Meseguer

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
MÉTODOS QUIMIOLUMINISCENTES EN QUÍMICA
ANALÍTICA
SUSANA MESEGUER LLORET
UNIVERSITAT DE VALENCIA
Servei de Publicacions
2004

Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el día 01 de
Juliol de 2004 davant un tribunal format per:
- D. Francisco Bosch Reig
- Dª. Mª Dolores Pérez Bendito
- D. Ángel Ríos Castro
- D. Miguel Valcárcel Cases
- Dª. Adela Sevillano Cabeza
Va ser dirigida per:
Dª. Pilar Campíns Falcó
Dª. Carmen Molins Legua
D. Jorge Verdú Andrés
©Copyright: Servei de Publicacions
Susana Meseguer Lloret
Depòsit legal:
I.S.B.N.:84-370-6001-X
Edita: Universitat de València
Servei de Publicacions
C/ Artes Gráficas, 13 bajo
46010 València
Spain
Telèfon: 963864115

I
UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
FACULTAD DE QUÍMICA
MÉTODOS
QUIMIOLUMINISCENTES
EN QUÍMICA ANALÍTICA
TESIS DOCTORAL
SUSANA MESEGUER LLORET
Abril 2004

III
UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
FACULTAD DE QUÍMICA
La Dra. Dña. Pilar Campíns Falcó, Catedrática del Departamento de Química
Analítica de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Valencia, la Dra.
Dña. Carmen Molins Legua, Titular del Departamento de Química Analítica de la
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Valencia, y el Dr. D. Jorge Verdú
Andrés, Titular del Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad de Valencia,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria, "Métodos quimioluminiscentes en Química Analítica",
realizada en el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Valencia,
constituye la Tesis Doctoral de Dña. Susana Meseguer Lloret.
Así mismo, certifican haber dirigido y supervisado tanto los diferentes aspectos del
trabajo como su redacción.
Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos la presente en Valencia a 1 de
Abril de 2004.
Dra. Pilar Campíns Falcó Dra. Carmen Molins Legua Dr. Jorge Verdú Andrés

VII
AGRAÏMENTS
• A Pilar, a Carmen i a Jorge, per tots els coneixements transmesos durant aquestos
anys, tant a nivell professional com personal. Gràcies també per l’amistat brindada,
això restarà per sempre.
• Als meus pares, a les meues germanes, cunyats i a tota la meua família, per animar-
me a fer açò i per estar sempre al meu costat. Sense vosaltres, no hauria arribat fins
ací.
• A Andrés, per viure amb mí cada moment d’esta Tesis, per saber entendre’m en els
moments durs i per haver compartit amb mi els moments de felicitat.
• A Eli i a Marc per el somriure que em lliuren cada dia.
• A Rosa i a Adela, per estar ahí quan vos he necessitat.
• A Yolanda, a Xelo, a Luis i a Alberto, per els dinars compartits, els moments de
recolçament al laboratori quan creus que les coses no t’eixiran mai, i també per les
rises que hem compartit i l’amistat que hem creat.
• A Miguel Valcárcel, a Marisol Cárdenas, a Mercedes Gallego i a tots els companys
del seu grup d’investigació, per haver-me acollit durant tres mesos i haver-me donat
l’oportunitat de treballar amb ells.
• A Ángeles i a Marta perquè els anys no han deixat anar la nostra amistat.
• A les meues amigues de la Facultat, per estar sempre tan pendents, per els cinc anys
de carrera compartits, i per els que ens queden per viure juntes.
• Als meus amics i amigues per el recolçament demostrat.

IX
ÍNDICE
TÍTULO ...................................................................................................................... I
INDICE ....................................................................................................................... IX
LISTADO DE FIGURAS .......................................................................................... XV
LISTADO DE TABLAS ............................................................................................ XVIII
LISTADO DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS .................................................. XXI
OBJETIVOS............................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 7
1.1. Consideraciones sobre el análisis de agua y analitos estudiados ................... 9
1.1.1. Características de las aguas ................................................................... 9
1.1.2. Características de los analitos estudiados y legislación aplicable a los
mismos ............................................................................................................. 12
1.1.2.1. Descripción de los analitos estudiados .................................. 12
1.1.2.2. Legislación aplicable ............................................................. 13
1.2. Características y tende ncias del análisis medioambiental ............................ 15
1.3. Quimioluminiscencia ........................................................................................... 18
1.3.1. Perspectiva Histórica ............................................................................. 18
1.3.2. Fundamentos y Mecanismos ................................................................. 20
1.3.3. Características de la quimioluminiscencia como técnica analítica ....... 21
1.3.3.1. Ventajas y limitaciones de la técnica ..................................... 21
1.3.3.2. Tendencia actual .................................................................... 23
1.3.4. Reacciones Quimioluminiscentes .......................................................... 24
1.3.5. Reacciones quimioluminiscentes directas en fase líquida ..................... 26
1.3.5.1. Reacciones del Luminol y sus análogos ................................ 26
1.3.5.2. Reacción de los ésteres de acridinio ...................................... 28
1.3.5.3. Reacción de Tris (2,2’-bipiridina) rutenio (III) ..................... 29
1.3.5.4. Reacciones bioluminiscentes ................................................. 29
1.3.5.5. Reacciones de oxidación directa ........................................... 30
1.3.6. Reacciones quimioluminiscentes indirectas en fase líquida .................. 30
1.3.6.1. Reacciones con dioxoetanos (directas e indirectas) .............. 30
1.3.6.2. Reacciones con peroxioxalatos .............................................. 31
1.4. Reactivos .............................................................................................................. 34
1.5. Aparatos, montajes, instrumentación y software ............................................. 36
1.6. Bibliografía .......................................................................................................... 42

X
2. RESULTADOS OBTENIDOS Y DISCUSIÓN ................................................... 47
2.1. REACCIÓN DEL TCPO .................................................................................... 49
2.1.1. Screening de aminas alifáticas y disminución de sus límites de
detección en aguas ......................................................................................... 49
2.1.1.1. Preconcentración y dansilación de aminas alifáticas
utilizando cartuchos C18 de extracción en fase sólida. Aplicación al
análisis de screening en muestras medioambientales de agua ............ 49
Derivatización en disolución ................................................. 52
Preconcentración y derivatización en cartuchos C18 ............ 52
Separación cromatográfica .................................................... 55
Características analíticas ........................................................ 55
Análisis de muestras de agua ................................................. 58
Conclusiones ......................................................................... 60
2.1.1.2. Derivatización en línea de aminas alifáticas con Dns-Cl
acoplada a HPLC con detección fluorescente .................................... 62
Condiciones de enriquecimiento, lavado y derivatización .... 62
Condiciones cromatográficas ................................................ 63
Análisis de muestras de agua ................................................ 65
Conclusiones ......................................................................... 65
2.1.1.3. Determinación de aminas alifáticas en agua mediante HPLC
con detección quimioluminiscente ..................................................... 67
Condiciones de preconcentración y condiciones pre y post
columna ................................................................................. 68
Condiciones cromatográficas ................................................ 70
Curvas de calibrado y parámetros analíticos ......................... 71
Comparación con otros sistemas de detección ...................... 75
Conclusiones .......................................................................... 76
2.1.2. Disminución de l límite de detección de amonio en agua e
incremento de la exactitud de su de terminación ....................................... 77
2.1.2.1. Determinación de amonio en muestras de agua utilizando el
reactivo OPA-NAC. Estudio comparativo con los métodos de
Nessler y Electrodo Selectivo de amonio ........................................... 79
Método de OPA-NAC ........................................................... 79
Estudios de confirmación: Método de OPA-NAC, Nessler y
Electrodo Selectivo ................................................................ 82
Revisión del Método de Nessler ............................... 82
Revisión del Método de Electrodo Selectivo ............ 83
Aplicación del Método de Nessler ............................ 84
Aplicación del Método de Electrodo Selectivo ........ 85
Aplicación del Método de OPA-NAC ...................... 86
Comparación de resultados .................................................... 87
Conclusiones .......................................................................... 88

XI
2.1.2.2. Determinación quimioluminiscente de amonio en aguas por
HPLC .................................................................................................. 89
Optimización de la dansilación precolumna de amonio ........ 90
Conclusiones .......................................................................... 99
2.1.3. Método de screening de muestras para Cu(II) ................................. 100
2.1.3.1. Método automático de inyección en flujo para el screening
de muestras de agua para Cu(II), basado en la reacción
quimioluminiscente de coproporfirina I-Cu (II) / TCPO / H2O2 ........ 101
Estudio de la señal del Detector de Quimioluminiscencia
FireFly ................................................................................... 101
Optimización del sistema de flujo ......................................... 102
Sensibilidad y selectividad del método ................................. 103
Fiabilidad del método para el screening de muestras de agua
para Cu(II) ............................................................................. 105
Aplicación a muestras de agua .............................................. 106
Conclusiones .......................................................................... 107
2.2. REACCIÓN DEL LUMINOL ........................................................................... 109
2.2.1. Mejora de la exactitud de la determinación de Cr(III), Cr(VI), y
Co(II) .............................................................................................................. 109
2.2.1.1. Elaboración de una guía para la eliminación de errores
sistemáticos en la especiación de Cr(III) y Cr(VI) empleando la
reacción del Luminol con H2O2. Aplicación a muestras de agua ....... 110
Modelos de Calibración para Cr(III), Cr(VI) y Cr Total ....... 111
Estudio de interferencias ....................................................... 114
Aplicación a muestras reales ................................................. 115
Método de adición estándar (MOSA) ....................... 115
Muestra de HCl ......................................................... 116
Muestras de agua ...................................................... 117
Conclusiones .......................................................................... 118

XII
2.2.1.2. Influencia de los protocolos de acondicionamiento de
muestras de agua en la detección quimioluminiscente de elementos
traza .................................................................................................... 119
Señal QL de muestras no acidificadas (sin acondicionar) ..... 121
Señal QL de muestras acondicionadas con HCl 5· 10-3
M ..... 124
Señal QL de muestras acondicionadas con HNO3 0.5 M ...... 125
Aplicabilidad ......................................................................... 127
Conclusiones .......................................................................... 129
2.2.1.3. Calibración multivariada aplicada a la determinación
quimioluminiscente simultánea de Cobalto y Cromo ........................ 130
Estudio de la señal quimioluminiscente ................................ 130
Evaluación de los modelos de calibración ............................. 131
Respuesta lineal ........................................................ 132
Respuesta no lineal ................................................... 133
Validación .............................................................................. 135
Conclusiones .......................................................................... 136
2.2.2. Determinación de Nitrógeno orgánico amino y amoniacal ............ 138
2.2.2.1. Método fluorimétrico de Roth modificado para muestras de
agua: determinación simultánea de amonio y grupos amino primario
y su utilidad en la determinación del Nitrógeno Kjeldahl Total ........ 139
Etapa de calibración ............................................................... 140
Precisión y exactitud .............................................................. 143
Método Kjeldahl .................................................................... 144
Conclusiones ......................................................................... 149
2.2.2.2. Método quimioluminiscente automático para la estimación
total del Nitrógeno orgánico (-CH2-NH-) y amonio ........................... 150
Parámetros analíticos ............................................................. 150
Respuesta de compuestos de Nitrógeno ................................ 152
Selectividad del método: Estudio de interferencias ............... 155
Tratamiento Kjeldahl ............................................................. 156
Conclusiones ......................................................................... 158
2.3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 161
3. CONCLUSIONES FINALES ............................................................................... 167

XIII
4. APÉNDICES ........................................................................................................... 177
Apéndice 1. *Preconcentration and dansylation of aliphatic amines using C18
solid-packings. Application to the screening analysis in environmental water
samples. 181
Apéndice 2. *Derivatization on solid supports: An alternative method for
solution derivatization of amines in several matrices. 183
Apéndice 3. *Sensitive determination of aliphatic amines in water by High-
Performance Liquid Chromatography with chemiluminescence detection. 185
Apéndice 4. *Ammonium determination in water samples by using OPA-NAC
reagent: A comparative study with Nessler and Ammonium Selective Electrode
methods. 187
Apéndice 5. Selective chemiluminescence determination of ammonium in water
by HPLC. 189
Apéndice 6. FI automatic method for the determination of copper(II) based on
coproporphyrin I - Cu(II) / TCPO / H2O2 chemiluminescence reaction for the
screening of waters. 205
Apéndice 7. *A guide to avoid method bias of Chromium (III, VI)
chemiluminescence determination by luminol-hydrogen peroxide reaction.
Application to water samples. 217
Apéndice 8. *Influence of water sample storage protocols in chemiluminescence
detection of trace elements. 219
Apéndice 9. *Multivariate calibration applied to simultaneous determination of
cobalt and chromium. 221
Apéndice 10. Modified Roth’s fluorimetric method for water samples:
ammonium and primary amine groups determination and utility in total nitrogen
Kjeldahl. 223
Apéndice 11. Chemiluminescence authomatic method for total estimation of
organic nitrogen (-CH2-NH-) and ammonium. 239
* De los Apéndices marcados solo se detalla la referencia bibliográfica y el enlace URL en el caso de que la
versión electrónica esté contratada por la Universitat de València, ya que se trata de artículos publicados en
revistas comerciales.

