; una sólida, la cual se deja solidificar
en plano inclinado, después del cual se agrega 30 ml de fase líquida.

PREPARACION

► Se reparte en frascos estériles de 100 mL de capacidad. Inicialmente se
añaden 25 mL de fase sólida, la cual se deja solidificar en plano inclinado,
después del cual se agrega 30 mL de fase líquida.



PROCEDIMIENTO DE USO

► Se usa generalmente para hemocultivos y
mielocultivos. Se siembra 10 mL de sangre en
forma aséptica y se deja en incubación de 15 a 21
días a 37º C según sea el caso. Al cabo de 6 - 24 -
48 - 72 hrs., 4 – 7 - 15 y 21 días de incubación se
realizan subcultivos en Agar Sangre y Agar Mac
Conkey.

INTERPRETACION

Indican desarrollo bacteriano:

► Presencia de turbidez, Hemólisis.
► Indicios de presencia de gas.
► Presencia colonias sobre la superficie sólida.

AGAR MUELLER HINTON: FUNDAMENTO

► Para el ensayo de la sensibilidad o para ensayos de resistencia de agentes
patógenos médicamente importantes frente a antibióticos.
► Se utiliza para la realización del ensayo de disco difusión en placas.

► La composición de este medio de
cultivo garantiza condiciones favorables
de crecimiento y además esta libre de
antagonistas de sulfamidas.
► Para mejorar de forma considerable el
crecimiento de microorganismos
exigentes, puede añadirse sangre. Esto
puede sin embargo conducir a
resultados erróneos en el ensayo de
enterococos frente a aminoglicósidos.

AGAR NUTRITIVO – CALDO NUTRITIVO

► Medios universalmente utilizados para el cultivo de microorganismos poco
exigentes.

► Se puede utilizar el caldo nutritivo como medio de enriquecimiento excelente
para Listeria monocytogenes, añadiendo 0.05% de telurito potásico.

EMPLEO E INTERPRETACION

► Se orientan según los fines de utilización previstos.



AGAR SANGRE: FUNDAMENTO

► Producto preparado con un medio base
completo de gran calidad nutritiva.
► El cultivo de microorganismos incluye
los exigentes.
►
► El medio base puede ser agar
columbia, agar mueller, agar tripticase
soya y agar sangre base.
►
► Para la determinación de los tipos de hemólisis es adecuado añadir sangre
de carnero, recién obtenida y desfibrinada.

PREPARACION

► Preparar cualesquiera de los medios base, esterilizar en autoclave por 15
minutos a 121ºC. Dejar enfriar y cuando se encuentre entre 45–50ºC
incorporar de 5-8% de sangre desfibrinada. Mezclar y luego verter en las
placas. Obtener un pH= 6.8. ± 0.2.

RESULTADO

► Los medios óptimos son color sangre, no debe haber hemolizados. Se
guardarán entre 2-8ºC.
► Las placas de agar sangre preparadas y listas para el uso son utilizables
durante 3 meses como máximo.

UTILIZACION

► La siembra de las muestras biológicas a investigar se realizan por diferentes
métodos
► Es este medio desarrollan casi todas las bacterias heterótrofas y se aprecia
muy bien la hemólisis Alfa o Beta.

INTERPRETACION

COLONIA MICRORGANISMOS
Blanquecina con halo verdoso Streptococcus viridans
estrecho S. faecalis
Crateriforme con halo verdoso Streptococcus pneumoniae
Blanquecino con halo Streptococcus pyogenes
transparente, 2 ó 3 veces el Algunos S. faecalis y todo
diámetro de la colonia. estreptococo hemolítico.
S. Faecalis
Falta de hemólisis.
Estreptococos no patógenos.



AGAR TRIPTICASA SOYA: FUNDAMENTO

► Este medio es generalmente utilizado con sangre ú otros medios
enriquecidos para el aislamiento y cultivo de diversos microorganismos
exigentes.
► Cuando se añade sangre, el medio es adecuado para determinar reacciones
hemolíticas.
► Cuando el medio es preparado para chocolate, soporta el crecimiento de
bacterias del género Neisseria, Haemophilus y otros microorganismos.
► En una baja concentración de oxigeno, bacterias del género Clostridium y de
gérmenes anaerobios no esporulados crecen.

MEDIOS DE AISLAMIENTO SELECTIVO

AGAR MC CONKEY

PROPOSITO Y MEDIOS DIFERENCIALES

► El agar Mac Conkey es un medio diferencial para la selección y recuperación
de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados.
► Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias gram
positivas y de algunos Gram negativos exigentes.
► La lactosa es el único hidrato de carbono.
► Las bacterias fermentadoras de lactosa forman colonias de diferentes tonos
de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH < de 6.8) por la
producción de ácidos mixtos. Las colonias no fermentadoras de lactosa
aparecen incoloras o transparentes.


► Los fermentadores fuertes de lactosa forman colonias rojas rodeadas de una
zona de bilis precipitada, tales como: E. Coli, Klebsiella y Enterobacter.
► Los fermentadores débiles o lentos de lactosa, tales como Citrobacter,
Providencia, Serratia o Hafnia pueden formar colonias incoloras a las 24
horas o ligeramente rosadas a las 48 horas.



