Guía:técnica del ADN recombinante
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El documento describe un experimento educativo sobre la creación de ADN recombinante utilizando enzimas de restricción y plásmidos. Los estudiantes aprenderán a manipular secuencias de ADN para insertar un gen de interés, como el de la insulina, en un plásmido bacteriano. Incluye instrucciones detalladas sobre los materiales y pasos necesarios para realizar el proceso de ingeniería genética.
Guía:técnica del ADN recombinante
- 1. SFC Prof. Gustavo Toledo C. TÉCNICA DE ADN RECOMBINANTE Objetivo: Los estudiantes modelarán el proceso usando enzimas de restricción y plásmidos para formar ADN recombinante INFORMACIÓN: Las principales herramientas de la tecnología de DNA recombinante son enzimas bacterianas llamadas enzimas de restricción o endonucleasas de restricción. Cada endonucleasa reconoce una secuencia corta y específica de nucleótidos en moléculas de DNA y cortan la “columna vertebral” de las moléculas en esa secuencia. El resultado es un sistema de fragmentos de DNA de doble hebra con los "extremos pegajosos." Los extremos pegajosos no son realmente pegajosos; sin embargo, las bases nitrogenadas en los extremos pegajosos se unen con las bases complementarias en otras moléculas de DNA. Así, los extremos pegajosos de los fragmentos de DNA se pueden utilizar para unir pedazos de la DNA originados de diversas diferentes especies. Para ser útiles, las moléculas de DNA recombinante tienen que ser hechas para replicarse y para funcionar genéticamente dentro de una célula. Un método para hacer esto es utilizar DNA del plásmido de bacterias. Los fragmentos pequeños del DNA se pueden insertar en los plásmidos, que luego se introducen en las células bacterianas. A medida que las bacterias se reproducen, también lo hace el plásmido recombinante. El resultado es una colonia bacteriana en la cual se ha reproducido el gen deseado. Materiales Para cada grupo: • Secuencia de bases del plásmido • Secuencia de bases de DNA (gen deseado) • Enzimas de restricción • Tijeras • Cinta adhesiva • Lápiz • Papel
- 2. SFC Prof. Gustavo Toledo C. Instrucciones 1. Corte las 4 tiras del plásmido a lo largo de las líneas punteadas. Luego pegue las 4 tiras en cualquier orden formando una sola tira larga (todas las letras deben quedar en la misma dirección cuando pegue las tiras). Los dos extremos de la tira deben pegarse por sus extremos formando un plásmido circular, teniendo cuidado de que el código genético quede por el lado de afuera del plásmido. 2. Corte a lo largo de las punteadas la secuencia de DNA y péquelas para formar una tira larga. Los pedazos se deben pegar en el orden indicado en la parte inferior de cada tira. 3. A continuación corte las tarjetas que representan las enzimas (endonucleasas) de restricción. Note que las tarjetas de cada enzima tiene ilustrada una secuencia corta de DNA que muestre la secuencia que corta cada enzima en particular. 4. Compare la secuencia de pares de bases de una tarjeta-enzima con las secuencias de los pares de base del plásmido. Si encuentran la misma secuencia de pares de bases en la tarjeta- enzima y la tira del plásmido, deben marcar la localización en el plásmido con un lápiz y escribir el número de la enzima en el área marcada. Deben hacer esto para cada tarjeta- enzima. Es probable que notes que algunas secuencias de enzimas pueden que no tengan una secuencia correspondiente en el plásmido y que algunas secuencias enzimáticas pueden tener más de una secuencia correspondiente en el plásmido. 5. Una vez que hayas identificado todas las correspondientes secuencias de las enzimas en el plásmido, identifica a aquellas enzimas que cortan el plásmido solamente una vez. Desechen cualquier enzima que corte el plásmido en la secuencia sombreada, pues esta corresponde a la secuencia de replicación. Deben registrar sus resultados en un pedazo de papel separado. 