XV
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismos de las reacciones quimioluminiscentes ......................................... 20
Figura 2. Intensidad de emisión quimioluminiscente frente al Tiempo ............................ 22
Figura 3. Número de publicaciones en revistas científicas de ámbito internacional
frente a cada año desde 1979 a 2003 .................................................................................. 23
Figura 4. Mecanismo propuesto para la reacción del luminol ........................................... 26
Figura 5. Mecanismo de la reacción QL de los ésteres de acridinio ................................. 28
Figura 6. Mecanismo de la reacción QL de dioxoetanos .................................................. 31
Figura 7. Mecanismo propuesto para la reacción QL con peroxioxalato .......................... 31
Figura 8. A) Equipo cromatográfico HP1100. B)Detectores UV/vis y Fluorímetro ........ 36
Figura 9. Espectrofotómetro HP 8452 conectado a un PC Hewlett Packard Vector XM
5/90 ..................................................................................................................................... 37
Figura 10. Equipo cromatográfico 1050, Sistema post-columna PCX-5100, detector
Jasco CL-1525 e interfaz Hercule Lite ............................................................................... 37
Figura 11. Fluorímetro modelo F4500 .............................................................................. 38
Figura 12. Fluorímetro Jasco FP-750 ................................................................................ 38
Figura 13. Detector FireFly CL ......................................................................................... 38
Figura 14. Esquema correspondiente a la derivatización en línea acoplada a la
separación cromatográfica (Apéndice 2) ...................................................................... 39
Figura 15. Esquema correspondiente a la separación cromatográfica de aminas
alifáticas (Apéndice 3) / amonio (Apéndice 5) acoplada a un sistema de reacción
post-columna con detección quimioluminiscente ....................................................... 39
Figura 16. Sistema FIA utilizado en el Apéndice 6 .................................................... 40
Figura 17. Sistema FIA utilizado en los Apéndices 7 y 8 ........................................... 40
Figura 18. Sistema FIA utilizado en el Apéndice 11 .................................................. 41
Figura 19. Área de Pico frente a: A) pH de la reacción. B) Tiempo de reacción. C)
Temperatura de la reacción. (♦ Metilamina, Etilamina, • N-Propilamina, ××
Butilamina, ∗ Pentilamina. Condiciones: DnsCl 5 mM; Tampón borato 20 mM;
concentración de amina 5 mg/l.) ......................................................................................... 53
Figura 20. Cromatogramas para blanco ( ) y mezcla de aminas ( ) con
detección A)UV a 333 nm, y B) Fluorescencia λexc = 350 nm / λem = 530 nm .................. 56
Figura 21. Porcentajes de recuperación en dos muestras de agua diferentes, para las
diferentes aminas a diferentes niveles de concentración .................................................... 58
Figura 22. Cromatogramas para: a) Muestra 4. b) Muestra 4 fortificada con la mezcla
de 1.25 mg/L de cada amina ............................................................................................... 59
Figura 23. Cromatogramas para la derivatización en línea de aminas alifáticas con
Cloruro de dansilo para un blanco y una mezcla de aminas ............................................... 64
Figura 24. Cromatograma de screening de una muestra de agua residual ........................ 65
Figura 25. Porcentajes de recuperación para las diferentes aminas estudiadas en función
del volumen de muestra procesado ..................................................................................... 69
Figura 26. Cromatogramas correspondientes a blanco, patrón de aminas alifáticas y
patrón de aminas alifáticas + aminas biogénicas, utilizando el gradiente de Fase Móvil
1. R-reactivo, 1-MA (concentración 0.15 mg/l), 2- EA (0.240 mg/l), 3-BA (0.3 mg/l), 4-
DEA (0.48 mg/l), 5-PeA (0.3 mg/l), 6-HA (0.3 mg/l), 7-Put (0.3 mg/l), 8-Cad (0.3
mg/l), 9-Spd (0.3 mg/l), 10-Spm (1.12 mg/l) ..................................................................... 70

XVI
Figura 27. Cromatogramas correspondientes a blanco y patrón de aminas alifáticas +
aminas biogénicas, utilizando el gradiente de Fase Móvil 2. R-reactivo, 1-MA (0.15
mg/l), 2-EA (0.240 mg/l), 3-BA (0.3 mg/l), 4-DEA (0.48 mg/l), 5-PeA (0.3 mg/l), 6-
HA(0.3 mg/l), 7-Put (0.3 mg/l), 8-Cad (0.3 mg/l), 9-Spd (0.3 mg/l), 10-Spm (1.12 mg/l). 71
Figura 28. Cromatogramas correspondientes a una muestra de agua residual utilizando
la Fase Móvil 1 y la fase Móvil 2. R:reagent, 1-MA, 5-PeA y 7-Put ................................. 75
Figura 29. Señal fluorescente frente al tiempo. a) λexc = 415 nm / λemisión = 485 nm; b)
λexc = 333 nm / λem = 462.5 nm .......................................................................................... 80
Figura 30. Espectros de emisión de fluorescencia. a) λexc = 415 nm / λemisión = 485 nm (t
reacción 5 min); b) λexc = 333 nm / λem = 462.5 nm (t reacción 2 min) ............................. 80
Figura 31. Curvas de calibrado de: 1-Amonio. 2-Amonio en presencia de MA (1 mg/l). 83
Figura 32. Curvas de calibrado de: a) Aminas. b) Aminas en presencia de 1 mg/l de
amonio. (♦ metilamina, etilamina, isopropilamina, ×× β-feniletilamina) ..................... 83
Figura 33. Pendientes de las curvas de calibrado al aplicar el Método de Nessler en las
diferentes condiciones estudiadas. (♦ Agua de riego (S1), Agua residual (S2),
Agua de fuente (S3). Condiciones: NR1 or NR2 (Reactivo de Nessler 1 o 2); T: Muestra
Tratada; NT: Muestra no tratada; TNC: Muestra tratada sin declorar; V:Volumen de
muestra (mL); Volumen total=2.5 mL) .............................................................................. 84
Figura 34. Gráfico de Youden a diferentes tiempos para la muestra de agua residual ..... 85
Figura 35. Cromatogramas del blanco y patrón de amonio de 0.187 mg/L en las
condiciones óptimas de derivatización ............................................................................... 91
Figura 36. Altura de pico del Blanco frente a Volumen de Acetonitrilo (Concentración
de DnsCl fija 0.45 mM) o frente a concentración de DnsCl (Volumen de acetonitrilo fijo
0.4 mL) ............................................................................................................................... 92
Figura 37. Cromatogramas correspondientes a: 1. Blanco. 2. Patrón de amonio de
8µg/L (LD). 3. Mezcla de varias aminas contaminadas de amonio: MA 0.1 mg/L, EA
0.2 mg/L, N-PrA 0.3 mg/L, DMA 0.3 mg/L, BA 0.3 mg/L, DEA 0.5 mg/L, PeA 0.3
mg/L y HA 0.3 mg/L .......................................................................................................... 94
Figura 38. Cromatogramas de las muestras de agua (3 réplicas). A) Agua residual. B)
Agua de lago ....................................................................................................................... 95
Figura 39. Cromatogramas de la muestra de agua de fuente fortificada con 0, 0.15 y 0.3
mg/L de amonio .................................................................................................................. 97
Figura 40. A) Espectro de emisión QL del blanco de Coproporfirina I. B) Curva
cinética de la reacción QL Coproporfirina I/TCPO/H2O2 .................................................. 102
Figura 41. Registros de inyección en flujo de los patrones de la curva de calibrado de
Cu(II) .................................................................................................................................. 104
Figura 42. Porcentajes de falsos positivos (%FP) y falsos negativos (%FN) en patrones
de Cu(II) a concentraciones cercanas al límite de detección (DL) ..................................... 106
Figura 43. Registros de señal para la curva de calibrado de Cr(VI) con HCl 5· 10
-3
M ..... 112
Figura 44. Curvas de calibrado potenciales para Cr(VI)(♦HCl 1· 10
-3
M, HCl 5· 10
-3
M) y para Mezclas (Cr(III)+Cr(VI))( HCl 1· 10
-3
M, ×× HCl 5· 10
-3
M) ........................... 113
Figura 45. Influencia del efecto matriz en las curvas potenciales (♦Conversión 100%.
Conversión 80 %. Conversión 120%.) ...................................................................... 115
Figura 46. Señales quimioluminiscentes para Cr, Co y Material Estándar de Referencia
(SRM © 1640). Procedimiento en estático ......................................................................... 126

XVII
Figura 47. Pendiente de la curva de calibrado en el intervalo lineal en las diferentes
condiciones experimentales. 1: Sin acondicionar; 2: HCl 5· 10
-3
; 3: HNO3 0.5; 4: EDTA
10
-2
; 5: EDTA 1· 10
-2
, HCl 5· 10
-3
; 6: EDTA 5· 10
-3
; 7: EDTA 5· 10
-3
, HCl 5· 10
-3
; 8:
EDTA 10
-2
(portador KOH); 9: EDTA 10
-2
(portador tamón); 10: EDTA 5· 10
-3
(portador KOH); 11: EDTA 5· 10
-3
(portador tampón); 12: EDTA 10
-2
(portador
tampón), HCl 5· 10
-3
; 13: EDTA 5· 10
-3
(portador KOH), HCl 5· 10
-3
; 14: EDTA 5· 10
-3
(portador tampón), HCl 5· 10
-3
. (Concentración: mol/L) .................................................... 127
Figura 48. Porcentajes de recuperación de la señal para diferentes mezclas de metales .. 128
Figura 49. Porcentajes de recuperación del SRM © 1640 respecto a mezcla de patrones
en diferentes condiciones experimentales .......................................................................... 129
Figura 50. Perfiles normalizados Intensidad-Tiempo para Cr y Co .................................. 131
Figura 51. Perfiles experimentales Pendiente-Tiempo para Cr y Co, y perfil teórico de
la mezcla incluyendo el error heterocedástico .................................................................... 132
Figura 52. A) Diseño experimental 5
2
. B) Gráfico de puntuaciones con las dos primeras
CPs ...................................................................................................................................... 134
Figura 53. Espectros de emisión de fluorescencia para patrón de NH4
+
de 1.75 mg/L (a
λexc =333 nm y a λexc=415 nm) y patrón de MA de 0.375 mg/L (a λexc=333 nm y a
λexc=415 nm) ....................................................................................................................... 141
Figura 54. %Recuperación de NH4
+
calculado respecto a la señal (o pendiente)
obtenida sin Kjeldahl, a diferentes condiciones Kjeldahl (Tabla 67). Condición 2: n=7 :
5 patrones de 0.5 mg/L de NH4
+
y 2curvas de calibrado (0, 0.5, 1.25, 2, 2.75 mg/L NH4
+
y 0, 0.2, 0.5, 0.9, 1.3 mg/L NH4
+
respectivamente). Condición 3: n=4: 2 patrones de 0.5
mg/L de NH4
+
y 2 curvas de calibrado (0, 0.05, 0.25, 0.78 mg/L NH4
+
, y 0, 0.75, 0.75
mg/L NH4
+
). Condición 5: n=1: Curva de calibrado (0, 0.28, 0.56 mg/L NH4
+
).
Condición 6: n=3: Patrones de 0.375 y 0.75 (2 réplicas) mg/L NH4
+
................................ 145
Figura 55. %Recuperación de MA transformada a amonio y %Recuperación de MA no
transformada, calculados respecto a la señal obtenida sin Kjeldahl, a diferentes
condiciones Kjeldahl (Tabla 67). Condición 1: n=4 : 2 patrones de 0.5 mg/L y 2
patrones de 0.125 mg/L de MA. Condición 2: n=4: Patrones de MA de 0.086, 0.3875,
0.5 y 0.56 mg/L. Condición 4: n=2: Patrón de 0.5 mg/L de MA (2 réplicas). Condición
5: n=5: Patrón de 0.775 mg/L de MA (5 réplicas). Condición 6: n=2: Patrón de 1.3 mg/L
de MA (2 réplicas) .............................................................................................................. 145
Figura 56. Espectro de emisión de fluorescencia de los derivados OPA-NAC a 485 nm
(ëexc = 415 nm) para blanco, patrón de 0.75 mg/L de NH4
+
, 1.3 mg/L MA, 1.875 mg/L
EA y DMA, 2.465 mg/L N-PrA e IPA, 3.05 mg/L BA y DEA, 3.625 mg/L PeA, 4.215
mg/L HA, y 5.05 mg/L β-FEA. (56-A)-medidos antes del Kjeldahl. (56-B) medidos
después del Kjeldahl ........................................................................................................... 147
Figura 57. Registros de inyección en flujo obtenidos en las condiciones experimentales
óptimas a diferentes niveles de concentración de amonio (expresado en mg/L de
Nitrógeno) ........................................................................................................................... 151
Figura 58. Curvas de calibrado de amonio (Señal QL frente a mg/L N) obtenidas en
cinco días diferentes ........................................................................................................... 152