► Las colonias de Proteus, Edwardsiella, Salmonella y Shiguella, con raras
excepciones son incoloras o transparentes.

LACTOSA POSITIVO LACTOSA NEGATIVO

AGAR MANITOL SALADO: FUNDAMENTO

► Es un gran medio selectivo para la
demostración de estafilococos
patógenos en alimentos y otros
materiales.
► Debido a la concentración
extremadamente alta de sal,
permite solo el crecimiento de
microorganismos tolerantes a ella,
entre otros, los del género
Staphylococcus. La degradación
del manitol, con formación de
ácido, está notablemente
correlacionada con la
patogenicidad del germen en
cuestión y sirve, por lo tanto, como
indicativo de la presencia de
Staphylococcus aureus.

PROCEDIMIENTO

► La siembra se realiza en superficie, por estría. Debido al potente efecto
inhibidor de este medio debe sembrarse masivamente.

INCUBACIÓN

► Hasta 3 días a 37° C.

INTERPRETACION

Con halo amarillo luminoso y Manitol – positivo:
crecimiento intenso Stafilococcus aureus.
Sin cambio de color: Crecimiento Manitol – negativo: Staphylococcus
leve, casi siempre epidermis y otros.



AGAR SALMONELLA – SHIGUELLA (SS)


► El Agar es un medio altamente selectivo, que inhibe el desarrollo de la
mayoría de los coliformes y permite el crecimiento de especies de
Salmonellla y Shigella en muestras ambientales y clínicas.
► La alta concentración de sales biliares y citrato de sodio inhibe a todas las
bacterias Gram positivas y a muchas Gram negativas, incluyendo las
coliformes.

► La lactosa es el único hidrato de carbono y el rojo neutro detecta la
producción del ácido.
► El Tiosulfato de sodio es una fuente de azufre.
► Las bacterias que producen (H2S) se detectan, por el precipitado negro
formado con el citrato férrico (relativamente insensible).


► Las colonias fermentadoras de
lactosa se tornan rojas.
► Raras cepas de Salmonella (cepas
de Arizona) fermentadoras de
lactosa, pueden simular Escherichia
coli.

► El desarrollo de especies de
Salmonella traduce colonias
incoloras con centro negro debido, a
la producción de H2S
► Las especies de Shiguella muestran
Inhibición variable y sus colonias
incoloras no presentan
ennegrecimiento.
SALMONELLA

AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)


► Las sales biliares en concentraciones relativamente bajas, hacen a este
medio menos selectivo que otros.

► Puede haber producción de ácido a partir de tres hidratos de carbono y el
rojo de fenol es el indicador del pH

► Las cepas de Salmonella enteritidis, forman colonias iniciales amarillas por
utilización de xilosa y colonias tardías rojas por descarboxilación de lisina.




► La Escherichia coli, especies de
Klebsiella y Enterobacter pueden
utilizar más de un hidrato de
carbono y formar colonias color
amarillo brillante.

► Las colonias de muchas
especies de Proteus son también
amarillas.

► La mayor parte de Salmonellas
forman colonias rojas, la mayoría
con centro negro por el gas H2S.
► Los géneros Shiguella y
Providencia y muchas especies
de Proteus no utilizan ningún
hidrato de carbono y forman
colonias traslúcidas. SALMONELLA
► Las colonias de Citrobacter son amarillas con centro negro, las de muchas
especies de Proteus son amarillas o traslúcidas con centro negro; las de
Salmonella son rojas con centro negro.

AGAR TCBS (AGAR SELECTIVO PARA VIBRIO): FUNDAMENTO

► Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el medio
fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis del
buey y el colato inhiben sobre todo, a los enterococos. Solamente algunas
cepas de Proteus sacarosa positiva pueden formar colonias amarillas
semejantes a la de los vibriones.
► El indicador mixto de azul de timol – azul de bromotimol presenta un claro
viraje a amarillo por la formación de ácido incluso en medio fuertemente
alcalino.
EMPLEO DEL AGAR

► Sembrar las placas en superficie, por estría, con el material objeto de
investigación o con el procedente de un cultivo de enriquecimiento.

INTERPRETACION
COLONIAS MICROORGANISMOS
Planas de 2 –3 mm de Vibrio cholerae
diámetro, amarillas Vibrios tipo El Tor.
Pequeñas, con el centro Vibrio parahaemolyticus
verde azulado
Grandes amarillas Vibrio alginotycus
Azules Pseudomonas, aeromonas y otros
Diminutas, transparentes. Enterobacterias y otros.



TCBS Agar - Vibrio chol. eltor ogava

MEDIO DE CULTIVO LOWENSTEIN – JENSEN: FUNDAMENTO

► Para la demostración y ensayo de
resistencia de bacterias de la
tuberculosis, según Lowenstein
modificado por Jensen.

PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA

► Sembrar masivamente el medio de
cultivo, por estría, en superficie. Cerrar Mycobacterium tuberculosis
herméticamente los tubos.

