Manual practico de_microbiologia_i

Manual Práctico de
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL I

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Manual de Microbiología Ambiental (2007)

MANUAL PRÁCTICO DE
MICROBIOLOGÍA
Cátedra de Microbiología Ambiental I

Departamento de Ciencias del Ambiente
Área Saneamiento – Orientación Tratamientos

Autores:
MANACORDA, Ana María
CUADROS, Daniela Patricia
ALVAREZ, Anahí

Universidad Nacional del Comahue - Escuela Superior de Salud y Ambiente
Buenos Aires 1400- Neuquén Capital
2ª Edición: 2007

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Indice de Capítulos

Capítulo 1. BIOSEGURIDAD......................................................................................4
Capítulo 2. PRESENTACIÒN DE MATERIALDE LABORATORIO............................12
Capítulo 3. MICROSCOPÍA........................................................................................17
Capítulo 4. COLORACIONES.....................................................................................21
Capítulo 5. ESTERILIZACIÒN POR CALOR...............................................................28
Capítulo 6. MEDIOS DE CULTIVO..............................................................................35
Capítulo 7. AISLAMIENTO Y SIEMBRA.......................................................................41
Capítulo 8. RECUENTO DE MICROORGANISMOS....................................................49
Capítulo 9. MICOLOGÍA ..............................................................................................56
Capítulo 10. PARASITOLOGÍA...............................................................................64
Capítulo 11. PROTISTAS..............................................................................................68

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CAPÍTULO 1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
(Teórico- Práctico)

1.1 INTRODUCCIÓN
En el laboratorio, al igual que en la cocina de cualquier casa, nos enfrentamos a algunos
peligros que debemos considerar para disminuir los riesgos de accidentes. Podríamos
clasificar a estos riesgos en Riesgos Biológicos (virus, bacterias, clamidias, rickettsias,
parásitos u hongos) y en No Biológicos. Estos últimos incluyen los riesgos químicos (p.e.
uso de lavandina y solventes inflamables o cáusticos), físicos (p.e. cortaduras), eléctricos
(p.e. descargas eléctricas por enchufes o cables en mal estado) y el fuego (p.e.
quemaduras), que son comunes a otros laboratorios.
El estudio de los microorganismos que pueden ser patógenos para el hombre, los animales u
otras formas de vida, trae consigo ciertos riesgos que varían según el agente infeccioso y los
procedimientos utilizados.
En 1988, se creó la Comisión de Bioseguridad de la Asociación Argentina de
Microbiología, para colaborar en la solución de problemas relacionados con la manipulación
de microorganismos, material biológico y/o genético. Dicha comisión se encuentra integrada
por profesionales que desarrollan su actividad, en ámbitos diversos como hospitales,
universidades y centros de investigación.

1.2 SEGURIDAD BIOLÓGICA
Las Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo
relacionado con la manipulación de material peligroso, y su rigurosidad varía con la
peligrosidad de los agentes.
La seguridad biológica se fundamenta entonces en tres elementos:
• Técnicas de Laboratorio. Se refieren a todas aquellas prácticas y técnicas
microbiológicas que se realizan dentro y fuera del laboratorio. Un buen seguimiento de
las mismas ayuda a contener los riesgos biológicos. Como práctica de mayor importancia
se encuentra el desarrollo o adopción por parte de cada laboratorio de un Manual de
Seguridad Biológica en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y
que especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como así
también las responsabilidades.
• Equipo de seguridad (Barreras Primarias). Se incluyen en este apartado tanto
dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de
seguridad biológica), como las prendas de protección personal (guantes, mascarillas,
batas, calzado, etc.).
• Diseño y Construcción de la Instalación (Barreras Secundarias). La magnitud de las
barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso que se manipule en el
laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas donde tiene acceso el
público, la disponibilidad de sistemas de decontaminación (autoclaves), filtrado del aire
de salida al exterior, flujo de aire direccional, etc.
El equipamiento y el diseño del laboratorio de microbiología contribuyen a la seguridad sólo
si las personas que trabajan en él están motivadas, conocen las normas de seguridad y las
aplican. La actitud y el modo de proceder de sus trabajadores determinan su propia
seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad.

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El riesgo puede ser alto o muy limitado y depende de la motivación del personal, de De
la infraestructura y de la metodología. nad
a
sirven la mejor ingeniería sanitaria, un óptimo diseño arquitectónico o la tecnología más
avanzada si el personal desconoce o incumple las medidas establecidas para su seguridad.
La formación es la clave de la eficacia de los programas de seguridad y ésta debe ser
facilitada a todas las personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio: personal del
laboratorio, de mantenimiento, de limpieza, etc.

Para disminuir los riesgos es importante mantener buenos hábitos de trabajo,
respetar las normas de seguridad y conocer los peligros potenciales dentro del
laboratorio.

1.3 EL FACTOR HUMANO EN LA PREVENCIÓN DE ACCIDENTES
Un accidente puede ocurrir por diferentes causas, pero “casi siempre, se deben a errores
humanos y pueden ser evitados”. Por ello, es que debe tenerse especial atención en
aquellos factores humanos que intervienen en la prevención de accidentes:
• Prestar atención a los estados de ansiedad, irritabilidad y apresuramiento.
• Reflexionar sobre las actitudes de negación ante situaciones de riesgo.
• Considerar que las crisis de cambio pueden ser un factor específico en la producción de
accidentes.
• Detenerse a investigar un accidente menor como predecesor de otro de mayor
importancia.
• Detectar el desplazamiento de las crisis a las actividades laborales.
• Estar alerta frente a situaciones de crisis familiares y/o laborales.
• Atender los estados de tensión que genera la rutina.
Una vez ocurrido el accidente su consecuencia varía según su gravedad, por ello es
importante que el accidente no ocurra, dado que pueden ser evitados.
El riesgo de que se produzca un accidente puede disminuirse a niveles muy bajos siempre y
cuando se tenga en cuenta que se debe:
• Conocer los elementos de riesgo.
• Conocer la forma de manejarlos.
• Contar con los elementos necesarios para aplicar técnicas que disminuyan los riesgos.
• Aceptar consejos de aspectos técnicos, de personas con experiencia en el trabajo de
laboratorio.
• Transmitir dichos aspectos a quienes recién ingresan al laboratorio.
• Exigir de los superiores la implementación de medidas de protección.
• Restringir el acceso de visitantes.
Si a pesar de todo lo antes expresado, el accidente igual ocurre, es muy importante
saber lo que se debe hacer y a quién hay que recurrir para comenzar en forma
inmediata una tarea de reparación.

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1.4 ELEMENTOS DE RIESGO. HÁBITOS DE HIGIENE
1.4.1 Manos: En algunos aspectos, son como las patas de las moscas, tocan la suciedad,
las fuentes de infección y sin que tengamos una noción clara de sus movimientos, las
llevamos a la boca o a los ojos que son, a su vez, la puerta de entrada de muchas
infecciones. Cuando estamos trabajando en un laboratorio, tenemos que cambiar
ciertas costumbres, como la de llevarnos lápices a la boca, ya que normalmente se
dejan en cualquier lugar pudiéndonos infectar con cualquier microorganismo allí
presente.
Un paso importante en la protección de nuestra salud es aceptar e incorporar en
nuestras prácticas la “Regla de los 4 NO” (o primer regla de oro de la bioseguridad),
en ella se destaca que en el laboratorio se debe:
• No fumar
• No comer
• No beber
• No maquillarse
Para realizar estas acciones deben existir espacios destinados a tal fin, como así
también para elementos de oficina y lectura.
Como una práctica diaria y en forma repetida, deben lavarse las manos con jabón
(preferentemente líquido), cuantas veces sea necesario. Dado que las manos son
susceptibles de recibir pinchazos, heridas y abrasiones, para realizar algunas tareas
conviene utilizar guantes, dado que la posibilidad de que lo anterior ocurra se
encuentra muy disminuida. Dos prácticas son necesarias cuando utilizamos guantes, el
lavado con jabón y el sacárselos cuando se vayan a realizar otras tareas diferentes a
las que estamos realizando, como por ejemplo, levantar el tubo del teléfono, luego de
trabajar.
1.4.2 Cabello: Es conveniente usarlo corto o recogido durante el trabajo.
1.4.3 Uso de ropa protectora: el uso de guardapolvo impide daños mayores, por ejemplo
salpicaduras con material infeccioso o contaminado. Esta ropa debe ser higienizada
periódicamente y permanecer siempre dentro del área del laboratorio.
1.4.4 Protección de ojos. Cuando se trabaja con sustancias corrosivas, es conveniente usar
anteojos protectores o máscaras para disminuir el riesgo de lesionar la córnea con
salpicaduras o por exposición a vapores químicos. Es importante trabajar bajo
campana, al manipular solventes, como así también tener a mano soluciones y
dispositivos especiales para el enjuague de los ojos.
1.4.5 Otras protecciones. En las operaciones comunes del laboratorio se generan
aerosoles y dado que la mayoría de las bacterias y virus tienen como puerta de entrada
al organismo la vía aérea, hay que evitar la producción de éstos y es necesario usar
máscaras de protección. Debe evitarse el pipeteo directo con la boca, por ello es
conveniente usar aquellos dispositivos apropiados como lo son las pipetas
automáticas, las propipetas (peras de goma), dispensadores, etc.

Otra regla importante, considerada la segunda regla de oro de la bioseguridad es
“Considerar que toda muestra es potencialmente peligrosa y tratarla como tal”.

1.5 OTRAS RECOMENDACIONES:
• Poteger de sobrecargas los circuitos eléctricos, usando disyuntores y polos a tierra.

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• Utilizar una toma a tierra en la instalación eléctrica interior.
• Usar tomacorrientes simples en lugar de tomas múltiples.
• Colocar los interruptores y disyuntores en lugares accesibles.
• Usar calefactores con válvula de seguridad.
• Revisar periódicamente los matafuegos.
• Mantener los corredores y pasillos libres de obstáculos que puedan entorpecer las salidas.
• Controlar las plagas y artrópodos.
En general la labor del microbiólogo en el laboratorio, consiste en aislar e identificar
microorganismos que, en algunos casos, pueden resultar patógenos. Para aislar el
microorganismo de interés, se debe trabajar con elementos estériles (ansas, medios de
cultivo, recipientes, etc.) y manipular las muestras con sumo cuidado, como potenciales
vehículos de microorganismos patógenos.
En el laboratorio docente, se deben tomar las medidas mínimas de bioseguridad y éstas
deberán extremarse cuando se trabaje con microorganismos potencialmente letales.

1.6 PRECAUCIONES EN EL MANEJO DE MATERIAL BIOLÓGICO:
• Tratar de realizar las operaciones dentro de una cabina de seguridad biológica.
• Reducir al mínimo la producción de aerosoles.
• Utilizar dispositivos mecánicos para el pipeteo.
• Tener en el laboratorio desinfectantes para piel y mesadas.
• Colocar el material contaminado en recipientes con tapa, para esterilizarlos antes del
lavado.
• Esterilizar o incinerar el material contaminado antes de su eliminación.
CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPOS DE RIESGO
Según la peligrosidad de los microorganismos infectantes, existe una clasificación por
grupos de riesgo:
• Agente Biológico del Grupo I. Es aquél que resulta poco probable que cause una
enfermedad en el hombre y en la comunidad.
• Agente Biológico del Grupo II. Es aquél que puede causar una enfermedad en el
hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable
que se propague a la comunidad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento
eficaz.
• Agente Biológico del Grupo III. Aquél que puede causar una enfermedad grave
en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, pudiendo causar la
muerte con riesgo de que se propague a la comunidad y existiendo frente a él
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
• Agente Biológico del Grupo IV. Aquél que causando una enfermedad grave en el
hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas posibilidades
de que se propague a la comunidad y sin que exista generalmente frente a él
profilaxis o tratamiento eficaz.

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Se suelen describir cuatro niveles de contención1 o de seguridad biológica, que surgen de la
combinación, en mayor o menor grado de:
• Técnica microbiológica empleada,
• Equipo de seguridad,
• Diseño de instalación.
Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las
vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio.

CLASIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS SEGÚN SU NIVEL DE SEGURIDAD BIOLÓGICA
Nivel 1. Microorganismos no patógenos para el hombre.
Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo I, es decir, los
que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y
estable a los antimicrobianos. Es el habitualmente utilizado en los laboratorios de
prácticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas.
Se debe trabajar en condiciones mínimas de asepsia y esterilidad. Ejemplos típicos son
Escherichia coli, como así también todos aquellos microorganismos que se utilizan en
la industria alimenticia, para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc.
Nivel 2. Microorganismos y procedimientos de riesgo moderado.
En él se trabaja con agentes del grupo II, como así también con algunos que,
perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patología
infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por
personal especializado y son los que con más frecuencia se estudian en laboratorio de
microbiología clínica: Salmonella typhi, Mycobacterium tuberculosis, Virus de la
Hepatitis B, etc.
Otros aspectos que se deben considerar en este nivel son:
- El área de riesgo debe restringirse al personal, no permitiéndose el acceso a
personas que tengan aumentado, por alguna causa, el riesgo de infección (Ej:
inmunosuprimidos).
- En el acceso al laboratorio figurarán señales de riesgo biológico, condiciones de
ingreso y responsables del mismo (nombre, teléfono y domicilio).
- El personal debe estar vacunado (si correspondiera) y entrenado para prevenir
accidentes y actuar correctamente en caso de que ocurriere.
- Control permanente de roedores e insectos.
- Uso de guardapolvo en el área de trabajo exclusivamente (considerar que el
guardapolvo es potencialmente un elemento contaminante).
- Evitar el uso de jeringas o cualquier otra práctica que genere aerosoles.
“Las muestras deben tratarse siempre como potencialmente infectadas y tenerse en
cuenta las precauciones citadas.”
Nivel 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos de riesgo moderado
En este nivel se trabaja con agentes biológicos del grupo III, microorganismos que
causan patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden dejar secuelas y
ocasionalmente producir la muerte, en cuya manipulación se aplican procedimientos de
1
El término contención se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales
infecciosos en el laboratorio, su propósito es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, otras
personas y el entorno a agentes potencialmente peligrosos.