XVIII
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Concentraciones típicas normales (µg/L) de agua natural, agua de río y agua
marina ................................................................................................................................. 9
Tabla 2. Normativa vigente en materia de aguas ............................................................... 11
Tabla 3. Concentraciones máximas legisladas para los parámetros y tipos de agua
estudiados ........................................................................................................................... 14
Tabla 4. Métodos de referencia establecidos por la legislación y métodos más utilizados
recientemente ...................................................................................................................... 14
Tabla 5. Hechos históricos referidos a los fenómenos luminiscentes ................................ 18
Tabla 6. Principales reacciones quimioluminiscentes en fase gaseosa .............................. 25
Tabla 7. Principales reacciones quimioluminiscentes en fase líquida ............................... 25
Tabla 8. Principales características de algunos peroxioxalatos ......................................... 32
Tabla 9. Listado de reactivos, casas comerciales y pictogramas de seguridad .................. 34
Tabla 10. Condiciones de derivatización de aminas alifáticas .......................................... 50
Tabla 11. Parámetros de reacción estudiados .................................................................... 53
Tabla 12. Comparación entre la derivatización en cartucho y en disolución .................... 54
Tabla 13. Porcentajes de Recuperación en función del Volumen de muestra procesado .. 54
Tabla 14. Características analíticas para los derivados amina-dansilo con detección UV
o fluorescente ...................................................................................................................... 57
Tabla 15. Estudios de precisión. Repetibilidad (Desviación Estándar Relativa %) .......... 57
Tabla 16. Porcentajes de recuperación y desviación estándar relativa para cada analito
en las diferentes muestras de agua ...................................................................................... 59
Tabla 17. Concentraciones deducidas en la muestra de agua residual (% Error relativo) . 60
Tabla 18. Condiciones optimizadas e intervalos estudiados .............................................. 62
Tabla 19. Condiciones cromatográficas experimentales para la retención,
derivatización, separación y detección en línea de aminas alifáticas .................................
63
Tabla 20. Curvas de calibrado, parámetros analíticos y tiempos de retención para la
derivatización en línea de aminas alifáticas con Dns-Cl .................................................... 64
Tabla 21. Condiciones pre y postcolumna óptimas para la determinación de aminas....... 69
Tabla 22. Parámetros analíticos de los derivados amina-dansilo detectados por
quimioluminiscencia ........................................................................................................... 72
Tabla 23. Limites de detección (µg/l) obtenidos con detección quimioluminiscente a
diferentes volúmenes de muestra y diferentes volúmenes de elución. Comparación con
los valores obtenidos con otros sistemas de detección y reactivos ..................................... 72
Tabla 24. Estudios de precisión (DER %). Repetibilidad y reproducibilidad del método
utilizando diferentes volúmenes de muestra ....................................................................... 73
Tabla 25. Concentración de amina fortificada y concentración de amina fortificada
encontrada (µg/L) en muestras de agua reales .................................................................... 74
Tabla 26. Resumen de algunos procedimientos descritos en la bibliografía para la
determinación de amonio .................................................................................................... 78
Tabla 27. Diseño factorial de optimización de las concentración de reactivos y pH ........ 80
Tabla 28. Importancia e interacción entre los factores: pH, [OPA] y [NAC] ................... 81
Tabla 29. Curvas de calibrado de amonio y parámetros analíticos utilizando el reactivo
OPA-NAC .......................................................................................................................... 81
Tabla 30. Curvas de calibrado de amonio y parámetros analíticos utilizando el Método
de Nessler ........................................................................................................................... 82

XIX
Tabla 31. Concentración de amonio hallada en muestras reales utilizando los diferentes
métodos estudiados ............................................................................................................. 86
Tabla 32. Curvas de adición estándar para muestras reales utilizando el Método OPA-
NAC .................................................................................................................................... 87
Tabla 33. Propiedades analíticas de los tres métodos estudiados ...................................... 88
Tabla 34. Comparación del procedimiento de derivatización en disolución establecido
por Marcé y col. [67] y el procedimiento de derivatización en disolución optimizado ..... 92
Tabla 35. Ecuaciones de las curvas de calibrado (Atura de pico (Voltios) frente a
Concentración de NH4
+
(mg/L)) obtenidas en diferentes condiciones ............................... 93
Tabla 36. Estudios de precisión (%DER) y exactitud (%Er) proporcionados por el
método a diferentes niveles de concentración de amonio (n, número de réplicas) ............ 94
Tabla 37. Test t de comparación de pendientes de las ecuaciones del MOSA para todas
las muestras evaluadas con la pendiente de la curva de calibrado de patrones de amonio.
Los valores tabulados corresponden a un nivel de confianza del 95 % excepto *(98 %) y
**(99 %) ............................................................................................................................. 96
Tabla 38. Concentración de amonio encontrada en muestras reales fortificadas con
amonio a diferentes niveles de concentración antes y después del tratamiento Kjeldahl .. 97
Tabla 39. Respuesta de screening y Concentración de amonio deducida para las
muestras estudiadas ............................................................................................................ 98
Tabla 40. Comparación de sensibilidad de los detectores en la reacción QL
Cr(III)/luminol/H2O2 .......................................................................................................... 101
Tabla 41. Optimización de las variables químicas y físicas del sistema de inyección en
flujo ..................................................................................................................................... 102
Tabla 42. Curvas de calibrado de Cu(II) y parámetros analíticos en diferentes
condiciones (IL: Intervalo lineal; LD: Límite de detección) .............................................. 103
Tabla 43. Estudio de la interferencia de iones metálicos ................................................... 105
Tabla 44. Resultados obtenidos en el screening y determinación de Cu(II) en muestras
de agua reales ...................................................................................................................... 106
Tabla 45. Estudios recientes basados en la reacción del luminol-H2O2 para cromo ......... 111
Tabla 46. Curvas de calibrado para Cr(III) y Cr(VI) ......................................................... 112
Tabla 47. Curvas de calibrado en el intervalo lineal para las mezclas de Cr(III)+Cr(VI) . 113
Tabla 48. Parámetros analíticos para las determinaciones de Cr(III), Cr(VI) y Cr Total .. 114
Tabla 49. Curvas de calibrado simuladas y reales utilizando modelos de calibración
polinómicos ........................................................................................................................ 116
Tabla 50. Pendientes y porcentajes de recuperación para la muestra de HCl ................... 116
Tabla 51. Determinación de Cromo en una muestra de agua mineral ............................... 117
Tabla 52. Estudios de la determinación quimioluminiscente en flujo de iones metálicos
en muestras de agua ............................................................................................................ 120
Tabla 53. Composición del material de referencia certificado SRM © 1640: agua dulce. 121
Tabla 54. Parámetros analíticos para la determinación de Cr(III), Co(II) y Cu(II) en
muestras no acidificadas. Procedimiento en flujo .............................................................. 123
Tabla 55. Parámetros analíticos de las curvas de calibrado de patrones no acidificados
utilizando el procedimiento en estático .............................................................................. 124
muestras acidificadas con HCl 5· 10
-3
M. Procedimiento en flujo ...................................... 125
muestras acidificadas con HNO3 0.5 M. Procedimiento en flujo ....................................... 126
Tabla 58. Modelos PLS en el intervalo lineal .................................................................... 133
Tabla 59. Modelos de PLS en el intervalo no lineal .......................................................... 134

XX
Tabla 60. Modelos de PLS en condiciones ácidas ............................................................. 135
Tabla 61. Rectas de regresión lineal Valor Predicho frente a Valor Real ......................... 135
Tabla 62. Predicción para el material de referencia certificado (µg/L, n=5) ..................... 136
Tabla 63. Código y concentración del conjunto de patrones de calibración (diseño 5
2
) ... 140
Tabla 64. Parámetros analíticos y resultados estadísticos de metilamina en presencia de
cantidades variables de amonio, y amonio en presencia de cantidades variables de
metilamina .......................................................................................................................... 142
Tabla 65. Características de los modelos de Regresión en Componentes Principales
obtenidos para amonio y metilamina utilizando Selección Top Down (TDS), Selección
del mejor Subconjunto (BSS) o Eliminación de las Variables no informativas-Selección
del mejor Subconjunto ........................................................................................................ 143
Tabla 66. Concentración de amina y amonio hallada en mezclas de patrones aplicando
calibración bivariada o multivariada (PCR) ....................................................................... 144
Tabla 67. Diferentes condiciones Kjeldahl ensayadas ....................................................... 146
Tabla 68. Porcentajes de recuperación de amonio para las diferentes aminas y mezclas
de aminas después del Kjeldahl, con el Método OPA-NAC a 485 nm o con el Método
Nessler ................................................................................................................................ 146
Tabla 69. Concentración de amina y amonio hallada en muestras reales aplicando
calibración bivariada o multivariada (PCR) ....................................................................... 148
Tabla 70. Curvas de calibrado de amonio (Señal QL frente a Concentración de
Nitrógeno (mg/L)) y otros parámetros analíticos en diferentes condiciones
experimentales estudiadas .................................................................................................. 151
Tabla 71. Porcentajes de recuperación (bamina*100/bNH4+) para aminas alifáticas
primarias y secundarias individualmente y % Recuperación medio .................................. 153
Tabla 72. Porcentajes de recuperación (bpoliamina*100/bNH4+) para poliaminas
individualmente y %Recuperación medio .......................................................................... 154
Tabla 73. Porcentajes de recuperación (baminoacido*100/bNH4+) para aminoácidos
individualmente y %Recuperación medio .......................................................................... 154
Tabla 74. %Recuperación individual y %Recuperación medio hallado en patrones de
TEA, urea, Histidina y arginina de concentracición final de Nitrógeno de 1.5 mg/L, y
para mezclas de MA/PeA/DMA (Conc final Nitrógeno 1.5 mg/L) y
MA/PeA/DMA/TMA (Conc final Nitrógeno 1.8 mg/L), después del tratamiento
Kjeldahl .............................................................................................................................. 156
Tabla 75. Concentración de Nitrógeno hallado en muestras de agua reales fortificadas y
porcentajes de recuperación a diferentes niveles de concentración .................................... 157
Tabla 76. Concentración de Nitrógeno Total (Orgánico más amoniacal) (mg/L N)
encontrada en las diferentes muestras de agua estudiadas, antes y después del
tratamiento Kjeldahl ........................................................................................................... 157
Tabla 77. Principales características de los métodos propuestos en esta Tesis ................. 169
Tabla 78. Ventajas de los métodos propuestos .................................................................. 171

XXI
LISTADO DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
%CV Coeficiente de variación (%)
%Er Error relativo (%)
λem Longitud de onda de emisión
λexc Longitud de onda de excitación
β-FEA β-Feniletilamina
ABEI Aminobutiletilisoluminol
BA Butilamina
Cad Cadaverina
CPs Componentes Principales
CTAC Cloruro de Cetil Trimetil amonio
DEA Dietilamina
DER Desviación estándar residual
DMA Dimetilamina
DNB Dinitrobenzoilo
DNPO Bis(2,4-dinitrofenil)oxalato
Dns-Cl Cloruro de dansilo
EA Etilamina
ECL Electroquimioluminiscencia
EDTA Ácido Etilendiamintetracético
FIA Análisis por Inyección en flujo
FMOC Fluorenilmetilcloroformiato
GHPSAM Método de Adición Estándar al Punto H Generalizado
HA Hexilamina
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución
IL Intervalo lineal
IPA Isopropilamina
IV Válvula de inyección
LD Límite de detección
MA Metilamina
MOSA Método de Adición Estándar
NAC N-Acetil-L-Cisteina
N-PrA N-Propilamina
OPA Orto-ftaldialdehido
PCA Análisis en Componentes Principales
PCR Regresión en componentes principales
PeA Pentilamina
PLS Regresión Mínimos cuadrados parciales
PO-CL Quimioluminiscencia de los perioxalatos
Put Putrescina
PVA Poli Vinil Alcohol
QA Química Analítica
QL o CL Quimioluminiscencia
QLD Detector de Quimioluminiscencia
SEP Error de predicción

XXII
Spd Espermidina
Spm Espermina
SRM Material de referencia certificado
TCPO 2,4,6-triclorofenil oxalato
TEA Trietilamina
TKN Nitrógeno Kjeldahl Total
TMA Trimetilamina
TYB Blanco Total de Youden
UV Ultravioleta

OBJETIVOS
3
OBJETIVOS
El medio ambiente constituye el sustrato que permite la supervivencia del ser
humano, aportándole recursos esenciales para sus actividades económicas y productivas.
La Química Analítica puede contribuir junto con otras disciplinas al estudio, vigilancia y
aprovechamiento de los mencionados recursos para un desarrollo medioambientalmente
sostenible. Este término se define como el conjunto de vías de progreso económico, social
y político que atienden a las necesidades del presente sin comprometer la capacidad de las
generaciones futuras para satisfacer sus propias necesidades. Alrededor de este término
han nacido numerosas declaraciones, acuerdos, normas y leyes, introduciéndose en el
seno de la Comisión mundial para el medio ambiente y el desarrollo de Naciones Unidas,
más conocida como Comisión Brundtland, en 1980.
La necesidad de métodos analíticos sencillos, rápidos, libres de interferencias y
suficientemente sensibles para poder interpretar los datos medioambientales, controlar la
contaminación y establecer el papel de cada especie en los ciclos naturales, es más que
evidente. Las exigencias que le plantea el medio ambiente a la Química Analítica, se
resumen en los siguientes puntos:
§ Análisis de muy diferentes tipos de analitos, que incluyen desde especies inorgánicas
sencillas hasta complejas bio-moléculas
§ Matrices complejas y desconocidas, pudiendo ser líquidas, sólidas y gaseosas.
§ Micromuestras en algunas ocasiones y niveles de analitos del orden de trazas o
inferior.
§ Necesidad de automatización, dado el gran número de muestras a analizar.
§ Necesidad de análisis in situ, por lo que requiere de equipos portátiles y robustos o
sensores remotos.
§ Análisis de muy diferentes características.
§ Tratamiento de datos multivariable.
Esta Tesis aporta soluciones a algunos de los puntos antes mencionados. Se
proponen una serie de métodos y se revisan algunos de los ya existentes, mejorando el
análisis de metales, amonio y aminas en muestras de agua medioambientales, utilizando
la quimioluminiscencia como método de detección. Esta técnica puede aportar
sensibilidad, selectividad y bajo coste, resultando por tanto interesante su estudio. Se
pone en práctica el procedimiento analítico cubriéndose todas las etapas que lo
componen, abordando tanto el muestreo como el tratamiento de las muestra, la etapa de
calibración y el tratamiento y evaluación de los resultados.
Los analitos han sido elegidos por sus propiedades de toxicidad y por revestir
interés para el estudio de la eutrofización de aguas, lo que ha dado lugar a limitaciones
en sus concentraciones que se reflejan en la legislación. Actualmente, la investigación
tiende hacia la propuesta de sistemas sencillos totalmente automatizados, lo que hemos
conseguido en algunos de nuestros estudios.