6. Compara las enzimas que te servirán para cortar el plásmido con la tira de DNA humano. Trata de hallar alguna enzima que haga dos cortes en el DNA, uno sobre la secuencia sombreada del gen de la insulina y uno debajo de la secuencia sombreada del gen de la insulina. Marquen las áreas, que cada enzima cortará, en la tira de DNA. 7. Después que hayan comparado cada enzima con la tira de DNA, seleccione una enzima para hacer los cortes. Su objetivo es cortar el filamento de DNA lo más cerca posible a la secuencia del gen de la insulina sin llegar a cortar la secuencia del gen. Hagan cortes en el plásmido y en las tiras de DNA. Deben hacer los cortes de manera escalonada indicada por la línea negra en la tarjeta-enzima. 8. Pegue los extremos pegajosos del plásmido a los extremos pegajosos del gen de la insulina para crear su DNA recombinante. PREGUNTAS DE DISCUSIÓN 1) ¿Por qué es importante encontrar una enzima que corte el plásmido en solo un sitio? ¿Qué podría suceder si el plásmido fuese cortado en más de un sitio? 2) ¿Por qué es importante desechar enzimas que pudiesen cortar el plásmido en el sitio de la réplica? 3) ¿Por qué puede ser importante cortar el filamento del DNA tan cerca como sea posible del gen deseado? 4) En esta actividad, usted incorporó un gen de la insulina en el plásmido. ¿Cómo será utilizado el nuevo DNA del plásmido para producir la insulina? 5) ¿Por qué la técnica se llama "ADN recombinante"? 6) ¿Por qué se llaman "extremos pegajosos" si la unión que permite reconstituir al plásmido se basa en los mismos puentes de hidrógeno que forman el resto de la doble hebra de ADN? 7) Enzimas que modifican al DNA, tales como las enzimas de restricción, han sido descubiertas y aisladas de células vivas. ¿Qué funciones crees que tienen ellas en las células? 8) ¿Qué característica en particular tienen las enzimas de restricción que la hacen eficiente para trabajar en esta técnica?
- 3. SFC Prof. Gustavo Toledo C. a. Responde verdadero o falso según corresponda. Justifica tus respuestas FALSAS. 1. Las enzimas de restricción reconocen secuencias de nucleótidos en el ADN. 2. La única técnica empleada para originar fragmentos de ADN es la que se basa en la utilización de enzimas de restricción. 3. Las enzimas de restricción rompen la doble hélice del ADN en lugares específicos o cerca de ellos. 4. Los fragmentos de ADN pueden ser incorporados a plásmidos o virus que actúen como vectores. 5. Los plásmidos extracromosómicos no son vehículos corrientes utilizados para clonación. 6. Las enzimas de restricción ofrecen la posibilidad de segmentar el ADN en trozos y ordenarlos en forma secuencial. 7. Escherichia coli es la única bacteria que produce enzimas de restricción. 8. Las bacterias producen enzimas de restricción para degradar el material genético extraño que entre en la célula. 9. Las enzimas de restricción actúan sobre cualquier tipo de molécula. b. Ordenar la secuencia de hechos que se emplean en ingeniería genética: • Transferencia del vector con el ADN de interés (vector recombinante) a una célula en donde se replique, proceso llamado “transformación” de la célula huésped. • Generación de un fragmento o fragmentos de ADN que han de utilizarse o manipularse. • Selección de aquellas células que llevan las moléculas de ADN recombinante deseado, y su replicación como clones. • Empalme de los fragmentos de ADN formando una molécula compuesta, ADN recombinante, que puede actuar como vector, o ser incorporado en un vector para su posterior transmisión. Ordénala aquí:
- 4. SFC Prof. Gustavo Toledo C.
- 5. SFC Prof. Gustavo Toledo C. ADN del Plásmido. La secuencia de ADN con el gen de la insulina (área más óscura) replicación es el área más oscura.
- 6. SFC Prof. Gustavo Toledo C. ADN del Plásmido. La secuencia de ADN con el gen de la insulina (área más óscura) replicación es el área más oscura.