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trabajo, que implican alto riesgo de infección. El mayor y más frecuente peligro que
entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos.
Por ello las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la
utilización de cabinas de seguridad (incluidas las medidas de los niveles anteriores
como las condiciones mínimas de asepsia y esterilidad, además del uso de batas,
máscaras, respiradores, guantes, etc.). En los laboratorios de microbiología clínica los
ejemplos más típicos de este tipo de microorganismos son el Virus de la fiebre de
Lassa, Brucella spp, Histoplasma capsulatum, etc.
Solo pueden ser procesados por personal calificado, por ello se debe restringir el
acceso al personal del laboratorio y llevar un registro de las visitas, del personal de
servicio y de accidentes. La infraestructura apropiada para el nivel de contención 3,
incluye, además, aire acondicionado independiente, sin recirculación, con gradiente de
presión, entre otras. Periódicamente se tomarán muestras de sangre a todo el
personal.
Nivel 4: Microorganismos exóticos y/o altamente peligrosos y procedimientos de alto
riesgo.
Este nivel se requiere cuando se procesa con certeza y se sospecha un agente
especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no, que produce alta mortalidad
y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Normalmente son
microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel también puede
utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados con
microorganismos del grupo IV.
Debe trabajarse en laboratorios especiales de máxima seguridad (contención máxima),
en los que es necesario ducharse y cambiarse de ropa tanto a la entrada como a la
salida del mismo y en donde existen barreras de aire con el exterior. El manejo del
material limpio y contaminado se realiza por canales altamente controlados.
Ejemplos de este nivel son el virus Junín, virus Ébola, el virus de la fiebre aftosa, el
virus del HIV, el Machupo y el Marburg. Además, deben incluirse en este nivel de
contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieren propiedades
patógenas que los elevan al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis
multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico.

En general, la naturaleza infecciosa del material clínico es desconocida y al Laboratorio de
Microbiología suelen remitirse muestras muy diversas. Es responsabilidad del Jefe del
laboratorio, el establecimiento de prácticas normatizadas que de forma realista permitan su
manipulación.
Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir básicamente cuatro
elementos:
• un huésped susceptible,
• un agente infeccioso,
• una concentración suficiente de éste y
• una ruta de transmisión apropiada.
De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisión.
Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculación directa,
muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutánea y el contacto directo con
la piel o las mucosas también son posibles.

1.7 BIBLIOGRAFÍA

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- Manual de bioseguridad para técnicos de laboratorio. Celia E. Coto y colaboradores,
publicación de la Asociación Argentina de Microbiología, 1992
- Recomendaciones sobre seguridad y bioseguridad para el laboratorio clínico y
hospitalario, Nidia Lucero, Comisión de Bioseguridad de la Asociación Argentina de
Microbiología, marzo 1994.
- Bioseguridad en laboratorio, V Congreso Argentino de Microbiología, Noviembre de 1988,
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana, Suplemento N°4, 1988.
- Bioseguridad en laboratorio II, V Congreso Argentino de Virología, Octubre de 1990,
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana, Suplemento N°1, 1990.
- Manual de Bioseguridad en Laboratorio, Organización Mundial de la Salud, 1983.
- Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2a edición. Ed. Masson,
Barcelona, 1999

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1.8 Anexo
Figura 1.1 Tipos de Cabinas de Seguridad, según nivel de peligrosidad de los agentes
biológicos

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CAPITULO 2
PRESENTACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO

2.1. OBJETIVOS
• Reconocer y manejar el material de uso común en el laboratorio de microbiología.
• Tomar conciencia y aplicar las reglas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.

2.2. INTRODUCCIÓN
Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico, el laboratorio de microbiología
requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología, como la siguiente
(ver Figura 2.1):

2.2.1. Tubos de ensayo: destinados a conservar medios de cultivo en pequeños
volúmenes. Se utilizan tubos de vidrio de diversos tamaños, con tapa a rosca o a
presión. El vidrio debe ser de buena calidad, neutro, transparente e inalterable a los
tratamientos.
2.2.2. Placas de Petri: cajas de vidrio de sección circular, con tapa. Existen de diferentes
tamaños según su uso, aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de
diámetro.
2.2.3. Pipetas graduadas: para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un
tapón de algodón en el extremo superior, de manera de impedir que el operador
aspire líquidos potencialmente contaminados, o que contamine el medio de cultivo al
aspirarlo. Se utilizan para realizar inoculaciones y diluciones.
Para manejar pequeños volúmenes (menores de 1 ml) se recomienda el uso de
pipetas automáticas que miden exactamente el volumen deseado (500, 150, 50 Ul
etc.); en el extremo se colocan puntas o tips estériles que se reemplazan cuando se
desea.
2.2.4. Pipetas Pasteur: son tubos de vidrio terminados en capilar. Se usan para transportar
pequeños volúmenes de líquido o para sembrar a partir de medios de cultivo líquidos.
2.2.5. Espátula de Drigalsky: Se construye con una pipeta Pasteur larga o con una varilla
de vidrio. Se calienta el extremo en la llama del mechero y se dobla en ángulo recto
unos 4 cm, esta última porción se dobla nuevamente del mismo modo. Se utiliza para
distribuir una muestra líquida que se siembra sobre la superficie de un medio de
cultivo sólido.
2.2.6. Mango o cabo de Koll: sirve para sujetar al ansa, aguja o espátula de platino o
aleaciones metálicas de lenta oxidación y rápido enfriamiento. Esta compuesto por un
mango de un material aislante, que se prolonga en un vástago metálico que sostiene
mediante una tuerca un alambre. Cuando el extremo del alambre tiene forma de
anillo se denomina ansa; si se deja el extremo recto se llama aguja y si se dobla en
ángulo recto al extremo libre se lo llama gancho.
2.2.7. Marcador permanente al solvente: son marcadores resistentes al agua, se utilizan
para marcar o escribir sobre superficies de vidrio.

2.2.8. Portaobjetos: lámina rectangular de vidrio incoloro de 2,5 cm x 7,5 cm y
aproximadamente 1 cm de espesor. Se utilizan para hacer observaciones
microscópicas de los microoganismos, ya sea en fresco o fijados.

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2.2.9. Portaobjetos excavados: se utilizan para realizar exámenes con gota pendiente,
para ello presentan una depresión de unos 10 a 12 mm de diámetro. En este caso el
material a observar es una gota de líquido suspendido.
2.2.10. Cubreobjetos: pequeñas láminas de vidrio transparente, de poco espesor (0,11 a
0,23 mm), usados para cubrir los preparados realizados sobre el portaobjetos para su
posterior observación microscópica.
2.2.11. Tubos o “campanitas” de Durham: pequeños tubos (de unos 5x30 mm) que son
colocados en forma invertida dentro de los tubos de ensayo que contienen medio de
cultivo líquido, sirven para verificar la producción de gas por parte de los
microorganismos.
2.2.12. Erlenmeyer: se utilizan para preparar los medios de cultivo, o para el desarrollo de
microorganismos en medio líquido con agitación o aireación.
2.2.13. Otros elementos y aparatos: Al material citado debe agregarse por su uso
frecuente, mecheros y gradillas. Los aparatos más comúnmente usados en el
laboratorio de microbiología son: microscopios, lupas, autoclave, estufas de
esterilización y cultivo, baño termorregulable, balanzas, espectrofotómetro, centrífuga,
heladeras, etc.

2.3. NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
2.3.1. Todos los estudiantes deben usar guardapolvo durante las clases prácticas con el
objeto de proteger su ropa de posibles contaminaciones. Deben proveerse de
repasador, jabón de tocador, detergente, lavandina y marcador para vidrio.
2.3.2. Tener siempre a mano sobre la mesada: a) una probeta o similar llena con solución
desinfectante para introducir las pipetas luego de ser utilizadas; b) una olla o
recipiente metálico para colocar el material contaminado o sucio; c) mechero.
2.3.3. Lavarse las manos antes y después de trabajar.
2.3.4. Limpiar su sector de mesada con un algodón embebido en solución desinfectante.
Para ello se puede emplear bicloruro de mercurio, solución de formol al 2%, alcohol
50-70 grados, etc. (no corrosivas para la piel).
2.3.5. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patógeno, razón por la
cual hay que manejarlo siempre como si lo fuera.
2.3.6. Al recibir el cultivo NO LO DESTAPE, tome el tubo por su parte media apoyado sobre
la palma de la mano de manera de ver fácilmente el contenido y la inscripción que lo
identifica.
2.3.7. Cualquier accidente con los cultivos, como rotura de tubos sembrados, debe alarmar
lo suficiente como para subsanarlo, evitando la diseminación del material. Comunique
el hecho al personal de la cátedra.
2.3.8. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe
prevenirse la posibilidad de infección. Comunique el hecho al personal de la cátedra.
2.3.9. Realice las técnicas bacteriológicas al abrigo de las corrientes de aire, con
movimientos pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza
maniobras microbiológicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos.
2.3.10. Debe siempre llevarse el ansa al rojo antes y después de toda operación que se
realice con ella.
2.3.11. No deben depositarse los tapones sobre la mesada, para evitar contaminaciones de y
con los cultivos de trabajo.

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2.3.12. Los tubos con medio de cultivo, ya sean líquidos o sólidos, sembrados o no, deben
colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesada.
2.3.13. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para
luego ser esterilizados.
2.3.14. Tanto las placas como los tubos deben ser identificados con marcas o rótulos.
2.3.15. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos
destinados a tal fin.
2.3.16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia, completando
con dibujos.
2.3.17. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y picos de gas del
autoclave queden cerrados, así como las luces y los picos de agua, de manera de
evitar accidentes.
2.3.18. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE
CORRECTAMENTE TODA VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIÓN DE
UNA TÉCNICA.

2.4. LIMPIEZA Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL
El material que se emplea en microbiología debe estar perfectamente limpio y estéril. La
limpieza es importante ya que restos de sustancias que permanecen en los tubos, placas y
demás elementos, pueden impedir el posterior desarrollo de los microorganismos; la
esterilización es fundamental para evitar la presencia de microorganismos extraños o
contaminantes. Para ello el material deberá ser acondicionado de tal forma que mantenga
estas condiciones por tiempo indeterminado.
2.4.1. Tubos de ensayo. Para su uso deben estar perfectamente limpios. Si en ellos se ha
realizado algún cultivo deben esterilizarse previamente a su limpieza, para lo cual
deben colocarse boca abajo y sin tapón en un recipiente para favorecer que escurran
los medios de cultivo en ellos contenidos.
Se lava con agua caliente jabonosa o con detergentes neutros con la ayuda de
cepillos limpiatubos. Luego se enjuaga abundantemente con agua potable y
finalmente con agua destilada. Posteriormente se colocan en canastos u otros
recipientes para su escurrido y secado.
2.4.2. Placas de petri. Se las esteriliza y lava de la misma manera que se describió
anteriormente y se las coloca boca para abajo para su secado. Luego, cada caja con
su respectiva tapa, se envuelve individualmente en papel, realizándose un doblez con
el mismo en la parte superior para evitar que entre polvo hacia el interior. Luego
pueden envolverse de a grupos para garantizar la esterilidad ante una eventual rotura
del papel. Así preparadas se esterilizan en autoclave y se secan en estufa.
2.4.3. Pipetas. Para su uso deben estar limpias desengrasadas, estériles y secas.
Luego de ser utilizadas se deben colocar en probetas u otro recipiente destinado a tal
fin, que contenga solución desinfectante (hipoclorito, formol 4%, fenol 5%); se quita el
trozo de algodón colocado en la boquilla con un alambre. Se colocan luego en
solución de detergente para asegurar su limpieza. Se enjuagan primero con agua
corriente y luego con agua destilada, y posteriormente se secan.
Para volver a prepararlas se coloca en la boquilla un pequeño tapón de algodón lo
suficientemente ajustado como para aspirar con facilidad sin que se salga. Luego se
colocan en portapipetas metálicos o se envuelven individualmente, y luego en
paquetes, y posteriormente se esteriliza.

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2.4.4. Portaobjetos. Para lograr que estén limpios y desengrasados se los sumerge en
soluciones de detergentes en las que se hierven, luego se enjuagan y dejan secar.

2.5. PREPARACIÓN DE LA MEZCLA SULFOCROMICA.
En algunas ocasiones el uso de solución de detergente puede no ser suficiente para limpiar
correctamente el material, para lo cual se utiliza la MEZCLA SULFOCROMICA.
2.5.1. Drogas a emplear:
• dicromato de potasio
• ácido sulfúrico (grado técnico)
2.5.2. Material de vidrio:
• vaso de precipitados de 250 ml
• vaso de precipitados de 1000 ml
• varilla de vidrio
• cuba o recipiente en donde se preparará y almacenará la mezcla
• tapa para dicho recipiente
2.5.3. Indumentaria para la protección personal:
• guantes de goma
• delantal de tela
• delantal de goma encima del anterior
• antiparras
• barbijo
2.5.4. Soluciones requeridas en caso de accidentes:
• bicarbonato de sodio
• hidróxido de sodio
2.5.5. Preparación:
a) Pesar 30 g de dicromato de potasio en el vaso de precipitados de 250 ml, disolver
en un pequeño volumen de agua con ayuda de la varilla y colocar en la cuba.
b) Llenar el vaso de precipitados grande con ácido sulfúrico.
c) Colocar la cuba con el dicromato en una pileta en la que debe correr el agua, con
la tapa colocada de manera que permita seguir agregando el ácido.
d) Agregar el ácido de a pequeños volúmenes, evitando respirar los vapores que se
desprenden y cuidando que la cuba no se recaliente. Al finalizar la operación, tapar
totalmente la cuba.
e) En caso de que ocurra algún accidente, se debe volcar una buena cantidad de
bicarbonato de sodio (hasta que deje de formarse espuma) sobre la piel o prendas
de vestir. Sobre el material de vidrio, mesadas, piso, etc. volcar hidróxido de sodio
para neutralizar el ácido.

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Figura 2.1: Los instrumentos básico de uso corriente en el laboratorio de Microbiología son: a y b)
Tubo de ensayo con tubo o “campana” Durham, c) Placa de Petri, d) Pipeta graduada con tapón
de algodón, e) Pipeta Pasteur, f) Espátula de Drigalsky, g) Aguja, h)Ansa, i) Portaobjeto y j)
Erlenmeyer

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CAPITULO 3
3. MICROSCOPÍA

3.1. OBJETIVO
• Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio.
• Tomar conocimiento del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio
de Microbiología.

3.2. INTRODUCCIÓN
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y
para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el
Laboratorio de Microbiología para el estudio de la morfología y estructura de los
microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con otros
criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.
Además de la ampliación de la imagen, en microscopía, hay que tener en cuenta dos
factores más: el contraste y la resolución. Los objetos deben poseer un cierto grado de
contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio. Por
ello es que la mayoría de los organismos necesitan ser previamente teñidos para poder
distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma específica
distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales.
Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. La
tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram. Otras tinciones de gran importancia
son las que diferencian bacterias “ácido- alcohol resistentes”, las que diferencian estructuras
significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas.
Por otra parte, el grado de resolución (la capacidad para ver separados dos objetos
adyacentes muy próximos entre sí), depende de las características del sistema de lentes que
posea el microscopio. Éste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz emitida, el
índice de refracción del medio en el que se realiza la visualización y la apertura numérica del
objetivo.