4
Los proyectos concedidos al grupo de investigación y las becas disfrutadas, han
sido el marco de esta Tesis:
§ Proyecto PB97-1387 concedido por la Dirección General de Investigación Científica
y Tecnológica (DGICyT): “El método de adición estándar del punto H como método
de resolución de curvas. Aplicación a determinaciones quimioluminiscentes de
contaminantes ambientales”.Período de vigencia: 10-1998 a 10-2001.
§ Proyecto PPQ2000-1461 concedido por el Ministerio de Ciencia y Tecnología:
“Métodos totales de análisis de aminas en matrices de interés medioambiental”.
Período de vigencia: 28-12-2000 a 27-12-2003.
§ Ayudas a grupos de investigación: GR00-36 concedido por la Generalitat
Valenciana: “Establecimiento de métodos globales e interpretación de datos
analíticos de calidad”. Año 2000.
§ Ayudas a grupos de investigación: GRUPOS03-178 concedido por la Generalitat
Valenciana: “Establecimiento de métodos globales e interpretación de datos
analíticos de calidad”. Año 2003.
§ Proyecto BQU2003-6138 concedido por el Ministerio de Ciencia y Tecnología:
Métodos totales de análisis de amoníaco, aminas y triazinas en matrices de interés
ambiental: convencional, micro y nano”. Período de vigencia: 15-11-2003 a 14-11-
2006.
§ Beca predoctoral FPU (2000-2004) concedida por el Ministerio de Educación y
Cultura.
§ Beca para la realización de una estancia breve en el Departamento de Química
Analítica de la Universidad de Córdoba (período del 1 de Septiembre al 30 de
Noviembre de 2002), concedida por el Ministerio de Educación y Cultura.
Los objetivos específicos desarrollados se ajustan al siguiente esquema:
1. Screening de aminas alifáticas y disminución de sus límites de detección en
aguas: 1.1. Preconcentración y dansilación de aminas alifáticas utilizando cartuchos
C18 de extracción en fase sólida. Aplicación al análisis de screening en muestras de
agua medioambientales (Apéndice 1). 1.2. Derivatización en línea de aminas
alifáticas con Dns-Cl acoplada a HPLC con detección fluorescente (Apéndice 2). 1.3.
Determinación quimioluminiscente de aminas alifáticas en agua mediante HPLC
(Apéndice 3).
2. Disminución del límite de detección de amonio en agua e incremento de la
exactitud de su determinación: 2.1. Determinación de amonio en muestras de agua
utilizando el reactivo OPA-NAC. Estudio comparativo con los métodos de Nessler y
electrodo selectivo de amonio (Apéndice 4). 2.2. Determinación quimioluminiscente
de amonio en aguas por HPLC (Apéndice 5).
3. Método de screening de muestras para Cu(II): 3.1. Método automático de
inyección en flujo para el screening de muestras de agua para Cu(II), basado en la
reacción quimioluminiscente de coproporfirina I-Cu (II) / TCPO / H2O2 (Apéndice
6).

OBJETIVOS
5
4. Mejora de la exactitud de la determinación de Cr(III), Cr(VI) y Co(II): 4.1.
Elaboración de una guía para la eliminación de los errores sistemáticos en la
especiación de Cr(III) y Cr(VI) empleando la reacción del luminol con H2O2.
Aplicación a muestras de agua (Apéndice 7). 4.2. Influencia de los protocolos de
acondicionamiento de muestras de agua en la detección quimioluminiscente de
elementos traza (Apéndice 8). 4.3. Calibración multivariada aplicada a la
determinación quimioluminiscente simultánea de cobalto y cromo (Apéndice 9).
5. Determinación de Nitrógeno Orgánico amino y amoniacal: 5.1. Método
fluorimétrico de Roth para la determinación simultánea de amonio y grupos amino
primario en muestras de agua y su utilidad en la determinación del Nitrógeno
Kjeldahl Total. (Apéndice 10). 5.2. Método quimioluminiscente automático para la
estimación del Nitrógeno Orgánico amino (-CH2-NH-) y amonio en muestras de agua
mediante la reacción del Luminol con el Hipoclorito en medio básico. (Apéndice
11).

Capítulo 1. INTRODUCCIÓN
9
1.1. CONSIDERACIONES SOBRE EL ANÁLISIS DE AGUA Y
ANALITOS ESTUDIADOS
1.1. CARACTERÍSTICAS DE LAS AGUAS
La ciencia del medio ambiente comprende el estudio completo del entorno que
nos rodea y por ello necesita del apoyo de todas las ciencias, siendo por tanto
multidisciplinar. Un gran número de estudios, muestran la necesidad de conocer la
composición de las partes del medio implicado. No es posible por ejemplo, estudiar el
transporte de sustancias en el ciclo del agua, sin medir las sustancias que están siendo
transportadas.
La composición química de las aguas naturales depende entre otras de variables
como el tipo de agua, localización geográfica o estación del año [1]. Los constituyentes
mayoritarios (1-1000 mg/L) son Na+
, Ca2+
, Mg2+
, HCO3
-
, SO4
2-
y Cl-
, y las especies
minoritarias (0.1-10 mg/L) Fe2+
, Fe3+
, Sr2+
, K+
, CO3
2-
, NO3
-
, F-
, H3BO3. La presencia
natural de otras especies ocurre en un nivel de concentraciones inferior, como se expone
en la Tabla 1.
Tabla 1: Concentraciones típicas normales (µg/L) de agua natural, agua de río y agua
marina.
Elemento Natural Río Mar Elemento Natural Río Mar
Li 10 12 200 As 0.5 2 3
B 10 10 5000 Se 0.2 0.2 0.1
Al 10 50 2 Br 15 20 7000
Ti 5 10 1 Rb 1 20 120
V 0.5 1 2.5 Sr 70 60 8000
Cr 1 1 0.05 Mo 0.5 1 10
Mn 10 7 0.2 Cd 0.03 0.02 0.1
Fe 500 40 2 Sb 0.2 0.3 0.2
Co 0.05 0.2 0.02 I 2 10 60
Ni 0.5 0.3 0.05 Cs 0.02 0.04 0.1
Cu 3 5 2 Hg 0.07 0.007 0.03
Zn 15 20 10 Pb 1 3 0.03
Esta composición puede ser alterada por fuentes naturales o antropogénicas. La
contaminación del medio hídrico es un problema grave y con serias consecuencias que
ha afectado a numerosas zonas a pesar de la auto purificación del propio ciclo. El
resultado final es que la composición de las aguas está alterada por la presencia de
compuestos inorgánicos y orgánicos adicionales [1-3]. El ciclo del agua se verá afectado
por el aumento de la demanda biológica de oxígeno y los procesos de eutrofización, y
también por la acidificación y salinización de las aguas [4].

CONSIDERACIONES SOBRE EL ANÁLISIS DE AGUA Y ANALITOS ESTUDIADOS
10
Existen características específicas para cada tipo de agua contaminada:
§ Las aguas residuales urbanas e industriales son disoluciones acuosas complejas que
contienen una variada gama de compuestos orgánicos e inorgánicos, tanto disueltos
como en suspensión y también microorganismos [1]. Pueden contener
concentraciones puntuales muy elevadas de contaminantes, lo que puede originar
variaciones muy significativas en los equilibrios originando especies nuevas.
§ Las aguas subterráneas presentan problemas de salinidad debido a procesos de
infiltración del agua marina, y también de toxicidad debido al almacenamiento de
sustancias tóxicas en tanques subterráneos o a actividades agrícolas.
§ Las aguas costeras reciben la descarga directa de los ríos, vertidos de barcos o
liberación de materiales de protección de embarcaciones. Presentan problemas de
eutrofización, de bioacumulación de metales tóxicos en los moluscos o
contaminación microbiana. Los problemas a niveles profundos se deben a la difusión
desde la superficie o desde los sedimentos por lo que se estudian tanto gradientes
horizontales como verticales, ya que ambos definen su nivel de impacto y su
biodisponibilidad.
Dada la gran variedad de muestras de agua medioambientales y los problemas
que presentan, en esta Tesis se han estudiado diferentes tipos de agua, con el fin de
abarcar una parte de la amplia variabilidad que nos podemos encontrar en cuanto a la
matriz. Se han estudiado aguas: embotelladas, de grifo, de riego, de fuente, de lago,
residuales y marinas.
La legislación vigente en materia de aguas comprende por una parte las
Directivas Europeas, y por otra, las Órdenes, Leyes y Reales Decretos tanto estatales
como autonómicos. En la Tabla 2, se puede ver la normativa más representativa en los
diferentes ámbitos en materia de aguas. Las normativas estatales y autonómicas se ajustan
a las exigencias de la normativa europea, siendo igual o más restrictivas que ésta.

11
Tabla 2. Normativa vigente en materia de aguas.
Ámbito Normativa
Directiva 76/464/CEE del Consejo, de 4 de mayo de 1976, relativa a la contaminación
causada por determinadas sustancias peligrosas vertidas en el medio acuático de la
comunidad.
Directiva relativa a aguas de baño 76/160/CEE
Directiva relativa a aguas destinada al consumo humano 80/778/CEE Modificada por
la directiva 98/83/CEE.
Legislación
comunitaria
Directiv a 2000/ /CE del Parlamento Europeo y del Consejo por el que se establece un
marco comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas. (Directiva Marco
de Aguas ).
Real Decreto 849/1986, de 11 de abril, por el que se aprueba el Reglamento del Dominio
Público Hidráulico, que desarrolla los Títulos Preliminar, I, IV, V, VI y VII de la Ley
29/1985, de 2 de agosto, de Aguas.
Real Decreto 734/1988, de 1 de julio, establece normas de calidad de las aguas de baño
(BOE nº 167, de 13.07.88).
Ley 22/1988, de 28 de julio, de Costas. (BOE nº 181, de 29.07.88).
Real Decreto 1541/1994, de 8 de julio, que modifica el Anexo I del Reglamento de la
Administración pública del agua y de la planificación hidrológica aprobado por el Real
Decreto 927/1988, de 29 de Julio de 1988
Real Decreto 2116/1998, de 2 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto
509/1996, de 15 de marzo, de desarrollo del Real Decreto-Ley 11/1995, de 28 de
diciembre, por el que se establecen las normas aplicables al tratamiento de las aguas
residuales.
Orden de 13 de agosto de 1999 por la que se dispone la publicación de las
determinaciones de contenido normativo del Plan Hidrológico de Cuenca del Júcar ,
aprobado por el Real Decreto 1664/1998, de 24 de julio.
Real Decreto 995/2000, de 2 de junio, por el que se fijan objetivos de calidad para
determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Público
Hidráulico, aprobado por el Real Decreto 849/1986, de 11 de abril.
Real Decreto Legislativo 1/2001, de 20 de julio, por el que se aprueba el texto refundido
de la Ley de Aguas (Deroga la Ley 29/1985, de 2 de agosto, de Aguas)
Legislación
estatal
Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el que se establecen los criterios sanitarios
de lacalidad del agua de consumo humano.
Ley 7/1986, de 22 de diciembre, sobre utilización deaguas para riego.
Ley 2/1992, de 26 de marzo, de saneamiento de las aguas residuales de la Comunidad
Valenciana.Legislación
autonómica Orden de 3 de junio de 2003, de la Conselleria de Agricultura, Pesca y Alimentación, por
la que se establece el Programa de Actuación sobre las Zonas Vulnerables designadas en
la Comunidad Valenciana.