INCUBACION

► Hasta las 12 semanas a 37°C

INTERPRETACION

► Al cabo de 10 a 14 días y después semanalmente se inspecciona el medio
de cultivo en cuanto al crecimiento de cultivos.

MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN

AGAR CITRATO DE SIMMONS: PRINCIPIO

► La utilización del citrato por una bacteria se detecta en este medio mediante
la formación de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un
anión, como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente
de nitrógeno.
► Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de
la sal de amonio con producción de amoniaco (NH3+), llevando a la
alcalinización del medio por conversión del NH3+ en hidróxido de amonio
(NH4OH). El azul de bromotimol es amarillo a un pH menor de 6 y azul a un
pH mayor de 7.6.



TECNICA

► Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento
primario e inocularla en una sola estría en el pico del agar citrato. Incubar a
35°C durante 24 a 48 horas.

INTERPRETACION
CITRATO NEGATIVO
► El desarrollo de un color intenso en 24 a 48
hs. indica una prueba positiva y revela que el
organismo en estudio ha sido capaz de utilizar
el citrato contenido en el medio, con la
formación de productos alcalinos.

► La prueba es también positiva en ausencia de
color azul sí existiera un desarrollo visible de
colonias a lo largo de la estría de inoculación.

► La interpretación positiva a partir del desarrollo
en la línea de siembra se puede confirmar
incubando el tubo durante 24 horas más, en
que usualmente aparece un color azul. CITRATO POSITIVO

AGAR LISINA HIERRO (LIA): FUNDAMENTO

► Agar de ensayo para la demostración
simultánea de lisina decarboxilasa
(LD) y de la formación de hidrogeno
sulfurado (H2S) para la identificación
de enterobacterias, sobre todo de
Salmonellas y Arizona.

► La lisina puede ser descarboxilada
por microorganismos LD positivas
que la transforman en la amina
cadaverina.

► Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,
puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a
6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de
cultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede
utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa.

► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro
de hierro producido.



PROCEDIMIENTOS

► Este medio nutritivo se siembra con el cultivo puro sometido a ensayo, tanto
por estría sobre la superficie inclinada como por punción central en la
columna vertical subyacente.

INTERPRETACION

COLOR DEL MEDIO DE CULTIVO
MICROORGANISMOS FORMACIÓN DE H2S
Columna Superficie - inclinada
Arizona Violeta Violeta +
Salmonella Violeta Violeta +
Proteus mirabilis Amarillo Pardo rojizo +
Proteus vulgaris Amarillo Pardo rojizo +
Proteus morgani Amarillo Pardo rojizo -
Proteus rettgeri Amarillo Pardo rojizo -
Providencia Amarillo Pardo rojizo -
Citrobacter Amarillo Violeta +
Escherichia Coli Amarillo Violeta -
Shiguella Amarillo Violeta -
Klebsiella Violeta Violeta -

AGAR TRES AZUCARES HIERRO (TRIPLE SUGAR IRON AGAR – TSI):
FUNDAMENTO

► La degradación del azúcar con formación de ácido se manifiesta por un
cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a
amarillo o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización.
► El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a ácido sulfhídrico, el cual
reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro.

INCUBACION

► Hasta 48 horas a 37 °C



INTERPRETACION

SUPERFICIE FORMACIÓN De H2S
BACTERIAS
VERTICAL INCLINADA
+ Solo en la parte superior de la
columna vertical, frecuente
S. typhi S OA
formación de anillo eventualmente
sólo al cabo de 48 horas.
S. paratyphi A SG OA -
S. cholerae suis SG OA -
S. pullorum SG OA +
S. paratyphi B SG OA +- Columna
S. typhimurium SG OA + No -
S. enteritidis SG OA + vertical
S. gallinarium S OA + Negra
Escherichia coli SG SG -
Citrobacter SG SG +
Klebsiellla SG SG -
Proteus vulgaris SG** SG** + - Verde
Pr. Mirabilis SG** SG** + Negrusco
Pr. Morganii SG** SG** - Sucio
Pr. Rettgeri S (A) S (A) -
Kleb. pneumoniae S/SG S/SG -
Pse. aeruginosa OA OA*
Alcalige. faecalis OA OA* -

EXPLICACION DE LETRAS Y SIGNOS UTILIZADOS EN EL CUADRO

A = Viraje a rojo, por formación de álcali
OA = Sin alteración del color original del medio de cultivo, o rojo por formación de ácido.
S = Viraje a amarillo, por formación de ácido
SG = Viraje a amarillo y formación de gas.
+ = Ennegrecimiento, por formación de H2O
- = Ausencia de ennegrecimiento
* = Eventualmente, también formación de pigmento
** = Muchas cepas eventualmente sin formación de gas.
*** = Cultivado en Agar Kliger: OA


Guía Micro 2010-II

Más contenido relacionado

La actualidad más candente (20)

Destacado (15)

Similar a Guía Micro 2010-II (20)

Más de hector alexander (20)

Último (20)

Guía Micro 2010-II