3.3. EL MICROSCOPIO
El microscopio compuesto (ver figura 1.1) es aquel que dispone de dos o más lentes de
aumento. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico.
1) Soporte. Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto
movimiento. Sus principales partes son:
a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos
incorpora además, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo
luminoso.
b) Brazo. Soporta todo el sistema óptico, el cabezal portaoculares y el revólver
portaobjetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina
(movimiento de enfocado de la preparación).
c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su
observación.
d) El Macrométrico y el Micrométrico. Ambos permiten enfocar la preparación. El
primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menor

17

aumento (x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los
objetivos de mayor aumento (x40, x100).
2) Sistema Óptico. Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

FIGURA 3.1: MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO

3.4. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO
1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias: de no ser así,
límpielas cuidadosamente con papel especial para óptica. No tocar las lentes con los
dedos.
2) Coloque la preparación (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la
platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente, que el objetivo de
menor aumento está en posición de empleo.
3) Para bacteriología, iluminar la preparación bajando el condensador (más contraste), y
con el diafragma abierto.
4) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el
microscopio lo permite.
5) Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar:
a) Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el
macrométrico. No realizar dicha operación mirando por el ocular, pues correría el
riesgo de “clavar” el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de
ambos.

18

b) Enfoque con el micrométrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque
nítido
6) Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). Suba ligeramente el condensador. La imagen
debe estar casi enfocada, afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está ni
medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de x10. El
objetivo de x40 trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos
de accidentes: ser “clavado” en la preparación y resultar manchado con aceite de
inmersión si se observa la preparación ya usada con éste último.
7) Empleo del objetivo de inmersión:
a) Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y
el objetivo de x40
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de la luz.
c) Termine de girar el revólver hasta la posición del objeto de inmersión, asegurándose
de que éste no toca la preparación, pero sí la gota de aceite.
d) Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. Recuerde que la distancia entre el
objetivo y la preparación es mínima.
e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede
volverse a colocar los objetivos de x10 y de x40 sobre ese campo. Por lo tanto, si
desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el revólver
hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a
enfocar desde éste último.
f) Finalizada la observación de una preparación, y antes de retirarla de la platina, se
colocará el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido hacia la lupa.
Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de
observación.
g) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con un papel
especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de x40 está limpio.

3.5. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pañuelos especiales para
lente.
2) No dejar nunca una preparación sobre la platina cuando no esté usando el microscopio.
3) Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revólver.
4) Después de utilizar el objetivo de inmersión límpielo. En caso de que el aceite se haya
secado, avise al docente para limpiarlo con xilol.
5) No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micrométricos,
platina, revólver y condensador).
6) No cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular.
7) Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posición de
observación.
8) Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión de
práctica.

3.6. BIBLIOGRAFÍA

19

Barcelona, 1999
- Manual de Laboratorio, MICROBIOLOGIA APLICADA. Universidad Autónoma
Metropolitana. www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia

20

CAPITULO 4

4. COLORACIONES
4.1. OBJETIVOS
• Interpretar el fundamento de las coloraciones en la práctica microbiológica.
• Ejercitar las técnicas de coloración simple y compuesta.
• Practicar la preparación de coloraciones de uso a partir de soluciones madre.

4.2. INTRODUCCIÓN
En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su
estudio cuando los exámenes se realizan en fresco. Por eso para distinguirlos del medio es
necesario hacer una coloración (tinciones simples), las cuales también sirven para contrastar
o realzar distintas características morfológicas o estructurales (tinciones diferenciales).

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más
usados en microbiología son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles

a) Sales colorantes:
Los colorantes más comúnmente usados son sales que pueden ser de tipo ácido o básico,
términos que no indican necesariamente su pH en solución, sino que una parte significativa
de la molécula sea aniónica o catiónica.
Los colorantes básicos consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro.
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+).
Los colorantes ácidos tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.
Ej: eosinato (-) de sodio (+).
Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha
muerto, el proceso de tinción la mata.
La célula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos, y ellos son los más usados en citología
bacteriana.
Las bacterias son ricas en ácidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de
grupos fosfatos. Los colorantes básicos tiñen la célula bacteriana uniformemente, a menos
que antes sea destruido el ARN del citoplasma.
Los colorantes ácidos no tiñen la célula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para
impartir al fondo un color de contraste (coloración negativa).
Desde el punto de vista práctico entonces, los colorantes básicos tiñen estructuras de
naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células eucariotas y procariotas; los
colorantes ácidos reaccionan con sustancias básicas, como las estructuras citoplasmáticas
de las células eucariotas.

b) Colorantes liposolubles
Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipídicos de la célula,
usándose a menudo para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.

En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con
el propósito de hacerlas visibles al microscopio óptico; uno de ellos es el ácido tánico que se
emplea en la coloración de flagelos y espiroquetas.

21

4.3. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA
Una preparación coloreada exige la sucesión de tres pasos: preparación del extendido,
fijación y coloración.

1.- Preparación del extendido

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.
Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se
extiende hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos.

Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede así de la siguiente manera:

• Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos
• Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego se extiende
la suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el portaobjetos sin tocar los
bordes.
• Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el
portaobjteto al aire caliente de la llama del mechero.

2.- Fijación

Este segundo paso se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no
se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos
posteriormente.
La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas
las bacterias.
Existen dos tipos de fijación: con calor (o método de Koch) y fijación química.

Método Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del
mechero 3 veces seguidas, con la precaución de llevar el extendido hacia arriba. El
inconveniente de este método es que los microorganismos pueden deformarse demasiado si
el calentamiento resulta excesivo. Después del procedimiento, el portaobjetos debe notarse
caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano.

Fijación química
La coagulación del protoplasma microbiano con sustancias químicas es lo ideal pues las
células no resultan deformadas. Existen varios métodos:
- Se inunda el preparado con alcohol metílico, se deja actuar 3 minutos y se lava con agua.
Es el más usado.
- Idem con formalina al 5 % (v/v).
- Se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter
sulfúrico) y se deja actuar hasta su evaporación completa.

3.- Coloración

En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de
acuerdo al método de tinción que se realice.

4.4. TIPOS DE TINCIONES

22

Para la observación microscópica existen diferentes tipos de coloraciones según las
características morfológicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican
en simples y compuestas.

4.4.1. TINCIÓN SIMPLE
Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo
una solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos
que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan
químicamente con el citoplasma microbiano.

Técnica: La coloración consiste en cubrir el frotis, después de fijado, con la solución
colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar.
• Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se
deja actuar 30 a 60 segundos.
• Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja actuar 30 a 60
segundos.
• Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno
alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se usa más
concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la solución de azul de metileno
de uso se le agrega un álcali (KOH) como intensificante, que actúa haciendo más rápida e
intensa la reacción de coloración. Generalmente como intensificante se usa un álcali para un
colorante básico y un ácido para un colorante ácido. Debido a que el protoplasma bacteriano
tiene una débil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios
alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan más intensas.

En la coloración negativa los microorganismos quedan sin teñir y se colorea el medio que los
rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células.

La sustancia usada para la tinción negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por
los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las células, tal como:
• Tinta china (suspensión de partículas de Carbono coloidal demasiado grandes como
para penetrar en la bacteria)
• Colorantes ácidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El más
utilizado es la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro.

La coloración negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los
microorganismos en microscopía óptica, pero su máxima utilidad está en revelar estructuras
como cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como
cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeño diámetro transversal, resulta difícil
ponerlas en evidencia.

Técnica: Método de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un extremo del
portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensión microbiana y se
mezclan bien con el ansa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se hace un
extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo
a medida que se extiende, con lo cual se conseguirá una zona donde el contraste sea el
adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersión.

4.4.2. TINCIÓN COMPUESTA (O DIFERENCIAL)

23

Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referirnos a los dos métodos de
coloración compuesta más comúnmente empleados en la práctica corriente del laboratorio de
microbiología: la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten
diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una
“tinción diferencial”.

TINCIÓN DE GRAM
Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la más empleada en bacteriología.
Las etapas a seguir se detallan en la Tabla 1.
Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la grampositividad depende de la naturaleza
y composición química de la pared o parte de ella. Se han propuesto varias teorías para su
explicación, pero la más aceptada es la que sostiene que las bacterias gramnegativas son
más permeables al alcohol debido a su alto contenido en lípidos.
Cuando la bacteria se tiñe con el complejo colorante básico-mordiente, éste queda atrapado
en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la
naturaleza físico-química de su pared. Por el contrario, en las gramnegativas es arrastrado
debido a su alto contenido lipídico.

Tabla 1 Etapas en la tinción de Gram
Pasos Método GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Violeta de genciana
(luego de 30 seg. se
Colorante básico Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta
lava con agua el
exceso de colorante)
Lugol (pasado 1 min.
Mordiente se lava con agua el Permanece violeta Permanece violeta
exceso de lugol)
Alcohol de 95% o
Alcohol-acetona
(durante aprox. 30
Decoloración seg. y luego lavar Permanece violeta Se decolora
con agua para
eliminar el resto de
disolvente)
Fucsina o Safranina
Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa
lava con agua el
Colocar sobre el
Observar al
frotis una gota de Violeta Rosa
microscopios
aceite de inmersión.

TINCIÓN DE ZIEHL- NEELSEN
El fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular de
algunas bacterias del orden Actinomycetales. Tratándose de la capacidad de resistir a la

24

decoloración con un alcohol y un ácido fuerte cuando han sido previamente teñidas, lo cual
se debe a la presencia de ácidos micólicos en su pared celular.
El resto de las estructuras de estas bacterias son similares a los de las bacterias
grampositivas. Existen dos variantes de esta técnica: una llamada “en caliente” y la otra “en
frío” (o de Kinyoun), en este trabajo desarrollaremos la técnica en caliente. Cualquiera de las
dos técnicas citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que
la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la acción decolorante de una solución de
ácido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rosa sobre un fondo azul (tabla 2).
Las bacterias ácido – alcohol resistentes (BAAR), tras la unión de la fuscina, resisten la
coloración orgánica posterior y se verán teñidas de rosa. El resto de las bacterias se
decolorarán y se teñiran con azul de metileno.

Tabla 1 Etapas en la tinción de Ziehl – Neelsen
ÁCIDO – ALCOHOL NO ÁCIDO – ALCOHOL
Pasos Método
RESISTENTE RESISTENTE
Colorante básico Fucsina …. ….
Calentar la
preparación hasta
que aparezcan
Calor humos blancos. Se tiñe de rosa Se tiñe de rosa
Lavar con abundante
agua el exceso de
colrante
Alcohol – clorhidrico
(aprox. 30 seg. y
Decoloración Permanece rosa Se decolora
lavar el resto de
decolorante)
Azul de metileno
Contraste Permanece rosa Se tiñe de azul
lava con agua el
Colocar sobre el
Observar al
frotis una gota de Rosa Azul
microscopios
aceite de inmersión.

4.5. ANEXO
SOLUCIONES COLORANTES

Soluciones madre
Son soluciones saturadas de colorante, de conservación indefinida, a partir de las cuales se
preparan las soluciones de uso mediante dilución en medio acuoso. Las soluciones madres
se preparan en alcohol.
Preparación: se pueden seguir dos técnicas:
-Triturar el colorante en el mortero, agregar de a poco el alcohol e ir pasando de a poco a un
frasco color caramelo.
-Colocar el colorante en un frasco color caramelo que contiene perlas de vidrio hasta 1 cm
de altura. Agregar posteriormente la cantidad de alcohol necesaria y agitar vigorosamente
varias veces durante 2 días. Esta técnica es la más aconsejable por su simplicidad y
prolijidad.
Antes del uso se deja reposar 24 horas para que el colorante no disuelto sedimente. Para
preparar las soluciones de uso se pipetea del sobrenadante.

25

Solución madre de fucsina básica:
Fucsina básica................................................ 5g
Etanol 96º...................................................... 100 ml

Solución madre de violeta de genciana:
Violeta de genciana.......................................... 5 g
Etanol 96 º.........................................................100 ml

Solución madre de azul de metileno:
Azul de metileno................................................10 g
Etanol 96º............................................................100 ml

Soluciones de uso

La solución de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solución madre y 90 ml de
agua. Dado que resulta una solución hidroalcohólica, su duración es limitada ya que el
colorante precipita al cabo de aproximadamente 2 meses. Por esta razón, los volúmenes
que se preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio.

Solución de uso se prepara generalmente con 10 ml de la solución madre y 90 ml de agua.
Dado que resulta una solución hidroalcohólica, su duración es limitada ya que el colorante
precipita al cabo de aproximadamente 2 meses, Por esta razón, los volúmenes que se
preparan se deben adecuar al consumo del laboratorio.

Solución de uso de fucsina básica: Fucsina fenicada de Ziehl
Solución madre de fucsina básica....................10 ml
Fenol (cristales fundidos)...................................5 g
Agua destilada c.s.p.........................................100 ml

Solución de uso de violeta de genciana:
Solución madre de violeta de genciana.............10 ml
Agua destilada c.s.p.........................................100 ml

Solución de uso de azul de metileno: Azul de metileno alcalino de Loeffler
Solución madre de azul de metileno..................30 ml
Solución acuosa de KOH 1/10000 c.s.p...........100 ml

Una vez preparadas estas soluciones, se deben filtrar y colocar en frascos color caramelo.

4.6. BIBLIOGRAFÍA
Barcelona, 1999
- Forbes, B. A.- Sahm D. F. – Weissfeld A. S. Bailey y Scott, Diagnóstico Microbiológico, 11ª
Edición. Editorial Médico Panamericana. 2004

26

CAPITULO 5

5. ESTERILIZACIÓN POR CALOR
5.1. OBJETIVOS
• Realizar la práctica de envoltura y acondicionamiento de los materiales para su posterior
esterilización.
• Llevar a la práctica los pasos necesarios en el uso del autoclave, la estufa y el mechero
Bunsen.
• Comparar los resultados obtenidos entre el material esterilizado y el no esterilizado.

5.2. INTRODUCCIÓN
Para poder desempeñar correctamente las tareas en un laboratorio de microbiología, es
indispensable contar con conocimientos teóricos acerca de los diferentes métodos de control
del crecimiento microbiano (métodos de esterilización, desinfección, apepsia, etc.). También
con un buen manejo práctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y
esterilización de ansas y agujas a la llama del mechero.