12
1.2. CARACTERÍSTICAS DE LOS ANALITOS ESTUDIADOS Y
LEGISLACIÓN APLICABLE A LOS MISMOS.
Se han estudiado analitos de diferentes tipos; metales como Cr(III), Cr(VI),
Co(II) y Cu(II), amonio y nitrógeno total, aminas alifáticas primarias y secundarias
(metilamina (MA), etilamina (EA), butilamina (BA), pentilamina (PeA), hexilamina (HA),
dimetilamina (DMA), dietilamina (DEA) y β-feniletilamina (β-FEA)), y poliaminas
(Putrescina (Put), Cadaverina (Cad), Espermina (Spm) y Espermidina (Spd)).
1.1.2.1. Descripción de los analitos estudiados
Los metales se introducen en el ciclo del agua básicamente por residuos
industriales. Muchos de estos iones son tóxicos para el hombre y sus emisiones han de
monitorizarse y controlarse.
El Cromo es un contaminante común en aguas naturales y residuales y lo
podemos encontrar como Cr(III) o Cr(VI). Según el estado de oxidación de un elemento,
su biodisponibilidad y toxicidad varían drásticamente, de hecho, el Cr(VI) es mucho más
tóxico que el Cr(III). El Cr(III) no es tóxico a bajos niveles y se considera esencial en
mamíferos. La toxicidad del Cr(VI) como aerosol es bien conocida: produce daños en la
piel y sistema respiratorio, y puede producir cáncer [5]. Sin embargo, los efectos tóxicos
del Cr(VI) en agua no están bien documentados.
La contaminación con Cr(III) y Cr(VI) resulta de los vertidos de industrias de
curtidos, acero, tintes o de sectores de fabricación de productos como pinturas, pigmentos
o fungicidas. Este metal puede introducirse en aguas potables debido a los inhibidores de
corrosión utilizados en cañerías o recipientes.
El Cobalto se encuentra en las rocas, el suelo, el agua, plantas y animales.
Existen formas radioactivas y no radioactivas de cobalto. El cobalto no radioactivo,
llamado cobalto estable, se usa para producir aleaciones (mezclas de metales) usadas en
la manufactura de motores de aviones, imanes, herramientas para triturar y cortar,
articulaciones artificiales y también para colorear vidrio, cerámicas y pinturas y como
secador de esmaltes y pinturas para porcelana.
La población general está expuesta a bajos niveles de Cobalto en el aire, el agua y
los alimentos. El cobalto tiene efectos tanto beneficiosos como perjudiciales sobre la
salud. En bajos niveles, es parte de la vitamina B12, sustancia que es esencial para
mantener una buena salud. A niveles altos, puede dañar los pulmones y el corazón [6].
El Cobre se emplea en alambres y cables eléctricos y en algunas cañerías de
agua. También forma parte de aleaciones como latón y bronce. Las sales de Cobre se
utilizan comúnmente en la agricultura para tratar enfermedades de las plantas, como el
moho, para tratar agua, y como preservativos para alimentos, cueros y telas.
Bajos niveles de cobre son esenciales para el hombre, mientras que niveles altos
pueden producir efectos nocivos tales como irritación de la nariz, la boca y los ojos,
vómitos, diarrea, calambres estomacales y náuseas [7].

13
El amonio es uno de los productos químicos más ampliamente utilizados. Se
utiliza principalmente como fertilizante, y también en la fabricación de fibras, explosivos
o plásticos y como alimento de animales. También se usa en insecticidas, en la
fabricación de detergentes y limpiadores y como refrigerante [8].
Es el principal contaminante que provoca procesos de eutrofización en los
sistemas acuosos, y por eso, su concentración en aguas de consumo humano viene
regulada por la legislación.
Las aminas alifáticas de bajo peso molecular, son intermediarios importantes en
las industrias químicas y farmacéuticas. Algunas de ellas se producen en cantidades de
más de 100000 toneladas por año en el Oeste de Europa. Debido a su carácter polar, son
difíciles de eliminar de los sistemas acuosos. Además de su aplicación industrial, las
podemos encontrar como productos de degradación de materia orgánica como las
proteínas y aminoácidos u otros compuestos de nitrógeno. Las aminas alifáticas
secundarias pueden reaccionar con nitrito produciendo nitrosaminas carcinogénicas.
Hasta ahora, existe muy poca información acerca de la presencia de aminas
alifáticas en aguas residuales industriales y en aguas superficiales, pero se sabe que en
algunos tipos de agua aparecen en cantidades muy pequeñas, por lo que en este caso, los
métodos para su análisis deben ser suficientemente sensibles.
Las aminas biogénicas son bases orgánicas que se forman y degradan como
resultado de la actividad metabólica en plantas, animales y microorganismos. Puede
hallarse en fluidos biológicos, en muestras medioambientales y en corrientes de procesos
industriales normalmente a niveles de trazas [9].
1.1.2.2. Legislación aplicable
Los avances en la determinación de estos u otros analitos, vendrán marcados por
la legislación vigente, que con la evolución continua de los métodos de análisis, tiende a
la reducción progresiva de los valores permitidos y a la exigencia de calidad en los
resultados generados, priorizando la acreditación y validación de los laboratorios.
La concentración de los analitos estudiados en esta Tesis, viene legislada en
función del tipo de agua analizada. Para las aminas, no existe una concentración máxima
permitida establecida por la legislación, pero sí lo está la concentración del Nitrógeno
Kjeldahl Total (TKN). En la Tabla 3, se señalan las concentraciones máximas
permitidas en cada caso. Actualmente, no existe normativa que regule la calidad exigida
a las aguas superficiales destinadas a riego, por lo que se considerará la misma legislación
que para aguas superficiales destinadas a potabilización.
La legislación establece además los métodos de referencia para cada uno de los
parámetros cuya concentración limita. En la Tabla 4, se reflejan los métodos de análisis
establecidos para los analitos en estudio así como los métodos utilizados recientemente en
Química Analítica en muestras de agua.

14
Tabla 3. Concentraciones máximas legisladas para los parámetros y tipos de agua
estudiados.
Parámetro Tipo de agua Legislación Concentración
Cromo Aguas de consumo humano Real Decreto 140/2003 50 µg/l
Cobre Aguas de consumo humano Real Decreto 140/2003 2 mg/l
Cobre
Superficiales destinadas a
potabilización
Real Decreto 1541/1994 50 µg/l
Cobalto - Parámetro no legislado -
NH4
+
Aguas de consumo humano Real Decreto 140/2003 0.5 mg/l
NH4
+ Superficiales destinadas a
potabilización
Real Decreto 1541/1994 1.5 mg/l
N Kjeldahl
Superficiales destinadas a
potabilización
Real Decreto 1541/1994 2 mg/l
N Total Lagos o embalses Real Decreto 849/1986 10 mg/l
N Total Vertidos de aguas residuales
Orden 13 Agosto 1999
Plan Hidrográfico Júcar
20 mg/l
NH4
+ Aguas de baño (incluye
marinas)
Real Decreto 734/1988 *
N Total
Agua de baño (incluye aguas
marinas)
Real Decreto 734/1988 *
*No existe un valor límite para este tipo de aguas, pero este parámetro deberá ser verificado cuando exista una tendencia a
la eutrofización de aguas.
Tabla 4. Métodos de referencia establecidos por la legislación y métodos más utilizados
recientemente.
Analito
Método de referencia
(Legislación)
Métodos utilizados recientemente en QA
Cromo
Espectrofotometría de emisión
por Plasma-ICP o absorción
atómica (RD 995/2000)
Quimioluminiscencia, absorción atómica,
espectrofotometría de llama, ICP, Fluorescencia de
Rayos X, MS y técnicas acopladas.
Cobalto
Cobre
Amonio
Espectrofotometría de
absorción, reactivo de Nessler,
método del indofenol
Electrodo selectivo, métodos FIA con detección
fluorimétrica o amperométrica (biosensores),
quimioluminiscencia, cromatografía iónica.
N Kjeldahl Método de Kjeldahl
Método de Kjeldahl, Oxidación con persulfato,
foto-oxidación UV, oxidación catalítica a elevadas
Temp. HTCO, detección QL de Nitrógeno CLND.
Aminas - HPLC

15
1.2. CARACTERÍSTICAS Y TENDENCIAS DEL ANÁLISIS
MEDIOAMBIENTAL
Los avances tecnológicos y metodológicos han conducido a una evolución de la
Química Analítica en general y del campo del análisis del agua en particular. Este hecho
se refleja en el porcentaje de publicaciones científicas (aproximadamente un 54%) que se
ha dedicado a las determinaciones en matrices acuosas dentro del campo medioambiental
(revisión bibliográfica en Analytical Abstract en el período 1980-2001 [10]).
Los propósitos generales del análisis medioambiental [4]son la monitorización
del fondo (definido como el intervalo de concentraciones en el agua de un cierto
elemento, especie o sustancia derivado de fuentes biológicas, geológicas o atmosféricas
naturales) y la monitorización de la contaminación (determinar la concentración de
constituyentes dañinos de origen antropogénico).
Los problemas que surgen en el análisis de aguas son: las bajas concentraciones
de los analitos, la complejidad de la matriz, la presencia de interferentes, la variabilidad
de las muestras o la especiación entre otros. En la actualidad, nos encontramos en un
período de evolución de la QA medioambiental, caracterizado por el desarrollo de nuevas
y mejores técnicas analíticas. El protocolo del proceso analítico dependerá del problema a
analizar y requerirá un estudio de la sensibilidad, exactitud, precisión, fiabilidad,
interferencias, efectos matriz, costes y tiempo de análisis, etc. teniendo siempre en cuenta
factores como la validación, representatividad, impacto medioambiental y toxicidad de
los reactivos.
El estudio de analitos a niveles de trazas, requiere un mayor esfuerzo para
garantizar la calidad del análisis. Cuanto mayores sean la precisión y exactitud exigidas,
más estricto deberá ser el control de calidad. En este sentido, se han elegido los métodos
quimioluminiscentes para la realización de esta Tesis puesto que proporcionan una
elevada sensibilidad en un amplio intervalo dinámico de concentraciones, con una
instrumentación simple (no requieren fuente de excitación), amplia versatilidad y se
acoplan fácilmente como métodos de detección a sistemas de análisis por inyección en
flujo o sistemas de separación cromatográficos.
Como perspectiva de futuro, se han establecido una serie de analitos prioritarios
para los que se deben desarrollar estudios ambientales, proponer métodos alternativos o
mejorar los existentes [11]. Entre ellos, se encuentran los metales pesados, el amonio y el
nitrógeno total, parámetros que han sido objeto de estudio en esta Tesis.
Los avances metodológicos y químicos, vendrán marcados por la búsqueda de
límites de detección cada vez más bajos y el empleo de sensores o el desarrollo de
técnicas sencillas, de rápida respuesta, bajo coste y sin necesidad de personal
especializado para la vigilancia. La tendencia más marcada es a la completa
automatización, destacando la utilización de sistemas de inyección en flujo, así como la
automatización de sistemas en HPLC. La derivatización de 7 aminas alifáticas con
Cloruro de Dansilo en cartuchos C18 y posterior separación cromatográfica con

CARACTERÍSTICAS Y TENDENCIAS DEL ANÁLISIS MEDIOAMBIENTAL
16
detección fluorescente (Apéndice 1), o quimioluminiscente por reacción postcolumna de
los derivados dansilados con TCPO/H2O2 (Apéndice 3), se han desarrollado en esta
Tesis. Para la detección fluorescente, se ha logrado la automatización completa del
análisis, consiguiendo la derivatización en línea acoplada a la separación
cromatográfica (Apéndice 2).
Se ha propuesto un nuevo método fluorescente para la determinación de amonio
en muestras de agua, basado en la reacción del amonio con el reactivo OPA-NAC,
comparándose los resultados con los obtenidos con el método de referencia de Nessler y
el método del electrodo selectivo que han sido revisados previamente a su utilización
(Apéndice 4). Como complemento, y con la intención de mejorar la sensibilidad, se
propone un método quimioluminiscente para la determinación de amonio derivatizando
este en disolución con Cloruro de Dansilo y separándolo de posibles interferentes
mediante HPLC y posterior generación de quimioluminiscencia con TCPO/H2O2
(Apéndice 5). Un estudio similar se ha realizado para la determinación del Nitrógeno de
grupos amino primario más Nitrógeno amoniacal, mediante la aplicación del método de
fluorescencia por derivatización con el reactivo OPA-NAC (Apéndice 10), o por
detección quimioluminiscente basada en la reacción del Nitrógeno Orgánico tipo amino
y amonio con Hipoclorito, y medida de la disminución de señal quimioluminiscente al
reaccionar con el luminol (Apéndice 11).
Además, se ha extendido el uso de métodos de screening [12-13], que permiten
seleccionar las muestras que superan el valor legislado, para posteriormente analizarlas
por el método propuesto si está validado, o por el método de referencia que esté
establecido. En esta dirección, se ha propuesto un método de análisis por inyección en
flujo para el screening de muestras de agua para Cu(II), basado en la disminución de la
señal quimioluminiscente emitida por el sistema Coproporfirina I/TCPO/H2O2 en
presencia de Cu(II) (Apéndice 6).
La especiación de elementos metálicos presenta gran relevancia debido a que las
diferentes especies presentan también diferentes características en cuanto a toxicidad,
biodisponibilidad o reactividad. En esta Tesis, se estudia la exactitud del método de
análisis por inyección en flujo para la especiación de Cr(III) y Cr(VI) basado en la
reacción quimioluminiscente del luminol con H2O2 (Apéndice 7). Como complemento a
este trabajo se ha abordado también la influencia del protocolo de acondicionamiento de
las muestras de agua en la detección quimioluminiscente de elementos traza (Apéndice
8). Además, basándonos en esta misma reacción, se propone un método de calibración
multivariante para la determinación simultánea de Cr(III) y Co(II) en estático
(Apéndice 9).
Los parámetros básicos que definen un resultado analítico son la exactitud o
proximidad al valor verdadero, y la incertidumbre expresada como el intervalo de
confianza. Para asegurar la calidad de los resultados medioambientales existen
diferentes metodologías:
§ Empleo de buenas prácticas de laboratorio: Consiste en realizar las distintas
operaciones del laboratorio en las mejores condiciones de calidad y seguridad.

17
§ Estudio de fuentes de error: Minimizar los posibles errores introducidos en las etapas
del proceso analítico, evaluando la influencia en el resultado final. En el presente
trabajo, y de forma general, se han evaluado las fuentes de error sistemático
constante y proporcional corregibles, y se han realizado estudios de interferencias.
§ Control estadístico para localizar resultados anómalos.
§ Comparación de métodos: Estudios de confirmación: Este criterio ha sido utilizado
también en esta Tesis.
§ Ensayos de recuperación: Se utiliza para validar resultados en muestras cuando no se
dispone de un patrón certificado. Esta opción se ha seguido en la tesis de forma
sistemática.
§ Uso de materiales de referencia certificado: Este material consiste en una muestra o
patrón cuyo contenido en el analito estudiado es conocido y está avalado por un
organismo competente. En los trabajos de determinación de especies metálicas, se ha
utilizado un material de referencia certificado SRM ® 1640.
§ Ensayos interlaboratorio: Se utilizan para detectar fuentes de error, validar nuevos
métodos, certificar contenidos en materiales de referencia, etc..
§ Acreditación del laboratorio: Un organismo competente ha de aprobar la correcta
realización de los análisis, sometiendo al laboratorio a auditorías internas y externas.
Con todo esto, queda evidenciada la necesidad de nuevos métodos analíticos para
poder interpretar los datos medioambientales, controlar la contaminación y establecer el
papel de cada especie en los ciclos naturales.

QUIMIOLUMINISCENCIA
18
1.3. QUIMIOLUMINISCENCIA
1.3.1. PERSPECTIVA HISTÓRICA
La observación e investigación de los fenómenos luminiscentes tiene una larga
historia. Desde tiempos inmemoriales, se conocían sustancias y animales que
resplandecían en las sombras, por lo que despertaban la curiosidad y las supersticiones
[14]. En la Tabla 5, se describen los principales hechos históricos que han propiciado la
investigación de este tipo de fenómenos.
Tabla 5. Hechos históricos referidos a los fenómenos luminiscentes.
Año Investigador Hecho
1500 -1000
a.C.
Crónicas chinas
Shih Ching
Primeras referencias escritas sobre luciérnagas y gusanos
luminiscentes (Libro de las Odas).
384 - 322
a.C.
Aristóteles
Observó que la luz emitida se producía sin calentamiento.
23 – 79
d.C.
Caius Plinius
Secundus
Describió con detalle un gran número de organismos
luminosos.
1555 Conrad Gesner
Publicó un libro cuyo contenido trataba exclusivamente de
los fenómenos luminiscentes.
1565 Nicolás Monarde
Escribió acerca del extraordinario color azul intenso de un
extracto acuoso de la madera llamada “lignum
nephrilicum”.
1603 Vincenzo Cascariolo
Introdujo la luminiscencia de los sólidos. Calentó polvos
de sulfato de bario con carbón y encontró que la mezcla
resultante brillaba en la noche. La piedra se “cargaba” de
luz solar por el día y brillaba durante horas en la oscuridad
(fosforescencia). Le llamó lapis solaris (piedra del Sol).
1652 Nicolas Zucchi
Demostró, por medio de filtros ópticos, que el color de la
luz emitida durante la noche era la misma que cuando la
piedra era expuesta a luz blanca o de otros colores, como
azul o verde.
1655
Athanasius Kircher,
Francisco Grimaldi,
Isaac Newton y
Robert Boyle
Observaron que cuando el extracto acuoso de la madera
“lignum nephrilicum” era ilu minada con luz blanca,
aparecía una luz reflejada azul intensa, mientras que la luz
transmitida era amarilla.
1668 Robert Boyle
Marcó inicialmente las diferencias esenciales entre
incandescencia y luminiscencia (emisión de luz por
materiales calentados o no calentados respectivamente).
1845 George Stokes
Caracterizó la naturaleza bicromática del cristal de fluoruro
cálcico como una emisión (fosforescencia). Demostró que
la luz incidente de una región espectral era absorbida y
transformada por la solución en luz emitida en una región
espectral diferente, de mayor ë (Ley de Stokes). La
emisión desaparecía instantáneamente cuando se apagaba
la luz incidente. Le dio el nombre de fluorescencia.

19
1877 Radziszewski
Observó por primera vez la emisión de luz causada por
reacciones químicas [15] (QUIMIOLUMINISCENCIA)
al burbujear con O2 una disolución etanólica alcalina de
lofina.
1888 Eilhard Wiedemann
Introdujo el término luminiscencia para describir la
emisión de luz que no requería un aumento de la
temperatura, abarcando la fluorescencia y la
fosforescencia.
1927 Albrecht
Describió las propiedades quimioluminiscentes del
luminol[16].
1935 Gleu y Petsch
Describieron la luz azul o verde emitida por el nitrato
bis(N-Metilacridinio) (lucigenina) [17].
1964 McCapra
Propuso un mecanismo basado en la formación de un ciclo
de dioxoetanona para explicar la quimioluminiscencia de
las sales acridínicas [18].
Hoy en día, la luminiscencia se entiende como el proceso por el cual un material
genera radiación no térmica (depende de las características del tipo de material) [19]. Así,
la luminiscencia es la emisión de luz por medios diferentes a la combustión y por eso
ocurre a temperaturas más bajas que las requeridas por la combustión. La intensidad de
emisión luminiscente es baja si se compara con las fuentes incandescentes, pero tiene la
ventaja de que habitualmente emana de cantidades de materia extremadamente pequeñas.
Esto proporciona implicaciones beneficiosas para las ciencias analíticas, sin embargo, el
uso de la luminiscencia para el análisis es bastante reciente.
Registrando la intensidad de luminiscencia relativa en función de la
concentración, se pueden determinar cuantitativamente (frecuentemente a niveles de
trazas) un amplio rango de analitos tanto inorgánicos como orgánicos. La luminiscencia,
generalmente ofrece superior selectividad, detectabilidad y rango lineal comparado con la
espectrometría de absorción.
Muchas publicaciones analíticas muestran que la metodología fluorimétrica es
más común que la fosforescencia o la quimioluminiscencia. Sin embargo, los trabajos de
investigación indican un aumento en la aceptación de estas dos últimas técnicas
espectroscópicas, específicamente cuando se combinan con separaciones cromatográficas
[20-24].
Las investigaciones sobre el potencial analítico de la quimioluminiscencia (QL)
para análisis de rutina datan de los años 70 para las reacciones en fase gaseosa, y de la
década de los 80 para las reacciones en fase líquida. Hoy en día el interés analítico en la
aplicación de la QL está creciendo exponencialmente.

QUIMIOLUMINISCENCIA
20
1.3.2. FUNDAMENTOS Y MECANISMOS
La QL se define como la emisión de radiación electromagnética, normalmente en
la región del visible o infrarrojo cercano, producida por una reacción química. Para que se
dé la QL es necesario que la reacción produzca un exceso de energía, lo cual es bastante
frecuente sobretodo en reacciones rédox, pero el hecho de que este exceso de energía se
disipe con emisión quimioluminiscente, depende en gran medida de la estructura
molecular de los intermedios o productos de reacción.
Las reacciones quimioluminiscentes pueden generarse mediante dos mecanismos
básicos, por lo que la clasificación de estas reacciones se ha establecido en función de
estos dos mecanismos:
- Quimioluminiscencia directa: Se parte de dos reactivos, A y B, normalmente un
substrato y un oxidante. A y B reaccionan dando un intermedio de reacción en un
estado electrónicamente excitado. Este intermedio, al relajarse hasta el estado
fundamental, emite un fotón. A veces, en estas reacciones, se requiere un catalizador
que disminuya la energía de activación y aumenta el rendimiento cuántico de la
reacción quimioluminiscente.
- Quimioluminiscencia indirecta (sensibilizada o de transferencia de energía): El
mecanismo es el mismo para la formación del intermedio electrónicamente excitado,
pero este intermedio no puede emitir directamente el fotón para dar la QL y requiere
la presencia de un fluoróforo al cual le transfiere la energía, de forma que el
fluoróforo se excita y al volver a su estado fundamental emite un fotón.
En la Figura 1, se resumen esquemáticamente los dos mecanismos descritos:
Figura 1. Mecanismos de las reacciones quimioluminiscentes.
A + B
(Precursor QL) (Oxidante)
Catalizador
P*
(Intermedio o producto
electrónicamente excitado)
QL QL
DIRECTA F NDIRECTA
P + hνν P + F*
F + hνν

21
Por tanto, los procesos quimioluminiscentes comprenden los siguientes pasos:
1. Reacción química inicial que proporciona el intermedio o producto.
2. Conversión del exceso de energía química en excitación electrónica de este
intermedio.
3. Transferencia de energía en el caso de la QL indirecta.
4. Emisión de la luz por parte de las especies excitadas.
El rendimiento cuántico de una reacción quimioluminiscente, dependerá por tanto
de los rendimientos cuánticos de los cuatro pasos implicados en los mecanismos.
1.3.3. CARACTERÍSTICAS DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA COMO
TÉCNICA ANALÍTICA
1.3.3.1. Ventajas y limitaciones de la técnica
En las reacciones quimioluminiscentes, la intensidad de emisión es función de la
concentración de las especies químicas implicadas, por lo que las medidas de intensidad
de emisión pueden emplearse con fines analíticos.
Las principales ventajas de los sistemas quimioluminiscentes que los hacen
adecuados para el análisis cuantitativo en Química Analítica son:
- Elevada sensibilidad y amplio intervalo dinámico de concentraciones, llegando
en algunos casos a límites de detección del orden de los femtomoles.
- No requiere fuente de excitación externa, lo que se traduce en ausencia de
dispersión y de señales de fondo, en la reducción de interferencias debidas a procesos
de excitación no selectivos y en la utilización de una instrumentación más sencilla
que otros procesos luminiscentes.
- Versatilidad: Se puede utilizar la técnica para determinar cualquiera de las especies
que participan en el proceso quimioluminiscente: sustratos, catalizadores, inhibidores,
fluoróforos, especies que dan reacciones acopladas aumentando o disminuyendo la
concentración de los reactivos implicados en la reacción quimioluminiscente.
- Se acoplan fácilmente como método de detección en cromatografía, electroforesis
capilar o inmunoensayo.
Entre las limitaciones de estas reacciones para el análisis, los siguientes
parámetros se han de tener perfectamente controlados:
- Los factores experimentales que afectan al rendimiento cuántico y la velocidad de
reacción son: la estructura química del precursor quimioluminiscente, la naturaleza y
concentración de sustancias que favorecen procesos competitivos no radiantes, el

QUIMIOLUMINISCENCIA
22
catalizador elegido, la temperatura, la fuerza iónica, la presencia de aceptores de la
energía transferida, la presencia de iones metálicos, la hidrofobicidad del disolvente y
la composición de la disolución.
- El tiempo de medida de la señal, debido a que la emisión quimioluminiscente varía
en función del tiempo. Tras la mezcla de los reactivos, la emisión de luz alcanza
inmediatamente un máximo y después cae hasta la línea base en un rápido destello
menor que un segundo o en emisión continua que puede durar desde minutos a horas.
En la Figura 2, se muestra un ejemplo de la variación de la señal
quimioluminiscente con el tiempo, para la reacción del luminol/H2O2 estudiada en esta
Tesis, utilizando Cr(III) como catalizador (Concentración final Cr(III) 5.5 µg/l). Como se
puede observar, la emisión es muy rápida, aproximadamente 1s, y por tanto, el tiempo al
que se registre la señal será muy decisivo.
Figura 2. Intensidad de emisión quimioluminiscente frente al Tiempo.
0 1 2 3 4 5
Tiempo (segundos)
0
100
200
300
Intensidaddeemisión

23
1.3.3.2. Tendencia Actual
La importancia de las determinaciones quimioluminiscentes en el campo de la
Química Analítica, ha tenido una evolución creciente en los últimos años. Durante los
años 70 y 80, la investigación en este tipo de reacciones estaba orientada a la búsqueda de
nuevos reactivos quimioluminiscentes [25-27] y el estudio de reactivos estructuralmente
semejantes a los que ya se conocían como quimioluminiscentes.
A partir de los años 90 y hasta la actualidad, los estudios de reacciones
quimioluminiscentes se han dirigido más hacia la mejora en la instrumentación,
construyendo detectores muy sencillos para este tipo de medidas [28-30], y también a la
obtención de estos sistemas de detección acoplados a técnicas separativas permitiendo la
resolución y cuantificación de varios analitos en mezclas complejas por ejemplo de
ácidos[31], compuestos de nitrógeno [32], o biopolímeros [33]. Las grandes aplicaciones
de la QL como método de detección en flujo, cromatografía líquida o electroforesis
capilar, junto con el gran potencial del inmunoensayo, hacen de la técnica un campo de
investigación muy interesante en una amplia variedad de disciplinas.
La detección quimioluminiscente es una técnica en pleno desarrollo. El interés de
la QL en Química Analítica, queda reflejado en el número de publicaciones científicas en
revistas de gran prestigio (Analytical Chemistry, Analytica Chimica Acta, The Analyst,
Talanta, Journal of Chromatography y Journal of pharmaceutical and Biomedical
Analysis entre otras) que, según la base de datos Analytical Abstracts desde 1979 hasta la
actualidad (finales de 2003), es del orden de 3700 publicaciones. La Figura 3 refleja el
crecimiento exponencial en el número de publicaciones durante estos últimos 25 años.
Figura 3: Número de publicaciones en revistas científicas de ámbito internacional frente a
cada año desde 1979 a 2003.
0
100
200
300
1979 1982 1985 1988 1991 1994 1997 2000 2003
Año
NºPublicaciones