5.3. CONCEPTOS
Por control del crecimientos microbiano, se entiende tanto la inhibición del “crecimiento”
microbiano (evitar su multiplicación) como la destrucción de aquellos. En este contexto se
emplean una serie de término:
5.3.1. Esterilización. Es el proceso de destrucción o eliminación completa de toda forma de
vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del
calor, radiaciones, filtración, etc. Por lo tanto, la esterilización es un término absoluto
e incluye la destrucción de las esporas y formas vegetativas, los virus, etc.
5.3.2. Desinfección. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los
microorganismos más comunes pero no las esporas. Generalmente los
desinfectantes son productos químicos excesivamente tóxicos para ser usados
directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar.
5.3.3. Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los
microorganismos patógenos más comunes, pero no necesariamente esporas,
presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente
empleado se denomina antiséptico.
5.3.4. Asepsia. Se refiere a la condición de ausencia de microorganismos de un objeto o
área. Por ejemplo, las técnicas asépticas son las que evitan la contaminación propia
de otros o de los materiales durante el trabajo.
5.3.5. Microbiostasis. Es una condición por la que el crecimiento o la multiplicación de los
microorganismos están inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el
agente microbiostático es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De
igual definición pero de aplicación a la correspondiente categoría de microorganismos
son los fungistáticos y los bacteriostáticos.
5.3.6. Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos.
De igual significado pero con ámbito más restringido son los términos fungicida y
bactericida.

27

La naturaleza de estos agentes en algunos casos es física y en otros química. Ejemplos de
Agentes desinfectantes y antisépticos de naturaleza química son: óxido de etileno,
formaldehído, peróxido de hidrógeno.
Hay una serie de posibilidades para el control de los microorganismos basadas en el empleo
de agentes físicos como: el calor, las radiaciones, la filtración.

5.4. AGENTE FÍSICO: EL CALOR
El calor es uno de los agentes físicos más usados. Su acción depende de la temperatura
alcanzada y del tiempo de aplicación. De la consideración de éstos dos aspectos surgen las
siguientes expresiones:
• Punto térmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensión
bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable).
• Tiempo térmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensión
bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante).
Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o
esporuladas (de resistencia).
Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la
mayoría se destruye a los 50 y 70°C, especialmente las patógenas. Las bacterias
esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100°C.
Además de la temperatura y el tiempo de exposición es importante tener en cuenta la
humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace más efectivo el
poder de penetración del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas
aumenta la temperatura de ebullición.

Fundamento de la esterilización por calor: El calor actúa desnaturalizando
(coagulando) las proteínas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta acción se
ve disminuida por la presencia de lípidos formando parte de su estructura química, que
actúa protegiendo las uniones peptídicas de las proteínas.

5.5. FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIÓN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE
El calor puede ser aplicado para la esterilización de tres maneras diferentes:
5.5.1. Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos:
a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar,
lo que se logra por oxidación violenta. Este método se utiliza para ansas, agujas,
flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destrucción de material
contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas
superiores a los 2.500°C, por lo que una breve exposición es suficiente. Sin embargo,
cuando las ansas de siembra están muy cargadas con microorganismos, la aplicación
directa de la llama provoca la dispersión irregular del contenido de aquéllas, con el
consiguiente peligro de la contaminación. Un sistema alternativo a los mecheros son
los incineradores eléctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminación no
existe., ya que la dispersión es recogida en el tubo del aparato.
b) Incineración en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los
que no importa su destrucción, como apósitos, cadáveres de animales infectados o
material plástico contaminado. Se utiliza la combustión directa o el horno crematorio.

28

c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco (ver Figura
5.1), en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared,
transmitiendo así el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los
microorganismos se mueren por oxidación de sus estructuras previa deshidratación,
pudiéndose llegar a una ligera carbonización.
Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a
180ºC. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanzó la temperatura
indicada y está condicionado por la cantidad de material y su distribución dentro
de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetración, por esta
razón es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros métodos.
Aplicación: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio.
Recordar que todo el material debe ir perfectamente acondicionado,
preferentemente envuelto en papel blanco de modo tal que una vez retirado de
la estufa, permanezca estéril hasta el momento de ser usado.
Descripción de la estufa: La estufa de esterilización a seco es una caja metálica
de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y
presenta orificios para la libre circulación del aire caliente. La pared intermedia
encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio
o amianto. La fuente de calor es una resistencia eléctrica aunque también
existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la
temperatura deseada.
En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases
y vapores, pudiendo existir otro para la colocación de un termómetro en caso de
no traerlo incorporado.
En el interior posee rejillas metálicas de altura graduable para acondicionar
sobre ellas el material a esterilizar.
Uso: esterilización de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que
interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar
debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas
metálicas.

5.5.2. Calor Húmedo. El vapor de agua es uno de los métodos más eficaces para destruir
microorganismos y, a igualdad de temperatura, es mucho más eficaz que el calor
seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor húmedo.
a) Agua a ebullición: Se colocan los objetos en el agua y se lleva a ebullición durante
un tiempo no menor de quince minutos. Se utiliza para jeringas, agujas, ampollas, etc.
Precaución: Los gérmenes esporulados y ciertos virus no mueren con 15 minutos de
ebullición.
b) Vapor fluente: Consiste en colocar el material en el autoclave pero con la espita
abierta (ver Figura 5.2). Se utiliza para esterilizar sustancias que se descomponen por
encima de los 100 ºC. Ejemplos: medios de cultivo que contienen ciertos glúcidos,
leche, antibióticos, etc. Este método puede complementarse con la Tyndalización (se
explica más adelante).
c) Vapor a presión: Es uno de los métodos más utilizados; se emplea el autoclave
para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros
compuestos químicos utilizados en el laboratorio de microbiología.
Este método tiene gran poder de penetración, razón por la cual la esterilización se
puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa

29

(calor seco) y está especialmente recomendado para la eliminación de formas
esporuladas.
Descripción del autoclave:
El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una
tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra
por pestillos o cerrojos quedando herméticamente cerrado. Además, posee en
la parte superior una llave de vapor (o espita), un manómetro y una válvula de
seguridad.
En el interior del autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir,
ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte
inferior del aparato, o mediante calentadores eléctricos de inmersión.
Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el
aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor
salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla.
Es muy importante que la eliminación del aire ya que, de lo contrario, la
presión marcada por el manómetro indicará la temperatura a la que se
encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para
el vapor saturado a esa presión.
Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la
presión en el interior del autoclave; usualmente se fija la válvula de seguridad
para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 115 y
121ºC.

Presión (Libras/pulg.2) Temperatura (ºC)
5 107
7 110
10 115
15 121
20 126

Los equipos autoclaves son probados por los fabricantes hasta presiones de
60 libras/pulg.2 o más, pero para mayor seguridad puede fijarse una virola
sobre la válvula de seguridad para que no pueda ser desplazada
accidentalmente, pudiendo alcanzarse una presión mayor que la necesaria.
Cuando el manómetro indica que se ha alcanzado la presión deseada, se
disminuye la entrada de gas, y así la llama del mechero, ya que el calor
necesario para mantener la presión es menor que el requerido para alcanzarla.
La presión se mantiene durante unos 20 minutos momento en que se cierra el
paso del gas. No deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el
manómetro indique “0” (cero). Si la presión se libera violentamente los líquidos
en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo aún reventar los
elementos de vidrio.
Una vez que el manómetro indique que no hay sobrepresión en el interior del
aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se
puede levantar la tapa del autoclave. No se debe retirar el contenido
inmediatamente.

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Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son
necesarias temperaturas de 107-121ºC durante 10 a 15 minutos.
Limitaciones: en función de la termolabilidad de ciertos materiales y
componentes de medios de cultivo. Además es inadecuado para sustancias
que son inmiscibles en agua, como las grasas, en las que la penetración del
vapor es muy limitada.

d) Tyndalización: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por
Tyndall, que permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se
alteran a altas temperaturas como algunos azúcares. Se puede realizar a baño María
o autoclave abierta.
La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 ºC; a esta temperatura se
eliminan las formas vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razón es
que después de un período de calentamiento de 30 minutos, se deja el
material a 30-37ºC hasta el día siguiente, y se lo somete nuevamente al
tratamiento inicial. Esta operación se repite después de 24 horas
(esterilización fraccionada).
La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas
células vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por último, en el tercer
calentamiento, ya no quedarán formas esporuladas.
e) Pasteurización: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este
método que actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca
aplicación en bacteriología y es usada especialmente en leche, ya que destruye la
totalidad de los gérmenes patógenos y la mayoría de la flora banal, respetando la
estructura física y composición química de la misma (otros ejemplos son la nata,
bebidas alcohólicas, mosto, etc.).
Consiste en someter el líquido a un calentamiento rápido seguido de un enfriamiento
posterior. La temperatura aplicada es de 63ºC, durante 30 minutos con lo que se
consigue la destrucción de las formas vegetativas, excepto las termófilas. Existe una
pasteurización denominada alta o instantánea, en las que mantienen delgadas
películas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71ºC, con lo que se requiere una
exposición de sólo quince segundos.

5.6. CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN
Existen dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de la calidad de la
esterilización realizada. Los más simples son productos químicos que cambian de color a
121ºC. Se comercializan dentro de sobres, o en la superficie de cintas.
Se utilizan también monitores biológicos como controles de esterilización. Consisten en
determinados microorganismos con una tolerancia conocida al método que se está
empleando.
Las esporas de Bacillus stearotermophilus, por ejemplo, tienen una tolerancia conocida al
calor húmedo. Se colocan ampollas con suspensión bacteriana o tiras impregnadas con
esporas en lugares estratégicos en el interior del autoclave. Como regla general, los
portadores de esporas deben colocarse en el centro del paquete de mayor carga, o en
aquellos lugares dentro de la carga con posibilidades de no alcanzar la temperatura de
esterilización.
Cuando se abren los paquetes o recipientes luego de ser esterilizados, la ampolla con su
contenido o la tira asépticamente colocada en un caldo de cultivo, se incuban durante 24 a
48 horas. Si la esterilización fue eficiente no deberá haber desarrollo en estos cultivos.

31

Asimismo existen otros monitores biológicos para esterilización con calor seco, irradiación
con rayos gamma, óxido de etileno etc., eligiendo las especies bacterianas a utilizar según
su susceptibilidad conocida para cada procedimiento.
Una forma precisa para medir la temperatura en el interior del material colocado en el
autoclave, consiste en insertar cuplas termoeléctricas en varias partes de la carga. Éstas
generan potenciales eléctricos que dependen de la temperatura a la que se encuentran,
sirviendo como termómetros eléctricos si se miden con potenciómetros graduados en ºC.
Algunos autoclaves modernos están equipados con termómetros que producen un registro
continuo y permanente de las temperaturas en el interior del aparato.

Figura 5.1: Corte esquemático de Estufa de esterilización

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1. Tornillos móviles para el
cierre hermético
2. Material a esterilizar
3. Vaciado de la caldera
4. Fuente de calor
5. Gas
6. Agua
7. Apoyo para alejar el material
del agua
8. Caldera
9. Manómetro
10. Cierre de la tapa
11. Válvula de seguridad
12. Espita

Figura 5.2: Corte esquemático del Autoclave

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CAPITULO 6

6. MEDIOS DE CULTIVO
6.1. OBJETIVOS:
• Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de
cultivo.
• Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del medio de
cultivo en la práctica microbiológica.
• Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus
componentes individuales.
• Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de cultivo
como de los demás elementos utilizados en el laboratorio de microbiología.

6.2. INTRODUCCIÓN
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la
cual es difícil aislarlas. A menudo nuestro interés es caracterizar una especie bacteriana,
para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el
aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de
cultivo, ya que en estos últimos se basan muchos de los principios del aislamiento.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan
el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los
microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no
existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el
ambiente natural en el que se desarrollan.
Las características de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar
un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:
− Tipo trófico: se refiere a los requerimientos de carbono y energía, según los cuales se
los clasifica en autótrofos, heterótrofos, quimiotrofos (litotrofos u organotrofos) y
fotótrofos.
− Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.
− Temperatura óptima de crecimiento: según el rango de temperatura al cual el
microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrófilos, mesófilos y
termófilos.
− Rango de pH: en general el rango óptimo de pH para la mayoría de las bacterias oscila
entre 6,6 y 7,2.

6.3. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU ORIGEN

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Los medios de cultivos pueden clasificarse en:
− Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua,
suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.
− Artificiales: Están compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el
laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintéticos y
complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composición química se
denomina sintético o químicamente definido; puede ser una simple solución de sales
con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgánicos. Un medio
no sintético o complejo es aquel del que se desconoce su composición química exacta;
se trata básicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya
concentración no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios,
como por ejemplo el caldo nutritivo.

6.3.1. Clasificación de los Medios ARTIFICIALES COMPLEJOS según su Finalidad
I. Comunes
Medios Artificiales II.a. Enriquecidos
Complejos II. Especiales II.b. Selectivos
II.c. Diferenciales

I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como
el caldo carne y agar carne.
II. Medios especiales: se los clasifica según su finalidad.
II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio común, con el
agregado de elementos nutritivos elegidos según las necesidades. tales como sangre,
albúmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes en
cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el agar sangre y el agar
chocolate.
II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en
una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban
la proliferación de la flora acompañante. Para esto último se busca establecer condiciones
desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el agregado de inhibidores.
El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el
desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayoría de las bacterias.
Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde brillante),
los antibióticos, el alcohol fenil etílico y la azida de sodio.
II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en los que los
microorganismos crecen en libre competencia, viéndose favorecidos aquellos para los cuales
las condiciones de desarrollo son las más apropiadas, no llegándose a inhibir totalmente el
crecimiento del resto de microorganismos. Se logra así la multiplicación de los
microorganismos que se desea identificar, hasta un número suficiente tal que sea posible su
aislamiento en medios selectivos apropiados.
II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos sólidos, se utilizan para
sembrar directamente con la muestra incógnita o a partir del medio selectivo para
enriquecimiento.
II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que coexisten
en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o más tipos de microorganismos pueden
crecer en este medio, algún elemento presente en él permite diferenciarlos, por ejemplo un
indicador. Estas diferencias se basan en alguna propiedad bioquímica que unos poseen y

35

otros no. Un ejemplo de este tipo es el agar con eosina azul de metileno que diferencia
Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus
respectivas colonias. Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman
colonias de color blanco grisáceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de
E. coli son oscuras y con brillo metálico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas
con un centro azul y rara vez presentan brillo.
En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado de
agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-diferenciales resultan muy útiles
para el aislamiento de un microorganismo separándolo de la flora acompañante. Se ponen
en evidencia las colonias de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se
diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora
acompañante.

6.4. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los Com
nutrientes indispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de o ya
sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que nose
contenga sustancias inhibidoras. ha
seña
lado, la provisión de elementos nutritivos en concentración adecuada, depende del
conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hábitat natural.
La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente
con el pH, la fluidez y la presión osmótica que se le quiera brindar a los microorganismos.
En función de la consistencia se puede clasificar a los medio el líquidos y sólidos. En el
laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida, en cuyo caso se los
denomina caldos, o en forma sólida si se le agrega agar al caldo.
En cuanto a la esterilización, este procedimiento garantiza la destrucción de todos los
microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparación del
medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave
(121 ºC, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como
antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por
otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya
enfriado a 50 ºC.
En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor
para algunos microorganismos y no para otros.

36

6.5. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la preparación
de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso alguno de ellos puede
estar ausente de la preparación.
− Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.
− Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas
impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se
solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e
insípido (se gelifica alrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de pureza, por lo
que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de
algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar
un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa
agar blando se le agrega agar al 3 %.
− Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por
ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente
concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son
frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de
carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta,
provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de
levaduras provee vitaminas del grupo B, nitógeno y carbono.
− Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión
enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína,
etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser
deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas,
polipéptidos y aminoácidos.
− Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo
son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en
condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no
solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que
neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
− Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo
para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está
próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias
como las peptonas, previenen una desviación del pH.
− Indicadores de pH. Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de
cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.
− Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden
a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los
gérmenes microaerófilos o anaerobios.
− Agentes selectivos. La adición de determindas sustancias al medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Por
ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la
concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados
microorganismos.

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6.6. PREPARACIÓN
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del
mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego
esterilizarlo.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de un medio de
cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye una receta que deberá
respetarse estrictamente.
Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van incorporando
todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran. Generalmente figura
en primer término el compuesto que actúa como tampón, como puede ser el PO4H2K, que
además provee fósforo y potasio.
Es conveniente añadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno
antes de agregar el siguiente.
Al finalizar la preparación y una vez que ésta se enfríe, se debe verificar que el pH sea el
adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).

6.6.1. Preparación de medios de cultivo
Materiales:
- Erlenmeyer
- pipetas de 10 ml
- tubos de ensayo con sus tapones
- gradillas
- tiras de pH
- drogas correspondientes a cada fórmula
- balanza
- autoclave

A. Caldo nutritivo (Caldo carne)
Es el medio complejo más común para el cultivo de microorganismos.
Fórmula:
Peptona............................................. 5 g
Extracto de carne....……………...... 3 g
Agua c.s.p.................……………… 1000 ml
pH.................................……………. 7,2
Preparación:
1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente.
2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden.
3) Llevar a ebullición agitando periódicamente con una varilla de vidrio.

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4) Completar el volumen hasta 1000 ml.
5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M.
6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volúmenes apropiados en frascos.
7) Tapar, colocar capuchón de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.

B. Agar nutritivo
Fórmula:
Agar........................... 20 g
Caldo nutritivo.....……………... 1000 ml
Preparación:
1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente.
2) Agregar el agar calentando a baño maría agitando hasta disolución total.
3) Ajustar pH hasta 7,2.
4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo.
5) Esterilizar.
Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar caldo estéril, la esterilización se lleva
a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado.
Se prepararán tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello se colocan 5
ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera del autoclave,
cuando están aún líquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto ángulo hasta que
solidifiquen.
Se prepararán también tubos con agar para punción. En este caso, una vez que los tubos
fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posición vertical.
Por último se prepararán cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizar medio
de cultivo recién esterilizado y todavía líquido, o bien medio solidificado y fundido a ebullición
en Baño María. Se deja enfriar el agar hasta 45 ºC, luego se lo vuelca asépticamente en caja
de Petri estéril, teniendo la precaución de flamear previamente la boca del tubo o recipiente a
la llama del mechero. Se deja solidificar en posición horizontal.

6.7. BIBLIOGRAFÍA
- Madigan, M. T.; Martinko G. M. ; Parker J. Brock, Biología de los Microorganismos. Ed.
Pretice Hall. 8ª edición. 2004.
- Laboratorios Britania. http://www.britanialab.com.ar

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CAPITULO 7

7. AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS AEROBIAS
7.1. OBJETIVO
• Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de
bacterias.

7.2. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos
complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que
dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se
requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y mantenimiento de los
cultivos microbianos.
Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de los
cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo
puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es
necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento.

7.3. SIEMBRA
Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las
exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, si se
incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente.
Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo se transfiere
al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introducción de otros
microorganismos ajenos al inóculo.
El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como técnica
aséptica.
La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:
− La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien
puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin
hablar.
− Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene los
microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas).
Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
− Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.
− El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flaméelo hasta que alcance
un rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin
de evitar el deterioro del material a sembrar (enfríelo en la proximidad de la llama unos 10
segundos).
− Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llama del
mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.
− Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos elementos
están cargados de microorganismos.

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− Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible para evitar
que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan acceso al interior.
− Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde serán
transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el
ansa o aguja sea introducida (Figura 1). También se debe flamear la boca del tubo antes
de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en
dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo
así el riesgo de contaminación.
− Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri, coloque la placa
invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo
con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero y tome el
inóculo con el ansa de siembra. Otro método permitido consiste en retirar el inóculo o
sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introducción del ansa o
aguja, para evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del
medio.
− Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente preparada y
esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta
introduciéndola en una solución antiséptica.
− Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en
su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.)
La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La
primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de
renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus
propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un
material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para
obtener cultivos puros.

7.4. TOMA DEL INÓCULO
Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente el
ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extremo
del filamento del ansa de siembra.
Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (caja de Petri), tome
una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de siembra. Si la
muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el
filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Flamee la boca
del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario.

7.5. TRANSFERENCIA
La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de
recipiente que los contiene.
Se pueden presentar los siguientes casos:
(a) Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con
ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.
(b) Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con ansa
en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.

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(c) Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con ansa
o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en caja de Petri, en
superficie.
(d) Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con ansa
en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en
caja de Petri, ya sea en superficie o por homogeinización.

7.5.1. Técnica de transferencia en tubos de ensayo.
a) Técnica para medio líquido
Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los
microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la
misma altura.
Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el dedo meñique, y se
los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualización de toda la
superficie del cultivo.
Con los dedos pulgares e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma la pipeta estéril
o el mango de Koll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza.
Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa, de la siguiente
manera: el tapón del tubo más alejado del operador (que es el que contiene la muestra)
entre el dedo meñique y la palma de la mano; el tapón del tubo más cercano al operador
(que contiene el medio de cultivo estéril) entre el meñique y el anular.
Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inóculo; se siembra; se flamean
nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los
tapones y se quema el ansa.
Como el inóculo procede de un medio líquido, antes de realizar la transferencia se debe
agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieran estar
depositados. Si la siembra se realiza en medio líquido, se agita el tubo sembrado para
distribuir homogéneamente el inóculo.
Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos índice
y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la otra mano
con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas
de las manos.

b) Técnicas para medio sólido.
Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en superficie, en
profundidad o en profundidad y superficie.
7.5.1.b.1. En superficie:
(a) Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el
fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte,
luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en
zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.
(b) Por trazo: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar
una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin
ejercer presión para que no se rompa el medio.
7.5.1.b.2. En profundidad:

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Por punción: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma
vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo
rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza
en el centro del medio o excéntricamente.
7.5.1.b.3. En profundidad y superficie:
Por punción y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con
mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo,
se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.

7.5.2. Técnica de transferencia en caja de Petri.
La siembra en caja de Petri, puede hacerse:
a) En superficie (Figura 2).
7.5.2.a.1. Por estría central: Se levanta la tapa lo suficiente como para
permitir la introducción del ansa con la carga de microorganismos,
iniciándose la estría en el borde del medio más alejado del operador y
se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira ésta 180
º y se continúa realizando otra estría de la misma manera. Esta
división evita el obstáculo del borde de la placa
7.5.2.a.2. Por estría en cuadrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y

se siembra en estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja
hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el más alejado del
operador y el inóculo en cada caso puede ser el mismo (la misma
especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.
7.5.2.a.3. Por diseminación con espátula de Drigalsky: Se deposita sobre

el medio sólido contenido en la placa, una ansada o una gota con
pipeta del material a sembrar, que luego se extenderá por toda la
superficie del medio con una espátula de DRIGALSKY.

43

La espátula se introduce inmediatamente después de su uso en
un recipiente para su esterilización en autoclave o en
formaldehído al 5 %.

7.5.2.a.4. Por diseminación con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo,
se escurre el exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se
estrían ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes
hacia el centro, luego se gira 90º y se estrían nuevamente ambas
mitades, finalmente se gira 45º y se estrían ambas mitades.

b) Por homogeneización:
7.5.2.b.1. Técnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inóculo
se introduce con el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo
fundido y enfriado a 45 ºC en cantidad suficiente para cubrir la placa
de Petri. Se homogeneiza por rotación y se vuelca en la placa previo
flameado de la boca del tubo.
7.5.2.b.2. Técnica del agar volcado: Se deposita el inóculo con pipeta en el
centro de la caja de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio
de cultivo fundido y enfriado a 45ºC. Se homogeneiza por rotación
para lo cual se le imprime a la caja movimientos circulares, en sentido
horario y en sentido antihorario y movimientos rectilíneos, horizontales
y verticales.
Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con
medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinéresis
(condensación) antes de efectuar dicha operación. Para tal fin es
aconsejable preparar las placas con 24 hs. de anticipación y dejarlas
invertidas a temperatura ambiente.

7.6. AISLAMIENTO

44

El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación imprescindible y previa al estudio e
identificación de una especie bacteriana.
Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por métodos especiales.

7.6.1. Métodos generales de aislamiento.
Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en caja de Petri.
a) Por diluciones sucesivas: Se homogeneiza la muestra y se carga el ansa por
única vez. Luego se pasa el ansa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45
ºC. De esta manera el primer tubo contendrá mayor concentración de
microorganismos que el último. Luego se pasa el contenido de los tubos a las cajas
de Petri y de allí a los tubos con agar en pico de flauta.
b) Por agotamiento en superficie en una sola caja: Es el método más utilizado. Se
prepara una caja de Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de
humedad según se indicó anteriormente.
Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se
carga el ansa con la muestra, se deposita en un punto de la superficie del sector (I)
cercano al borde, y se extiende en el mismo con estrias próximas y paralelas. A
continuación se quema el ansa y se deja enfriar.
Se gira la caja 90 º, se pasa el ansa una vez sobre la última estría de la región ya
inoculada y se arrastra al sector (II) efectuando sobre
él la siembra sin superponer las estrías con las
realizadas antes.
Se quema nuevamente el ansa y de la misma manera
se estría el sector (III).
Luego de quemar el ansa, en el sector (IV) se realizan
estrías con el material que se arrastra de (III), más
amplias y que terminan en el centro de la caja.

Cualquiera sea el método empleado, si se realiza
correctamente, podrán obtenerse colonias aisladas. Estas pueden pertenecer a distintas
especies bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscópicamente.
En general cada colonia se considera formada a partir de una célula bacteriana, aunque esto
no es del todo cierto pues puede darse el caso de que dos o más células den origen a una
colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia resultante será pura. Caso
contrario, la finalidad del trabajo no se habrá cumplido, no lográndose el aislamiento.
Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloración de Gram.
Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la caja con un
número identificatorio. Se hace el extendido con una porción de la colonia y si todas las
células observadas coinciden morfológicamente, se repica el resto de la colonia en un tubo
con agar en estría para obtener un cultivo puro.
A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram resulta engañosa por existir
bacterias de diferentes especies (pero iguales morfológicamente) presentes dentro de la
colonia seleccionada pero en muy bajo número debido a su imposibilidad de desarrollar. Por
consiguiente es necesario realizar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las
colonias.

7.6.2. Métodos especiales de aislamiento.

45

a) Métodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer
desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una especie
puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH
o por precipitación de elementos del medio). Un ejemplo, es el aislamiento en el
llamado agar- lactosa- verde- brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan
colonias color rojo intenso en el centro con un halo rosado que destacan del fondo
azul del medio.
b) Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones físicas determinadas
que afectan a ciertos microorganismos y no a otros.
A) Empleo de temperaturas disgenésicas: La mayoría de las bacterias desarrollan
bien a 37ªC. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta 40 ºC -42ªC y aún más,
otras por debajo de 35 ªC. Estas características se pueden usar para la separación
de especies.
B) Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias
son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las
formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha para la separación de las
especies que tienen la capacidad de esporular.
C) Movilidad del microorganismo: Las bacterias móviles desarrollan en gran parte de
la superficie del medio, mientras que las inmóviles lo hacen solo en el punto de
siembra.
c) Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que tienen ciertos
animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.

Nota: Cuando se realizan aislamientos de bacterias anaerobias, se pueden aplicar
las mismas técnicas, teniendo la precaución de regenerar previamente el medio de
cultivo e incubar en anaerobiosis.

46

7.7. BIBLIOGRAFÍA

- Gamazo, C., López-Goñi, I., y R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología. Ed.
Masson. S.A. Barcelona. España

47

CAPITULO 8

8. RECUENTO DE MICROORGANISMOS
8.1. OBJETIVO
• Estimar el número de microorganismos presentes en una muestra mediante algunos
métodos de rutina en el laboratorio de microbiología.

8.2. INTRODUCCIÓN
Se denomina crecimiento al incremento en el número de células en una población o al
incremento de la masa celular. La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de
células o en la masa celular experimentado por unidad de tiempo. El crecimiento es un
componente esencial de la función microbiana, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene
un período de vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de
la población. La mayoría de los microorganismos el crecimiento de una célula individual
continúa hasta que se divide en dos células nuevas, un proceso que se denomina fisión
binaria. Durante el ciclo de crecimiento todos los constituyentes celulares aumentan. El
tiempo necesario para completar un ciclo de crecimiento celular en las bacterias es muy
variable y depende de varios factores, tanto nutricionales como genéticos.

El crecimiento de las poblaciones se mide estimando los cambios en el número de células,
en la cantidad de algún componente de las mismas (por ejemplo, proteína) o en el peso total
seco de las células. Existen diversos métodos para evaluar el tamaño de la población
bacteriana presente en una muestra determinada, adecuados para diferentes organismos o
diferentes situaciones. Algunos de ellos son directos y otros indirectos, en función de que
cuenten microorganismos o calculen otros parámetros a partir de los cuales se puede inducir
la magnitud de la población microbiana.