QUIMIOLUMINISCENCIA
24
1.3.4. REACCIONES QUIMIOLUMINISCENTES
La bibliografía muestra la aplicación de reacciones quimioluminiscentes en fase
sólida, líquida y gaseosa.
Las reacciones en fase sólida han sido las menos aplicadas pues son reacciones
muy limitadas por la débil emisión que acompaña a la oxidación de muchos materiales
orgánicos. Los sólidos se calientan en presencia de oxígeno y la emisión QL es
proporcional a la velocidad de reacción. En ausencia de oxígeno, la emisión QL se debe a
la descomposición de los peróxidos formados. Se puede recoger la emisión directa de
estas especies o la indirecta (exaltando la QL por adición de fluoróforos). En este campo,
se han descrito reactores para la detección quimioluminiscente en fase sólida, utilizando
como soportes metacrilatos polimerizados. Un ejemplo es la reacción de perioxalato con
peróxido de hidrógeno que utiliza como fluoróforo el 3-aminofluoranteno inmovilizado
en el soporte [34].
Los métodos quimioluminiscentes en fase gaseosa, se han utilizado combinados
con cromatografía gaseosa (utilizando por ejemplo la reacción quimioluminiscente del
ozono [35]), cromatografía de fluidos supercríticos (reacciones del nitrógeno y el sulfuro
[36-38]), y también con detectores de gases no cromatográficos en los que se requiere una
respuesta rápida como el detector quimioluminiscente de monitorización continua de
sulfuro [39]. Algunos de los analitos que se han determinado mediante esta técnica son:
óxidos de nitrógeno (NOx), ozono, y peróxido de hidrógeno en muestras atmosféricas, y
detección y secuenciación de DNA, ácidos nucleicos, fosfatasa alcalina yoxidantes en
riñones, cerebro y plasma. En la Tabla 6, se pueden observar las principales reacciones
en fase gas [40] y las condiciones de reacción necesarias en cada caso, siendo las más
aplicadas las utilizadas para la determinación de azufre, fósforo y nitrógeno total. En
algunos casos la reacción se da a temperatura ambiente, y en otros, se requiere
calefacción a elevadas temperaturas.
Las reacciones quimioluminiscentes en fase líquida, tienen aplicabilidad en la
determinación de un amplio rango de analitos, desde elementos metálicos como cromo y
cobalto a niveles traza [41-42], hasta fármacos como tiopronina [43] o azitromicina [44].
En la Tabla 7, se reflejan las principales reacciones quimioluminiscentes utilizadas en
fase líquida para diferentes analitos estudiados [40,45]. Se dividirán estas reacciones
según la QL sea directa o indirecta. Dado que las reacciones quimioluminiscentes
estudiadas en esta Tesis, son en fase líquida, se detallará más ampliamente este apartado.

25
Tabla 6. Principales reacciones quimioluminiscentes en fase gaseosa.
Analito Reactivo λλem (nm) Reacción Temperatura
Azufre H2 384-394
S + S → S2
*
S2
*
→ S2 + hν
Llama H2
Compuestos
Fósforo H2 526
Comp-P → HPO*
HPO*
→ HPO + hν
Llama H2
O3 Alquenos 300-600
Alqueno + O3 → CO
CO + O3 → CO2
*
+ O2 →
CO2 + hν
25ºC
Hidro -
Carburos O3 300-600
HC + O3 → CO
CO + O3 → CO2
*
+ O2 →
CO2 + hν
150-200ºC
NO O3 590
NO + O3 → NO2
*
+ O2
NO2
*
→ NO2 + hν
25ºC
Compuestos
Nitrógeno O2/O3 590
NO + O3 → NO2
*
+ O2
NO2
*
→ NO2 + hν
800-1000ºC
Compuestos
Sulfurados H2 260-480
Comp-S → SO
SO + O3 → SO2
*
+ O2
SO2
*
→ SO2 + hν
Llama H2
Tabla 7. Principales reacciones quimioluminiscentes en fase líquida.
Reacción Analitos λλmáx, em
Rendim.
cuántico*
Oxidación del luminol en medio
básico acuoso
Catalizadores (Cr(III),
Co(II),...), H2O2, luminol..
425 nm 0.01
Oxidación del luminol en
dimetilsulfóxido
Superóxido 500 nm 0.05
Oxidación de la lucigenina con
peróxido de hidrógeno alcalino
Cu(II),Pb(II), Hg(II), I-
, ... 440 nm 0.016
Oxidación de lofina en medio
etanólico con hidróxido sódico
Na+
, Mg2+
, lofina 525 nm -
Oxidación de perioxalatos
Proteínas, Cl2 , porfirinas,
derivados del DnsCl,...
Depende del
sensibilizador
0.05-0.5
Reducción de
tris(2,2’-bipiridil)rutenio(III)
Aminas, Aminoácidos,
Alcaloides, ión oxalato,...
610 nm -
Oxidación de alcaloides con
permanganato potásico en medio
ácido en presencia de
polifosfatos
Alcaloides, anestésicos,
aminoácidos, indoles,
ácido ascórbico, fenoles, ..
680 nm -
Oxidación de D-luciferina con
luciferasa dependiente del ATP
pH 8.6
ATP, enzima luciferasa,
Mg(II),...
560 nm 0.88
*La intensidad de emisión de una reacción depende del rendimiento cuántico, que es una medida
de la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. Los rendimientos cuánticos van desde 1· 10-15
(QL ultradébil) hasta cerca de 1 (procesos bioluminiscentes).

QUIMIOLUMINISCENCIA
26
1.3.5. REACCIONES QUIMIOLUMINISCENTES DIRECTAS EN FASE
LÍQUIDA
1.3.5.1. Reacciones del Luminol y sus análogos
El luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona), es uno de los reactivos
quimioluminiscentes más comúnmente empleado en fase líquida. Fue presentado por
primera vez en 1928, y la caracterización de la cinética de reacción y las especies
emisoras requirió más de tres décadas de investigación. El luminol se oxida casi
cuantitativamente a 3-aminoftalato en medio básico tanto en disolventes polares como
apolares. El mecanismo propuesto para la reacción [45] es el que se muestra en la Figura
4.
Figura 4. Mecanismo propuesto para la reacción del luminol.
Como oxidantes de la reacción, se han utilizado: el permanganato en la
determinación de paracetamol en fármacos [46] o de urea en tejidos de plantas [47]; el
hipoclorito, en la determinación de amonio [48] o catecolaminas [49]; y el yodo, en la
determinación de penicilinas [50-51]; pero el oxidante más utilizado ha sido el peróxido
de hidrógeno.
O2
O
ONH2
NH
NH OH-
O2
O
ONH2
N
N
O
ONH2
N
N
O
O
-
-
+ N2
O
ONH2
O
ONH2
O
O
-
-
*
O
ONH2
O
ONH2
O
O
-
- + hν (λ = 425 nm)
Luminol
3-aminoftalato

27
Cuando la reacción del luminol con peróxido de hidrógeno se da en medio
orgánico (en dimetilsulfóxido), no se requiere ningún catalizador, pero cuando se da en
medio acuoso, se requiere la presencia de un catalizador. Como catalizadores, se han
utilizado diferentes metales de transición (Co2+
, Cu2+
, Fe3+
, Cr3+
,...) [52-54], ferricianuro
[55-56], o algunos metalocomplejos (hemina, hemoglobina y peroxidasas [57-58]). La
intensidad de emisión quimioluminiscente tiene un máximo a 425 nm cuando se trabaja
en medio acuoso, y a 500 nm cuando se trabaja en dimetilsulfóxido. El pH óptimo de la
reacción está entre 8 y 11, dependiendo del catalizador.
La reacción se ha utilizado para la determinación de los catalizadores (límites de
detección desde 1 µM hasta 1 nM según las especies), del H2O2 (límite de detección 0.1
µM) o del luminol (límite de detección 1 pM) [59-60].
También se puede iniciar la reacción QL electroquímicamente, sobre un electrodo
de Ag/AgCl a +0.5V [61-62]. Los límites de detección con QL electrogenerada son
similares a los obtenidos con un catalizador convencional.
En los últimos años, se han revisado compuestos de estructura similar al luminol
con la intención de mejorar el rendimiento cuántico, y se ha concluido que la menor
alteración en el anillo heterocíclico destruye las propiedades quimioluminiscentes de la
molécula.
El luminol se puede enlazar a algunos analitos para inmunoensayo mediante la
sustitución de los hidrógenos del grupo amino primario; esta sustitución provoca una
disminución en la intensidad de emisión quimioluminiscente.
Compuestos derivados del luminol como el isoluminol (4-aminoftalhidrazida)
[63-64] también presentan propiedades QL pero son menos eficaces. Otro derivado del
luminol, el ABEI (aminobutiletilisoluminol) [65-66] se utiliza como reactivo marcador.
En esta Tesis, se presentará una guía para evitar los errores sistemáticos en la
determinación quimioluminiscente de Cr(III) y Cr(VI) en medio acuoso, utilizando la
reacción del luminol con H2O2 y un sistema de análisis por inyección en flujo (Apéndice
7). Se revisará también la influencia de los protocolos de acondicionamiento de la
muestra en el análisis quimioluminiscente de elementos metálicos a niveles de trazas
(Apéndice 8). Por otra parte, se aplicará esta misma reacción en estático, proponiendo
un modelo de calibración multivariada para la determinación quimioluminiscente
simultánea de Cr(III) y Co(II) (Apéndice 9). En todos los casos, se abordará el análisis
de muestras de agua.
También se propone la utilización de la reacción del luminol con Hipoclorito
sódico como oxidante en medio básico. Se determinará la cantidad de Nitrógeno
Orgánico (aminas y aminoácidos) y Amoniacal en muestras de agua basándose en la
disminución de la señal QL por reacción de los compuestos de nitrógeno con hipoclorito
para dar cloraminas (Apéndice 11). La determinación QL se comparará con la
estimación del Nitrógeno Kjeldahl Total por digestión-destilación y detección

QUIMIOLUMINISCENCIA
28
fluorescente basada en la reacción del amonio con el reactivo OPA/NAC o UV/vis
basada en la reacción del amonio con el reactivo de referencia de Nessler (Apéndice 10).
1.3.5.2. Reacción de los ésteres de acridinio
Los ésteres de acridinio reaccionan con peróxido de hidrógeno en medio alcalino
dando lugar a N-Metilacridona en estado excitado que emite luz a 440 nm. El mecanismo
propuesto para esta reacción [40] se muestra en la Figura 5, no se requiere de
catalizadores. Se ha utilizado para la determinación cuantitativa de peróxido de hidrógeno
[67], pero la principal aplicación de estos ésteres radica en su uso como marcadores en
inmunoensayos [68] y estudios de DNA [69-70].
Los máximos rendimientos cuánticos en la emisión QL de los ésteres de acridinio
se obtienen a pH 12-13, pero a estos pHs los ésteres de acridinio se descomponen dando
una pseudo-base no-quimioluminiscente. Por esto, el H2O2 se añade en medio ácido para
reconvertir la pseudo-base a éster de acridinio y posteriormente se añade el hidróxido
sódico para iniciar la reacción QL.
Al igual que en la reacción del luminol, también se puede generar el H2O2
electroquímicamente.
Figura 5. Mecanismo de la reacción QL de los ésteres de acridinio.
La lucigenina, nitrato de bis-N-acridinio, no lleva el grupo éster, pero sigue el
mismo mecanismo que los ésteres, con la única diferencia que requiere de la presencia de
iones metálicos de transición que actúan como catalizadores. Por esta razón, se puede
utilizar también la reacción para la determinación de iones metálicos si se utiliza
lucigenina como reactivo quimioluminiscente.
N
+
CH3
C O
O
R
OH, H2O2
N
CH3
O
*
Ester de acridinio
N-Metil acridona*
NMA*
NMA + h ν

29
1.3.5.3. Reacción de Tris (2,2’-bipiridina) rutenio (III)
Las propiedades fotoluminiscentes de los N’N’ quelatos de Ru(II) fueron
presentadas por primera vez en 1959, y posteriormente en 1962, se observó la QL emitida
por el Tris(2,2’-bipiridina) rutenio (III). Sin embargo, hay muy poca información acerca
del mecanismo de la reacción.
El estado excitado del complejo Ru (bipi)3
2+
, produce una emisión naranja a 610
nm. La emisión es fosforescencia químicamente inducida. Se puede llegar a este estado
excitado de diferentes formas [45]:
§ Ru(bipi)3
3+
+ Ru(bipi)3
+
→ [Ru(bipi)3
2+
]*
§ Ru(bipi)3
+
+ Oxidante → [Ru(bipi)3
2+
]* + Oxidante-
§ Ru (bipi)3
3+
+ Reductor → [Ru(bipi)3
2+
]* + Reductor+
La intensidad de quimioluminiscencia en estas reacciones es proporcional a la
concentración de cualquiera de los reactivos.
Como reductores se pueden utilizar una gran variedad de compuestos, pero no
todos producen la típica QL naranja. Algunos que sí la producen son: aminas [71-72],
aminoácidos [73], alcaloides [74-75] e ión oxalato [76-77], a concentraciones incluso por
debajo de 1· 10-10
M.
La reacción es tan selectiva que incluso para alcaloides como la codeína y la
morfina con una estructura química tan similar, la codeína se puede determinar, pero la
morfina no da QL. Esto ha dado lugar a que no existan todavía mecanismos definitivos
para este tipo de reacción. Para las aminas, la respuesta aumenta con el número de
sustituyentes (terciarias > secundarias > primarias).
Recientemente, se ha estudiado un complejo similar Ru(Phen)3
2+
(Phen: 1,10-
fenantrolina), que presenta mayor emisión al oxidarse con Ce(IV) en medio sulfúrico.
1.3.5.4. Reacciones Bioluminiscentes
Los sistemas más utilizados se basan en la reacción de luciferina-luciferasa [78-
79]. La enzima luciferasa (muy específica) cataliza la oxidación por el aire de la
luciferina en presencia de ATP, que se consume como substrato y emite luz a 562 nm.
Para esta reacción es necesaria la presencia de Mg(II) para que la luciferasa muestre su
actividad. Por cada molécula de ATP consumida, se emite un fotón, por esto, esta
reacción es un sistema analítico ideal para detectar la presencia de ATP.