8.3. MÉTODOS DE RECUENTO
8.3.1. RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO
El recuento directo al microscopio se puede realizar de dos maneras: con muestras teñidas o
en fresco.
En el caso de las observaciones en fresco se utilizan cámaras de conteo especiales que
consisten básicamente en una retícula de superficie conocida grabada sobre una placa de
vidrio, similar a un portabjetos.
Se coloca una gota de la muestra sobre ella y se la cubre con un vidrio similar a un
cubreojetos convencional; de este modo se puede contar el número de células en la retícula
bajo el microscopio. Multiplicando este valor por un factor de conversión, calculado en
función del volumen alojado en la cámara, se puede estimar en número de bacterias por
mililitro de muestra.
Estas cámaras se suelen utilizar en el laboratorio de análisis clínicos para realizar el recuento
de glóbulos rojos y blancos. La cámara más usada es la de Neubauer y es la que
emplearemos en el trabajo práctico.
Este método es tedioso pero es una forma rápida de estimar la carga microbiana de una
muestra. A pesar de ello el método tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen células muertas y vivas.
2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio.
3) Poca precisión.
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra.
5) El método no es adecuado cuando la densidad de células es baja.

48

Descripción de la Cámara de Neubauer:

En la parte superior del portaobjetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno
transversal central. En la parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos
rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a su vez subdivididas en una cuadrícula más
pequeña (ver figura 8.1).
Procedimiento para el conteo:

1. Limpiar la cámara

2. Con la ayuda de una pipeta suspender una gota de la solución a analizar sobre el
portaobjeto y dejar que se disperse.

3. Colocar el cubreobjeto cuidando de no formar burbujas de aire. Caso contrario se
deberá repetir la operación lavando y secando el portaobjetos. Al colocar el
cubreobjetos sobre el portaobjetos se tiene una profundidad de 0,1 mm. De forma que
el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes será 0,1 mm3 (1,0 mm2
x 0,1 mm = 0,1 mm3).

4. Colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo
10x. Se enfoca de manera que en el campo se cubra un cuadrado cuya área
corresponda a 1 mm2, generalmente se trabaja con el cuadro central. El área del
cuadro central es de 1 mm2 y se encuentra subdividida en 25 cuadrados. Cada uno
de estos cuadrados mide 0,2 mm de lado, por lo que el área de cada uno será de
0,04 mm2 (ver figura 8.1 C).

5. Una vez ubicada la cuadrícula de 25 cuadros de 0,04 mm2, hacer un cambio de lente
al objetivo 40x y contar las células que se encuentran en el mismo.

6. Para alcanzar resultados más exactos se recomienda tener un conteo entre 200 y 300
células por muestra. Cuando en el cuadro central existen menos de 200 células, es
necesario revisar más cuadros para el conteo. Se sugiere continuar el conteo en los
cuatro cuadros que forman las esquinas de la cuadrícula. Si aún así no se alcanza las
200 células, se debe contrar el total de los 25 cuadrados.

7. En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo será
necesario diluir la suspensión muestra en una proporción conocida, la que deberá ser
tenida en cuanta en la estimación final.
Determinación de la densidad celular:

Nº de cél. en 0,1 mm3 = Nº total de cél. contadas / Nº de cuadrados de 0,04 mm2
El Nº de células por ml se obtendrá al multiplicar el valor obtenido por 10000.

49

8.3.2. MEDIDA DE LA BIOMASA
La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada
frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un
constituyente metabólico o químico.

a) PESO SECO
Es una manera indirecta de estimar la carga microbiana de una muestra. El peso neto se
puede medir centrifugando una alícuota de la muestra y pesando posteriormente el depósito
de células obtenido.

50

Este método se usa más frecuentemente a escala industrial donde los volúmenes de muestra
y las densidades microbianas son mucho mayores.

b) DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana.
Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente ADN) y
a partir de este dato se estima la masa de la población.
c) DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO
Permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen diferentes
técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra en relación al
compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el
NO2- , NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV o el nitrógeno total
mediante la digestión de Kjeldahl.

8.3.3. DISPERSIÓN DE LA LUZ (DENSIDAD ÓPTICA)

Cuando un haz de luz paralelo golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es
reflejada, parte es dispersada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría
mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz
dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. En relación
a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión.

Los métodos de dispersión de la luz son otra manera de estimar indirectamente, de forma
rápida y sencilla, el número de microorganismos en una muestra dada.

Esta técnica consiste en medir la turbidez que producen las células en medio líquido, debido
a la dispersión de la luz. Cuanto más material celular haya, más dispersará la luz y mas
turbia se verá la muestra.
La turbidez se mide en unidades de absorbancia con un espectrofotómetro o fotocolorímetro.
Debe tenerse en cuenta que mediante este método no se distinguen células vivas de células
muertas.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos
de bacterias, independientemente del tamaño celular, tiene casi la misma absorbancia por
unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño
celular del microorganismo.
Sin embargo se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (unidades
de formación de colonias) cuando los tamaños de las células bacterianas son muy diferentes.
Por esta razón, para estimar el numero de microorganismos totales o viables de una
suspensión bacteriana se debe realizar una “curva de calibración” con cada tipo de
microorganismo, solo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (densidad óptica) con
el número de microorganismos totales.

K: constante que varía con la longitud de onda
utilizada
ABSORBANCIA = K x PESO SECO Peso seco: concentración celular bacteriana
expresada en unidades de peso seco (mg/ml).

51

8.3.4. RECUENTO DE BACTERIAS HETERÓTROFAS VIABLES
Los métodos que se basan en el cultivo de microorganismos en medios sólidos (agar),
consisten en poner en contacto las bacterias que contiene la muestra problema con un medio
adecuado en el que puedan desarrollar.
La viabilidad es la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido
formando una colonia.
Durante el período de incubación, se supone que cada bacteria viable es capaz de originar
una colonia macroscópica que será utilizada para realizar el recuento.
Existen dos métodos para el recuento de bacterias viables en placa, siendo el de uso más
frecuente el método de “pour plate” o recuento estándar en placa.
Este método consiste en sembrar cajas de petri con 1 ml de muestra (y de sus diluciones) y
agregar de 10 a 12 ml de agar nutritivo estéril fundido (teniendo la precaución de dejarlo
enfriar hasta 44-46 grados). Se mezcla rápidamente y, una vez solidificado el agar, se
incuban las placas durante 7 días a 20 grados C.
El segundo método es de siembra en placa por extensión y consiste en en extender sobre
la superficie del agar en la placa, un volumen no mayor a 0,1 ml de la dilución
correspondiente. Para ello se utiliza una espátula de Drigalsky estéril. Se incuba de la misma
manera que las placas de pour plate, y el recuento y las consideraciones que se hacen a
continuación valen también para este método.
Para obtener resultados estadísticamente significativos es necesario contar placas que
contengan entre 30 y 300 colonias. Para que ello sea posible, en el momento de la siembra
debe tenerse una idea aproximada del número de bacterias presentes en la muestra a fin de
realizar las diluciones adecuadas.
Cuando se desconoce totalmente la muestra problema es conveniente realizar la máxima
cantidad de diluciones posibles.

Procedimiento:
A partir de la muestra de agua a analizar, se toma 1 ml y se siembra en un tubo de ensayo
conteniendo 9 ml de agua destilada estéril rotulado con 10 -1 que corresponde al primer nivel
de dilución (1:10).
Se agita en el vórtex y se toma 1 ml del tubo 10 -1 con otra pipeta estéril y se lo agrega un
segundo tubo con A.D estéril rotulado como 10 -2(1:100), correspondiente al segundo nivel
de dilución.
41
Se procede de la misma manera hasta el tubo correspondiente a la última dilución 10-10
(1:10.000.000.000).
De esta manera se espera que los primeros tubos tengan la mayor concentración bacteriana
y que en los últimos tienda a cero.

52

Posteriormente se toma 1 ml de cada dilución y 1 ml de la muestra sin diluír y se los coloca
en sendas cajas de petri, dentro de las cuales se volcará el agar fundido.
Es conveniente realizar las siembras de cada nivel de dilución como mínimo por duplicado
(se recomienda por triplicado), para luego promediar los recuentos.
En recuentos de muestras de aguas naturales se aconseja incubar a 20 grados C durante 7
días.

Recuentos:
• Contar las colonias de las placas, seleccionar aquellas en las que hallan desarrollado entre
30 y 300 colonias y promediar los resultados de las placas del mismo nivel de dilución.
• Calcular el número de bacterias de la muestra multiplicando ese promedio por la inversa de
la dilución utilizada y expresar el resultado en Unidades Formadoras de Colonias por mililitro
(UFC/ml).
• Si sólo hay placas con menos de 30 colonias, se cuentan y se calcula el resultado de estos
valores.
• Si sólo hay placas con más de 300 colonias, se cuentan las que tengan el número más
próximo a 300 y se expresa como número estimado de UFC/ml.
• Si ninguna placa presenta colonias, se expresa el resultado como “menor de 1”,
multiplicado por la inversa de la dilución.
Debe tenerse en cuenta que las bacterias que desarrollan en el medio de cultivo elegido, son
aquellas que pueden utilizar los nutrientes disponibles y que además se adaptan a las
condiciones de oxígeno, potencial redox, pH, temperatura y periodo de incubación. No existe
un medio nutritivo ni una combinación de temperaturas y tiempos de incubación que
aseguren la recuperación de todas las bacterias viables de una muestra de agua.
Las bacterias en una muestra de agua pueden encontrarse aisladas o en agrupaciones (de a
pares o en cadenas) o asociadas a partículas. Por ello cada colonia que desarrolla puede
estar originada por uno o más organismos y entonces los resultados de los recuentos deben
expresarse como unidades formadoras de colonias por unidad de volumen (no como
bacterias por unidad de volumen)

8.3.5. NÚMERO MÁS PROBABLE
Esta técnica de recuento es una manera indirecta de estimar la población bacteriana.

Procedimiento:
De la muestra a examinar, se pesa 1 g ( o 1 ml en caso de que sea líquida) y se diluye en un
tubo de ensayo conteniendo 9 ml de agua destilada estéril rotulado con 10 -1. Esto
corresponde al primer nivel de dilución (1:10).
Se agita en el vórtex y se toma 1 ml del sobrenadante con una pipeta estéril y se lo agrega al
segundo tubo con A.D estéril rotulado como 10 -2 (1:100), correspondiente al segundo nivel
de dilución.
Se procede de la misma manera hasta el tubo correspondiente a la última dilución
(10 -10 = 1:10.000.000.000).
De esta manera se espera que los primeros tubos tengan la mayor concentración bacteriana
y que en los últimos tienda a cero.
Una vez que se dispone de estos 10 tubos conteniendo la solución de la muestra se procede
a sembrar una alícuota de 0,1 ml, por triplicado, de cada uno de ellos en caldo nutritivo. Se
siembran como mínimo tres tubos para cada dilución aunque se pueden utilizar también
cinco réplicas de cada uno de ellos, lo que disminuye el desvío.
Los tubos sembrados se incuban durante 7 días a 20 ºC. Finalizado este tiempo se procede
a realizar el recuento.

Cálculo del Número mas Probable

53

Al cabo de una semana se leen los resultados, tomándose como positivos a aquellos tubos
con caldo nutritivo en los que ha habido desarrollo (se ven turbios debido a la proliferación de
microorganismos).
Se toma nota, para cada dilución, del número de tubos positivos (+) y se obtiene un número
característico representado por tres cifras. La primer cifra del número característico
corresponderá al nivel de dilución menos concentrado en el que todos los tubos sean
positivos.

Una vez que se ha obtenido el número característico, con el mismo se ingresa en la tabla y
se lee el número más probable de microorganismos, refiriendo este al volumen de siembra.
En el caso de estar analizando muestras sólidas se refiere el número final al peso seco de la
muestra. Para ello se deberá calcular la humedad de la misma. A este número obtenido debe
multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en la que se han hallado 3 (+), es decir
que corresponde a la dilución de la primer cifra del número característico.

En la tabla de Mc Crady figuran todas las combinaciones posibles y para las que se ha
calculado, mediante un método estadístico, el número más probable de microorganismos
presentes en la muestra.

Tabla de Mc Crady (para tres réplicas por dilución)

Número Número de Número Número de Número Número de
característico microorga-nismos característico microorga-nismos característico microorga-nismos
000 0,0 201 1,4 302 6,5
001 0,3 202 2,0 310 4,5
010 0,3 210 1,5 311 7,5
011 0,6 211 2,0 312 11,5
020 0,6 212 3,0 313 16,0
100 0,4 220 2,0 320 9,5
101 0,7 221 3,0 321 15,0
102 1,1 222 3,5 322 20,0
110 0,7 223 4,0 323 30,0
111 1,1 230 3,0 330 23,0
120 1,1 231 3,5 331 45,0
121 1,5 232 4,0 332 110,0
130 1,6 300 2,5 333 140,0
200 0,9 301 4,0

8.4. BIBLIOGRAFÍA
− Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack.Brock. 1998. Biología de los
Microorganismos. Ed. Pretice Hall. 8ª edición.
− R. Díaz, y col. 1999. Manual Práctico de Microbiología. 2a edición. Ed. Masson, Barcelona.
− Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1995. American Public
Health Association, Washington, U.S.A.
- UNAM, 1986, "Biología celular", Manual de prácticas. Departamento de Biología, Facultad
de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, pp. 20-28.

54

CAPITULO 9
MICOLOGÍA

9.1. Objetivos
• Tomar conocimiento de los hongos microscópicos.
• Observar en el microscopio las diferentes formas, estructuras y contribuyentes de los
diferentes hongos microscópicos.
• Obtener un cultivo de hongo completo en el centro de un portaobjetos.
9.2. Introducción
La Micología es la ciencia que se ocupa del estudio de los hongos, definiéndolos como
organismos macroscópicos y microscópicos de distribución universal, dispersos en el aire,
superficies terrestres, agua marinas, lacustres y fluviales, desde helados casquetes polares
hasta los más áridos desiertos. Los hongos contribuyen a la descomposición de la materia
orgánica y participan en los ciclos biológicos, como así tambien son patógenos de animales y
plantas.

Los hongos que se nutren de materia muerta se les conoce como saprofitos y los que
requieren de materia viva se los denomina parásitos. En el sistema de clasificación de los
seres vivos en cinco reinos, se encuentran clasificados en el Reino Fungi.
Los hongos se dividen en cuatro clases (Phila), están los Ascomycota (ver figura 9.1),
Basidiomycota (ver figura 9.2), Zigomycota (ver figura 9.3), Chitridiomycota (ver figura
9.4) y los Deuteromicetos (ver figura 9.5).

La clase Ascomycota es la más extensa, comprende el 50% de los hongos conocidos y
aproximadamente el 80% de los hongos patógenos. A los hongos deuteromicetos no se les
conoce su reproducción sexual, se los denomina tambien hongos imperfectos o mitospóricos
(no tiene categoría sistemática), que representa el segundo grupo más numeroso y que
también incluye patógenos humanos.

Fig. 9.1 Ascomycota: Fig. 9.2 Basidiomycota: Coprinus cinereus
Pleospora herbarum

55

Fig 9.4 Chytridiomycota:
Allomyces sp.
Fig 9.3 Zygomycotes: a-Rhizopus, b-Mucor

Los hongos son seres vivos eucariota, carentes de clorofila y puede ser unicelulares o
filamentosos, sin formar tejidos especializados. Debido a la ausencia de clorofila los hongos
son quimioheterótrofos aerobios o microaerófilos, obtienen los nutrientes por absorción.
Los hongos unicelulares o levaduras se reproducen por escisión o brotes (figura 6), algunos
bajo ciertas condiciones de crecimiento emiten prolongaciones semejantes a un filamento, se
les denomina pseudomicelio. En su aspecto macroscópico, las colonias de levaduras suelen
ser de color blanco crema, más o menos lisas, o de aspecto seco y plegado y de tamaño
variable.

Los hongos filamentosos o mohos son tubos cilindricos ramificados (continuos o tabicados)
con crecimiento apical, esto es, crecimiento originado por las puntas de las hifas. El thallo
(cuerpo) filamentoso se denomina micelio y las ramificaciones originadas de él se llaman
hifas (figura 7). El micelio de fructificación se especializa en producir esporas, para la
reproducción. El micelio vegetativo penetra en el sustrato para obtener los nutrientes.

Los hongos filamentosos representan el crecimiento más típico de los hongos microscópicos;
en medios de cultivo sólidos y también sobre cualquier superficie en la que se desarrollen
(por ej frutas u otros alimentos) producen colonias algodonosas o pulverulentas que son muy
características. Su identificación se basa en criterios fisiológicos, sobre la base de pruebas
bioquímicas.

56

Fig. 9.6: levaduras en escisión Fig. 9.7: Hifas septadas

TABLA DE CLASIFICACION DE LOS HONGOS
Caracteres Ejemplos Importancia
Phylum diferenciales económica

Chytridiomycota Thalo cenocítico, Coelomyces
esaporas flageladas Ninguna
Allomyces
Formación de Producción de
Zygomycota cigosporas Moho negro del pan alimentos fermentados,
(esporas resistentes) formación de micorrizas
Como alimentos,
Formación de esporas
Ascomycota Neurospora, industria de la
asexuales (conidios),
Claviceps, fabricación de vino,
esporas sexuales en
levaduras y trufas. cerveza, productos de
ascos, hifas tabicadas.
panificación
Alimento (setas),
Basidiomycota Formación de Hongos venenosos producción de hongos
basidiocarpos y comestibles. comestibles,
(esporas sexuales), Setas, royas y formadores de
hifas tabicadas. carbones. ectomicorrizas.

Hongos sin ciclo Penicillum, Producción de quesos,
Deuteromicetos, antibióticos; control
Hongos sexual conocido, Aspergillus,
formación de conidios. Trichoderma. biológico.
Imperfectos

9.3. Técnicas de identificación de levaduras

Las pruebas para identificación de levaduras pueden agruparse en dos categorías:

• Pruebas morfológicas: aspecto de las colonias, observación macroscópica de los
cultivos, presencia de ascosporas.

• Pruebas fisiológicas: temperatura máxima de crecimiento, capacidad de utilización
de diversos compuestos como fuente única de carbono en condiciones de aerobiosis,
capacidad de fermentación de diversos azúcares, capacidad de utilización de
diversos compuestos como fuente única de nitrógeno, actividad ureasa, capacidad de
crecimiento con altas concentraciones de glucosa.

57

9.3.1. Procedimiento:

a) Material necesario: Asa de siembra, mechero Bunsen, portaobjetos y cubreobjetos,
placas de Petri estériles, solución salina estéril, microscopio, medio de cultivo Agar
Sabouraud y un cultivo de levadura de una cepa conocida.

b) Siembra: Llevar a cabo por el procedimiento de inocular una placa de agar
Sabouraud a partir de un cultivo fresco de levaduras (24 a 48 hs).

c) Incubación: Incubar en estufa entre 28 y 30º C durante 48 hs. Reincubar 24 horas
más si fuese necesario.

d) Lectura de resultados: Ver el aspecto de las colonias y comparar con una tabla que
contiene las características macroscópicas de la colonia de levadura y la especie que
corresponde.

9.3.2. Morfología microscópica de levaduras :
Preparar un cultivo de levaduras sobre medios adecuados para la esporulación y
germinación de estos hongos, la incorporación de Tween 80 a éstos medios reduce la
tensión superficial y favorece la germinación, filamentización y esporulación de las levaduras.
Los cultivos van cubiertos con un cubreobjetos, para facilitar la observación posterior al
microscopio.

9.4. Análisis de Muestras Clínica
Ante todo debe realizarse un raspado de escamas cutáneas. Una parte de esta se examina
en una preparación de KOH y el resto se siembra o cultiva en un tubo inclinado de agar de
Sabouraud.

9.4.1. Montaje con KOH al 10 %
1.- Colocar una gota de KOH al 10% que contiene glicerina en un portaobjeto mezclándolo
con una pequeña porción de la muestra.
2.- Pasar suavemente el portaobjeto a través de la llama baja de un mechero para facilitar
el aclaramiento.
3.- Colocar una lámina cubreobjeto y dejar reposar por 30 minutos.
4.- Examinar microscópicamente en busca de hifas u otras estructuras micóticas. Luego de
la recolección apropiada, las muestras deben de colocarse en los medios de transporte
estériles, debidamente rotulados.
5.- En caso de no realizar la siembra en el medio de cultivo, estos no deben demorarse en
llegar al laboratorio para así asegurar el crecimiento del hongo. Para la identificación de
Candida, por ejemplo el método más usado y económico es la prueba del tubo
germinativo.

9.5. Prueba del tubo germinativo (para C. Albicans)
Hacer una suspensión ligera (100.000 a 1.000.000 de células/ml) de un cultivo de 24 hs. De
la cepa en estudio, en 0.5 ml de suero bovino. La suspensión puede hacerse tocando la
superficie de una colonia con la punta de una pipeta Pasteur estéril y luego emulsionando
suavemente las células adheridas a la pipeta, en el suero.
Incubar a 37º y observar microscópicamente cada media hora, hasta las tres horas. Es
necesario inocular simultáneamente un testigo positivo ( C. Albicans) y uno negativo ( C.
Guillermondii u otra)

58

Interpretación: El tubo germinativo se ve como una proyección filamentosa delgada, que no
presenta constricción en el punto de origen.

9.6. Estudio Morfológico de los Hongos Filamentosos
Entre los criterios más empleados para la identificación de los hongos filamentosos está el
estudio de las características macro y microscópicas de las colonias. La morfología
microscópica de los cultivos es la que proporciona por ejemplo: el grosor de los filamentos, el
tipo y la distribución de los septos, la forma, el tamaño y la disposición de las esporas y de
las estructuras formadoras de éstas.
Uno de los métodos aplicados para la observación microscópica de los cultivos es la
observación en fresco, con una solución adecuada. También es muy útil la realización de
cultivos en portaobjetos.

9.6.1. Procedimiento
a) Materiales necesarios: portaobjetos, cubreobjetos, placas de Petri de vidrio,
soportes de vidrio en U, pinzas, asa de micología, cultivos de hongos conocidos, medios
de cultivo Sabouraud diluido 1/10, agua destilada estéril, microscopio. Todo el material a
utilizar debe ser estéril.

b) Técnica:
• Disponer de portaobjetos nuevos, limpios, colocados sobre el soporte en U, dentro de
una placa de Petri (previamente esterilizados).
• Al lado del mechero , abrir las placas que contienen los portaobjetos, con una pipeta
estéril, colocar 3 ml de agar Sabouraud fundido (a 45º C), cubrir la placa y dejar
solidificar el medio de cultivo a temperatura ambiente.
• El conjunto está dispuesto para la inoculación del hongo.
• Tomar con un asa de micología un pequeño fragmento de la colonia de la cepa en
estudio. Nota: es de gran importancia que el inóculo depositado sea muy escaso.
• Colocar 5 a 10 ml de agua destilada estéril en la placa con el fin de mantener un
ambiente húmedo.
• Anotar la fecha del cultivo y la especie inoculada.
• Colocar las placas en la estufa de cultivo a 25 - 27ºC. Observarla diariamente.
Detener el crecimiento cuando parezca suficiente.
• Sacar los portaobjetos de sus placas, depositarlos en bandejas adecuadas e
incubarlos en la estufa a 37ºC durante 24 hs más.
• Así la preparación puede ser coloreada para un posterior montaje.

9.7. Medios de Cultivo utilizados comúnmente

a) Medio de Sabouraud con miel Preparación: Disolver la peptona en agua,
agregar la miel Mezclar y llevar a ph 7.
Agregar el agar y 2,5 grs de carbonato de
Miel de abejas ...........80 grs
calcio. Esterilizar en Autoclave a 115ºc 20
Peptona......................10 grs.
min, filtrar por algodón y fraccionar.
Agar agar....................20 grs.
Agua c.s.p..............1000 ml.

59

b) Medio de Sabouraud glucosado Preparación: Proceder como en el caso
Glucosa .....................40 grs anterior omitiendo el carbonato de calcio.
Peptona .....................10 grs El medio de Sabouraud de conservación
Agar agar....................20 grs se prepara con 3% de peptona y sin fuente
Agua c.s.p. .............1000 ml hidrocarbonada.

c) Medio de Lactrimel (Borreli) Preparación: Disolver la harina en la
leche y luego agregarle la miel y el agua,
Miel de abejas................10 grs mezclar bien. Fundir en BM el agar y
Harina de trigo................20 grs agregar los componentes antes
Agar.................................12 grs mezclados. Agregar el cloranfenicol
Leche entera .................200 ml disuelto en 5 ml de alcohol etílico.
Agua destilada csp 1000 ml Fraccionar en tubos y esterilizar en
Cloranfenicol.................250 mgs Autoclave (115 ºC -20 min). Distribuir
asepticamente 20 ml por placa de Petri,
antes de que el medio solidifique.

d) Medio de Czapek-Dox Preparación: Disolver las sales
sucesivamente en la mitad del volumen del
NO3Na .........................2.00 grs agua y la sacarosa en la otra mitad.
SO4Mg7H2O ................1.00 gr Mezclar, llevar a ph 7 agregar el agar y
ClK ..............................0.50 grs esterilizar en autocla ve a 115º C durante
SO4Fe7H2O ............... 0.10 grs 20 minutos.
Sacarosa .....................30.00 grs
Agar ............................20.00 grs
Agua destilada csp ......1000 ml

Preparación: Pelar y rallar la papa.
e) Agar papa glucosado Disolver la glucosa en el agua y agre gar
Papa.................................200 grs luego los demás ingredientes. Hacer hervir
Glucosa ...........................10 grs A 20 minutos y filtrar por Algodón. Repartir y
Agar .................................20 grs esterilizar en auto clave a 121ºC durante
media hora.

Preparación: Suspender la levadura en el
f) Agua de levaduras agua y batir con una varilla, agregar 1 gr
Levadura prensada……….200 grs. de albúmina de huevo desecada. Llevar al
Agua corriente csp……….1000 ml. autoclave a 121ºC durante 10 minutos.
Retirar del autoclave, filtrar por algodón y
llevar a ph 7. Repartir en tubos de ensayo
e esterilizar a 110ºC, durante 10 minutos.

9.8. Reactivos y soluciones

60

a) Lactofenol azul de algodón

Cristales de fenol …………..…….20 grs
Acido láctico………………..……...20 ml
Glicerina ……………………..….…40 ml
Agua destilada………………..…...20 ml
Azul de algodón (sol.acuosa al 1%). 2 ml

Preparación: Agregar el ácido láctico y la glicerina al agua destilada y mezclar.
Agregar los cristales de fenol y mezclar. Calentar suavemente en baño María con
Frecuente agitación hasta disolución completa de los cristales de fenol. Agregar 2 ml
de una solución acuosa al 1% de azul de algodón (azul de Poirrier) y mezclar bien.

b) Solución de KOH al 20% en glicerol
(para observación de preparados en fresco del material clínico)

KOH....................20 grs
Glicerol………….20 ml
Agua…………….20 ml

La adición de glicerol al 50% impide el rápido desecamiento del fluido en el
portaobjetos y permite la observación microscópica del preparado por períodos
superiores a 48 hs.

c) Solución de azul de metileno al 1%
Azul de metileno……………..1 gr
Agua destilada csp ………….100 ml

9.9. Glosario
Artrosporo: Talosporo que resulta de la fragmentación de una hifa en elementos
rectangulares longitudinalmente.
Asco :Elemento del micelio de fructificación propio de los Ascomycetes, que contiene
en su interior un número generalmente par de esporos sexuales.
Ascoporos : Esporos sexuales internos, ubicados dentro de un asco.
Basidiosporo: Esporos sexuales externos, producidos por los Basidiomycetes.
Blastoporo : Talosporo formado por brotación en células levaduriformes o
pseudomicelio.
Cenocítico:Elemento celular polinucleado, sin tabiques.
Clamidosporo: Talosporo de pared celular gruesa y abundante material de reserva.
Conidia: Esporo asexuado, sin envoltura, septado o no.
Esporangio: Elemento del micelio de fructificación propio de los Zigomycetes, que
contiene en su interior un gran número de esporos asexuales.
Esporangiosporos: esporos asexuales internos, ubicados dentro de un esporangio.
Esporo: Elemento fúngico con vida latente, destinado a la reproducción de las
especies.
Hifa: Rama de un micelio.
Hongo imperfecto: Especie fúngica de la cual se desconoce el modo de reproducción
sexual.
Hongo perfecto: Especie fúngica de la cual se conoce su fructificación sexual y
asexual.
Levadura: Hongo unicelular.
Micelio: Thalo de las especies filamentosas.

Seudomicelio filamentoso: Conjunto de prolongaciones, semejantes a hifas de
micelio ramificado y tabicado, producidos por ciertas levaduras en determinadas
condiciones de desarrollo, presenta estrangulamiento en lugar de verdaderos septos.
Rizoides: Hifas vegetativas modificadas, semejantes a raices que cumplen la función
de fijación.
Septo: Término usado como sinónimo de tabique.
Talosporos: Elementos vegetativos de propagación de las especies fúngicas.
Zigosporo: Elemento de la reproducción sexual de los Zigomycetes, producto de la
unión de dos elementos sexuales no diferentes morfológicamente.

9.10. Bibliografía
- Basualdo, Coto, De Torres; 1996. Microbiología Biomédica, Ed. Atlante, 1ª edic.
- CURTIS BARNES. 1994. Biología, Ed. Panamericana, 5ª ed.
- “Carlos G. Malbrán”, Depto de Micología. Manual “Diagnóstico de Micosis
Superficiales”

62

Capítulo 10:
Parasitología
10.1 Objetivos:

Tomar conocimiento de algunos géneros de la Biología Parasitaria, ya sean
unicelulares (protozoos) o pluricelulares (metazoos), que tiene interés para la
salud pública.

10.2 Introducción:

La Parasitología es la parte de la Biología que estudia los fenómenos de
dependencia entre seres vivos. El parasitismo involucra a todos los organismos
que pueden vivir sobre seres humanos: bacterias, virus, hongos y parásitos.
Pero el campo de la parasitología médica esta circunscripto al estudio de los
protozoos y metazoos que afectan al hombre.
Se conocen con el nombre de parásitos a aquellos seres vivos que en parte o
en su totalidad de su existencia viven o dependen de otro organismo,
generalmente mas complejo, llamado hospedador.
Las parasitosis constituyen unos de los problemas de mayor importancia en
salud publica. En nuestro país, enfermedades parasitarias como enfermedad
de Chagas, hidatidosis y ascaridiasis constituyen patologías frecuentes de gran
repercusión económica.
Los parásitos pueden ser clasificados, por su número de células (metazoos:
pluricelulares y protozoos: unicelulares) y de acuerdo a su comportamiento
biológico (su grado de parasitismo, exigencia a la vida parasitaria, especificidad
parásito-hospedador, especificidad alimentaria, número de huésped necesarios
para el ciclo evolutivo, anormalidades de localización, localización habitual y
posición que ocupa en el organismo). En cuanto a la posición que ocupa en el
organismo podemos encontrar tanto ectoparásitos como endoparásitos.
Los endoparásitos son aquellos que viven dentro del cuerpo del hospedador:
en pulmones, tubo digestivo, hígado, otros órganos, tejidos, células. Los
ectoparásitos viven sobre la superficie del cuerpo del hospedador: parasitan
piel, mucosas de las cavidades naturales abiertas hacia el medio externo.

63

10.3 Clasificación de los parásitos:

1. Metazoos:

Taenia
Hymenolepis
Echinococcus
Cestodes Dipylidium
Spirometra
Platelmintos
Fasciola
Digenea
Schistosoma
Helmintos
(endoparásitos)
Enterobius
Ascaris
Ovíparos Uncinarias
Trichuris
Nematodes Strongyloides
Diocthopyma

Vivíparos Trichinella
Filarias

Clase Insecta Piojo
(3 pares de patas) Pulga

Artrópodos Clase Arácnia Sarna
(ectoparásitos) (4 pares de patas) Garrapata

Clase miriápodos no se comportan
(+ de 4 pares de patas) como parásitos

Los Helmintos, ya sean vermes o gusanos parásitos, son seres pluricelulares
(metazoos) ampliamente distribuidos en la naturaleza y comprenden el Phylum
Platyhelmintha: Platelmintos o gusanos planos y el Phylum Nematoda:
Nematodos o gusanos cilíndricos.

Los platelmintos son gusanos aplanados sin cavidad corporal, aparato digestivo
rudimentario, un aparato reproductor muy desarrollado y son hermafroditas. El
sistema excretor actúa como osmorregulador, termorregulador y excretor. El
sistema nervioso es rudimentario y sirve para originar el movimiento y la
respuesta a estímulos. No posee sistema circulatorio y carece de aparato
respiratorio, la mayoría son anaerobios facultativos.

64

Dentro de los platelmintos podemos encontrar a los trematodos y a los
cestodos. Todos los trematodos intestinales requieren un caracol de agua dulce
para actuar como huésped intermediario, son transportado por los alimentos
(peces, moluscos o plantas de agua dulce) y se están transformando en un
problema importante de la salud pública. En el caso de los cestodes la forma
adulta de la tenia se adquiere por la ingestión de las formas larvarias
contenidas en carnes o peces pocos cocidos o crudos. En algunos casos la
infección se adquiere por la ingestión accidental de ciertos artrópodos (pulgas).
Ejemplos de cestodes son: Echinococcus granulosus, Dipylidium caninum,
Taenia solium.
Ejemplos de trematodes son: Fasciola hepática, Heterophyes heterophyes.
Los nematodos poseen cuerpo cilíndrico, cavidad corporal, tubo digestivo
completo, sistema nervioso mas desarrollado que los platelmintos, son de sexo
separado y en general las hembras son mas grande que los machos, no
poseen sistema circulatorio ni aparato respiratorio. Ejemplos de ellos son:
Ascaris y Trichinella.
Los nematodos libre suelen habitar en suelo húmedos o en los sedimentos del
fondo de los depósitos de agua y se desarrollan en medios aerobios ricos en
bacterias y otros microorganismos. Por lo tanto se propagan en los filtros lentos
de arena, proliferan en las plantas de tratamiento aerobio y biológico de aguas
residuales y aparecen en grandes cantidades en los efluentes secundarios. Las
aguas superficiales que reciben tales efluentes pueden contener elevadas
cifras de estos organismos. Tienen capacidad para moverse libremente y son
resistente a la cloración, por lo tanto no son sensibles al tratamiento
convencional del suministro de agua.
En el anexo se encuentra una guía ilustrada de Helmintos.

2. Protozoos:

Flagelados Giardia lambia, Enteromonas hominis

Protozoos Ciliados Balantidium coli

(parásitos Amebas Entamoeba histolystica
unicelulares)
Esporozoos Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax

Los protozoos son microorganismos unicelulares que se clasifican por su
mecanismo de locomoción.

Los protozoos flagelados (Clase Mastigosphora) se desplazan mediante uno o
varios flagelos. La Giardia lambia es un patógeno de este grupo que causa
giardiasis.

Los protozoos ciliados (Clase Ciliophora) se desplazan mediante cilias quienes
se mueven en un patrón rítmico coordinado y el organismo se desplaza en
espiral.

65

Las amebas (Clase Rhizophoda o Sarcodina) se caracterizan por presentar
pseudópodos (falsos pies). El microorganismo mas significativo de este grupo
es la Entameba histolytica causante de la amebiasis.

Los esporozoos (Clase Aplicomplexa) son un gran grupo de protozoos que se
desarrollan como parásitos obligados. Se caracterizan por ser inmóviles en su
estado adulto y porque los alimentos los toman disueltos en fase acuosa a
través de las envolturas celulares.
Pueden causar enfermedad potencialmente fatal, son ingeridos no solo por
transmisión fecal-oral sino que también se ingieren por diversas carnes.
En este grupo se encuentra Cryptosporidium parvum, Plasmodium vivax,
Toxoplasma gondii.

Los protozoos patógenos del agua potable que presentan mayor interés son
Giardia lambia, Entamoeba histolística y Cryptosporidium. Todos ellos
producen diarrea o gastroenteritis de gravedad variable y han sido
considerados agentes causales de distintos brotes epidémicos de origen
hídrico, especialmente Giardia. Los métodos para la identificación de protozoos
no están bien normalizados y deben ser considerados como procedimientos de
investigación susceptibles a modificación.

10.4 Bibliografía

APHA, AWWA, WPCF; “Métodos Normatizados para el análisis de aguas
potables y residuales”. Ed. Díaz de Santos, S.A. (1992)

Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack. Brock, Biología de los
Microorganismos. Editorial Pretice Hall. Decima edición. 2004.

66

Capitulo 11:
Reino Protista (Algas y Protozoos)

11.1 Objetivo

− Tomar conocimiento del manejo de las algas y protozoos importantes
para la salud o como indicadores de calidad.

11.2 Introducción

La calidad del agua afecta a las poblaciones nativas de organismos acuáticos,
en cuanto a su abundancia, especies que la componen, productividad y
condición fisiológica. Por ello, la naturaleza y salud de las comunidades
acuáticas son un expresión de la calidad del agua. Entre los métodos biológicos
utilizados para evaluar esa calidad, se incluyen la obtención, recuento e
identificación de organismos acuáticos; medida de la biomasa; determinación
de las tasas de actividad metabólica; medida de la toxicidad, bioconcentración
y bioacúmulo de contaminantes y procesado e interpretación de los datos
biológicos.

La información obtenida con este tipo de determinaciones puede servir para
uno o más de los fines siguientes:
1. Para explicar la causa del color y turbidez, y la presencia molesta de
olores, sabores y partículas visibles en el agua.
2. Ayudar en la interpretación de los análisis químicos, relacionando, por
ejemplo, la presencia o ausencia de algunas formas biológicas de
deficiencia o sobresaturación de oxígeno en las aguas naturales.
3. Identificar la fuente de un agua mezclada con otra.
4. Explicar la obstrucción de conducciones, mallas o filtros, y ayudar al
diseño y funcionamiento de las plantas de tratamiento de aguas naturales y
residuales.
5. Determinar los tiempos óptimos para tratamiento de aguas superficiales
con alguicidas y controlar su eficacia.
6. Determinar la eficacia de las fases de tratamiento del agua de bebida y
ayudar a determinar la dosis eficaz de cloro dentro de una planta de
tratamiento, ya que esa dosis está relacionada con los materiales orgánicos
del agua.
7. Identificar la naturaleza, alcance y efectos biológicos de la
contaminación.
8. Indicar el curso de la autopurificación en las masas acuáticas.
9. Colaborar a explicar el mecanismo de los métodos de tratamiento
biológico de aguas residuales y servir de índice de su eficacia.
10. Ayudar a determinar el estado y eficacia de procesos unitarios en una
planta de tratamiento de aguas residuales.
11. Documentar la variabilidad a corto y largo plazo de la calidad del agua,
debida a fenómenos naturales y/ o actividades humanas.
12. Proporcionar datos sobre el estado de un sistema acuático de una forma
regular.

67

La naturaleza concreta de un problema y las razones de obtención de las
muestras indicarán qué comunidades de organismos acuáticos deben ser
examinadas y la toma de muestras y técnicas analíticas que hay que utilizar.

El plancton, especialmente el fitoplancton, se ha utilizado como indicador de la
calidad dela agua. Algunas especies crecen en aguas muy eutróficas, mientras
otras son muy sensibles a los residuos orgánicos y/ o químicos. Algunas
especies producen olores y sabores molestos, o condiciones anóxicas o tóxicas
que dan lugar a la muerte de animales o enfermedades en el hombre. El
conjunto de especies del fitoplancton y zooplancton también puede ser útil para
evaluar la calidad del agua.

11.3 Algas unicelulares

Las algas son organismos autótrofos, que realizan fotosíntesis. Viven el lugares
húmedos y pueden realizar simbiosis con otros organismos, tales como
hongos, para formar líquenes, o celenterados para formar corales. Todas
tienen clorofila a y hasta tres pigmentos accesorios. Se clasifican según: tipos
de clorofilas que poseen, polímeros de reserva y estructura de la pared celular.
Existen tres clases de algas unicelulares:
• Euglena
• Algas verdes
• Diatomeas
• Dinoflagelados

En el caso de la Euglena se describe como en flagelado fototrófico que
contiene clorofila que permite el crecimiento fotosintético, sin embargo, en la
oscuridad Euglena puede sobrevivir y crecer como un quimioorganotrofo y,
como tal, es indistinguible de los protozoos. Se conocen varios euglenoides y
son exclusivamente acuáticos, por lo general se encuentran en aguas dulces
siendo saprofitas. A diferencia de otros protozoos flagelados, los euglenoides
no son patógenos (Madigan M, 2004).

11.4 Protozoos

Los protozoos son protistas heterótrofos y la mayoría pueden moverse por si
mismo. Son organismos unicelulares demasiado pequeños para poder verlos
sin la ayuda del microscopio, prefieren la humedad. Se encuentran
frecuentemente en el agua dulce de la tierra, en los océanos y en el suelo.

Dentro de este grupo de organismos encontramos una gran variedad de
asociaciones biológicas, como son parasitismo (ver capitulo 8 Parásitos) y la
simbiosis, existiendo aproximadamente 27 especies parásitas para el hombre.

En los medios acuáticos la importancia de los protozoos heterótrofos radica en
ser un paso intermedio entre niveles tróficos, y se basa fundamentalmente en
tres razones:
1. Por consumo directo de materia orgánica del medio
2. Por proporcionar la formación de flóculos (acumulo de materia) a través
de la excreción de materiales mucilaginosos

68

3. Lo mas importantes, por ser los principales consumidores de las
poblaciones bacterianas que se desarrollan en el medio.

Existen varios tipos fisiológicos de especies de protozoos de vida libre, que
exigen variadas condiciones ecológicas para su existencia. Ello, conjuntamente
con su capacidad de adaptación en el transcurso del tiempo, su distribución
acuática amplia, y su capacidad de alcanzar una alta densidad de población en
poco tiempo, convierte a los protozoos en importantes indicadores de las
condiciones del agua, en un momento determinado. Esto genera interesantes
aportes en la prevención de problemas en plantas de tratamiento por cambios
en las condiciones de funcionamiento, ya que estos organismos pueden ser
sensibles a cambios bruscos de parámetros.

En el capitulo 8 Parásitos, se encuentra la clasificación de los protozoos.

11.5 Técnica para observación de Protistas

1. Preparar infusiones con muestras de hojarasca, humus del suelo, hojas de
vegetales y los introducimos en frascos etiquetados. Los dejamos reposar a
temperatura ambiente (entre 20ºC y 25ºC) durante una semana .
2. Tomar una muestra de agua con una pipeta pasteur y deposítala en el
centro de un portaobjetos. Coloca el cubreobjetos.
3. Observar la preparación al microscopio. Mover lentamente la preparación,
identificar y clasificar todos los microorganismos observados con ayuda de las
laminas de clasificación y tablas morfológicas.
4. Añadir unas gotas de rojo neutro por el borde del cubre para que penetre en
la preparación y poder ver los microorganismos, que por su transparencia son
difíciles de observar.

11.6 Bibliografía

− APHA, AWWA, WPCF; “Métodos Normatizados para el análisis de aguas
potables y residuales”. Ed. Díaz de Santos, S.A. (1992)

− Métodos para el Examen de las Aguas y de los Líquidos Cloacales. Examen
Prostitológico e Investigación de Quistes de Protozoos. Adm. General de
O.S.N (1967).

− Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack. Brock, Biología de
los Microorganismos. Editorial Pretice Hall. Decima edición. 2004.

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