QUIMIOLUMINISCENCIA
30
Este sistema se emplea en el ámbito de la gestión y garantía de calidad para
aumentar la higiene en alimentos, en control de calidad ambiental, en el seguimiento de
plantas de aguas residuales y en la industria farmacéutica, entre otros.
1.3.5.5. Reacciones de oxidación directa
Existen reacciones quimioluminiscentes por combinación de una especie dada
con oxidantes y reductores fuertes en diferentes condiciones químicas. Se han utilizado
estas reacciones para la determinación de aminoácidos, SO2 o morfina con MnO4
-
en
medio ácido y alcalino [80-81], ácido ascórbico con Ce(IV) [82], nitrito con H2O2 [83],
tetraciclina con Br2 [84], entre otras aplicaciones. Otros oxidantes utilizados
habitualmente son el ClO-
y el IO4
-
. Normalmente, cuando la oxidación o la reducción del
analito da un producto fluorescente o el analito en sí presenta fluorescencia, cabe la
posibilidad de que la oxidación del analito produzca emisión QL. Para aumentar la
emisión QL en estos casos, se han añadido al medio de reacción sensibilizadores, medios
micelares o catalizadores. Estas reacciones, se han aplicado principalmente a métodos de
inyección en flujo con detección quimioluminiscente.
1.3.6. REACCIONES QUIMIOLUMINISCENTES INDIRECTAS EN FASE
LÍQUIDA
1.3.6.1. Reacciones con dioxoetanos
Los dioxoetanos son peróxidos cíclicos de 4 miembros. Muchos de ellos son
inestables y se han descrito como intermediarios en muchas reacciones
quimioluminiscentes. Su estabilidad relativa depende de los grupos sustituyentes. A
temperatura ambiente, los 1,2-dioxoetanos sustituidos son estables, pero pueden
descomponerse químicamente produciendo la QL. Los 1,2-dioxoetanos utilizados en las
reacciones quimioluminiscentes tienen un grupo adamantil en una parte del anillo, y un
grupo arílico sustituido (ArilO-X) en la otra. La estabilidad de esta molécula se pierde al
añadir un reactivo que provoca una reacción de transferencia de carga eliminando el
grupo X que estabilizaba la estructura, dando lugar a su descomposición espontánea que
proporciona un éster arílico en estado excitado. El mecanismo detallado [40] se puede ver
en la Figura 6.
La emisión QL la darán, tanto la especie arílica excitada de forma directa, como
un fluoróforo añadido a la mezcla de reacción al cual le transfiere la energía (QL
indirecta). Esta reacción, se ha utilizado para la determinación de dioxoetanos como los
5-tert-butil-1-(4-hidroxibenz[d]oxazol-6-il)-4,4-dimetil-2,6,7-trioxabiciclo[3.2.0]heptanos
[85]; para la determinación de los fluoróforos, como β-dicetonatos de praseodimio (III),
neodimio (III) e Yterbio (III) excitados en la descomposición de 1,2-dioxoetano [86]; o

31
para la determinación del reactivo utilizado en la reacción de descomposición del 1,2-
dioxetano como el enzima proteasa [87].
Figura 6. Mecanismo de la reacción QL de dioxoetanos.
1.3.6.2. Reacciones con peroxioxalatos
En QL indirecta, el sistema más frecuentemente utilizado se basa en la reacción
quimioluminiscente de los peroxioxalatos (PO-CL). En estas reacciones, un éster aril
oxalato es oxidado por peróxido de hidrógeno en presencia de un fluoróforo. El
mecanismo propuesto [45] utilizando bis-(2,4,6-triclorofeniloxalato) (TCPO) se muestra
en la Figura 7. En la reacción, se forma un intermedio de elevada energía, la 1,2-
dioxoetanodiona, que forma un complejo de transferencia de carga con el fluoróforo; el
fluoróforo cede un electrón al intermedio y el complejo se disocia, alcanzando el
fluoróforo un estado excitado. La emisión se produce al volver el fluoróforo al estado
fundamental. Por tanto, las mejores condiciones de emisión quimioluminiscente se
obtendrán cuanto más fácilmente oxidable sea el fluoróforo.
Figura 7. Mecanismo propuesto para la reacción QL con peroxioxalato.
Cl
Cl
Cl
O C
O
C
O
O
Cl
Cl
Cl
+ H2O2
Cl
Cl
Cl
O C
O
C
O
O OH
O
C
O
C
O O
F
O
C
O
C
O O
.-
F
.+
F* + 2CO2
F + hν
O-
O
CH3O
*
O O
OCH3
OX
O O
OCH3
O-
hν

QUIMIOLUMINISCENCIA
32
Puede añadirse a la reacción una base débil como trietilamina o imidazol, para
catalizar la reacción y aumentar la intensidad de QL obtenida. La reacción se da en un
amplio rango de pH, desde 5 a 9, pero generalmente se utiliza un pH cercano a la
neutralidad. El principal inconveniente de la reacción es la limitada solubilidad y
estabilidad de los peroxioxalatos en medio acuoso. Generalmente se utilizan disolventes
orgánicos para evitar problemas de degradación del reactivo.
En la Tabla 8, se pueden ver las características de algunos de los ésteres de
oxalato [15] utilizados en esta reacción. La QL total es el área bajo la curva de emisión.
De estos ésteres, los más utilizados son el TCPO y el DNPO.
Tabla 8. Principales características de algunos peroxioxalatos.
Reactivo quimioluminiscente QL Total
Tiempo de
emisión (s)
Bis(2,4-dinitrofenil)oxa lato DNPO 7500 11
Bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato TCPO 8990 23
Bis(2-(3,6,9-trioxadeciloxicarbonil)-4-
Nitrofenil)oxalato TDPO
9370 13
Bis(2,6-fluorofenil)oxalato DFPO 5650 97
Bis(2-(3-oxabutiloxicarbonil)-4-
Bromofenil)oxalato MBO-1
4630 630
Bis(2-(3,6-dioxaheptiloxilcarbonil)-4-
Bromofenil)oxalato MBO-2
5000 750
Este tipo de reacciones, se ha utilizado para la determinación cuantitativa de H2O2
obteniendo límites de detección del orden de 0.18 pM [88]. La aplicación analítica más
común, ha sido la detección en cromatografía líquida de fluoróforos o compuestos que no
son fluorescentes pero pasan a serlo al derivatizarlos con cloruro de dansilo (como
aminoácidos [89, 23], esteroides [90], aminas alifáticas [91] y ácidos carboxílicos [92]
entre otros).
Para fluoróforos fácilmente oxidables tales como los derivados del dansilo, la
detección quimioluminiscente proporciona mayor sensibilidad que la fluorescente, debido
a que no existe dispersión debida a la fuente de excitación.
En esta Tesis, la reacción con peroxioxalatos y concretamente, la reacción del
TCPO/H2O2, se ha aplicado a la determinación de Cu(II). La Coproporfirina I actúa
como fluoróforo en la reacción del peroxioxalato. En presencia de Cu(II), la intensidad
de emisión disminuye por formación del complejo Cu(II)-Coproporfirina I. Basado en
esta reacción de inhibición, se ha diseñado un sistema FIA para el screening de Cu(II) en
muestras de agua (Apéndice 6).
Además, se ha utilizado esta misma reacción para la determinación cuantitativa
y screening de NH4
+
en muestras de agua mediante HPLC. Para ello, se ha derivatizado
en disolución el amonio con cloruro de dansilo, de forma que el derivado actúa de

33
fluoróforo en la reacción quimioluminiscente. El derivado se inyecta en un sistema
cromatográfico y posteriormente se mezcla con TCPO y H2O2 en un sistema post-
columna (Apéndice 5). El método se compara con otros tres métodos estudiados, el
método de referencia de Nessler, el método del electrodo selectivo, y un método
fluorescente basado en la reacción del amonio con el reactivo OPA/NAC (Apéndice 4).
Finalmente, se ha aplicado también esta reacción a la determinación cuantitativa
de aminas alifáticas en aguas mediante HPLC, derivatizando las aminas con cloruro de
dansilo en cartucho C18 de extracción en fase sólida, metodología introducida por
primera vez por el grupo en 1996. La mezcla de derivados de aminas se inyecta en el
sistema cromatográfico donde se separan los derivados y posteriormente se mezclan con
los reactivos TCPO y H2O2 en un sistema post-columna (Apéndice 3). Hemos comparado
los resultados obtenidos utilizando detección quimioluminiscente con los obtenidos
mediante la detección directa del derivado tanto por fluorescencia como por UV/vis
(Apéndice 1). Se compara también con un sistema totalmente automatizado en el que la
derivatización con cloruro de dansilo se lleva a cabo en línea utilizando detección
fluorescente (Apéndice 2).

REACTIVOS
34
1.4. REACTIVOS
En la Tabla 9, se muestra el listado de reactivos utilizados para la realización de
esta Tesis, las casas comerciales que los suministraron y los pictogramas de seguridad de
cada uno de ellos.
Tabla 9. Listado de reactivos, casas comerciales y pictogramas de seguridad.
Reactivo
Casas
Comerciales
Xi Xn T/T+ I/I+ C N
β-Feniletilamina Sigma X
1,7-diaminoheptano Sigma X
2,4,6-triclorofenil oxalato Fluka X
Ác. Etilendiamintetracético Probus
Acetato amónico Panreac
Acetona Scharlau +X
Acetonitrilo Scharlau, J.T.Baker X +X
Ácido aspártico Aldrich
Ácido bórico Scharlau X
Ácido clorhídrico Fluka, Merck X
Ácido glutámico Aldrich
Ácido nítrico Merck X
Ácido sulfúrico Fluka, Merck X
Alanina Aldrich
Albúmina bovina Fluka
Arginina Aldrich X
Butilamina Sigma +X X
Cadaverina Sigma X
Carbonato sódico Panreac, Merck X
Carbonato sódico decahidratado Probus X
Cisteína Aldrich
Cloruro amónico Probus X
Cloruro de Cromo (III) Panreac X
Cloruro de Cadmio Panreac X +X
Cloruro de Cobalto (II) Panreac X X
Cloruro de Cobre (II) Panreac X X
Cloruro de dansilo Sigma X
Cloruro de hexadeciltrimetilamonio Fluka
Cloruro de Hierro (III) Panreac X
Cloruro de Mercurio (II) Panreac, Merck +X
Coproporfirina I dihidrocloruro Aldrich
Dicromato potásico Panreac X
Dietilamina Sigma X +X X
Dimetilamina Sigma +X X
Espermidina Sigma X
Espermina Sigma X
Etilamina Sigma X X
Fenilalanina Aldrich
Glicocola Aldrich
Hexilamina Sigma +X X
Hidrógeno carbonato sódico Panreac
Hidróxido potásico Probus X

35
Hidróxido sódico
Probus, Panreac,
Merck
X
Hipoclorito sódico Prolabo X
Histidina Aldrich
Imidazol Sigma, Fluka X X
Isoleucina Aldrich
Isopropilamina Sigma +X X
Leucina Aldrich
Lisina Aldrich
Luminol Fluka X
Mercaptoetanol Scharlau X X X
Metanol Scharlau X +X
Metilamina Sigma X
Metionina Aldrich
N-acetil-L-cisteina Fluka
Nitrato de Co(II) hexahidratado Panreac
*Nitrato de cromo (III) Panreac
*Nitrato de Niquel hexahidratado Merck X
N-Propilamina Sigma +X X
Orto-ftaldialdehido Fluka X
Óxido de mercurio (II) rojo Panreac +X X
Pentilamina Sigma +X X
Peróxido de Hidrógeno Panreac, Merck X
Polivinil alcohol Probus
Prolina Aldrich
Putrescina Sigma X
Serina Aldrich
s-Triazina Fluka
Sulfato amónico férrico
dodecahidratado
Panreac
Sulfato amónico ferroso hexahidratado Panreac
Sulfato de Cu(II) pentahidratado Merck X X
Sulfato de manganeso monohidratado Panreac X
Sulfato de Zinc heptahidratado Merck X X
Sulfato potásico Prolabo
Sulfito sódico Prolabo
Tartrato sódico-potásico Panreac
Tetraborat o sódico decahidratado Panreac X
Tetrahidrofurano Scharlau X +X
Tiosulfato sódico Prolabo
Tiosulfito sódico Prolabo
Tirosina Aldrich X
Treonina Aldrich
Trietilamina Sigma X
Trimetilamina Sigma X
Triptófano Aldrich
Triton X-100 Fluka X
Urea Prolabo
Valina Aldrich
Yoduro potásico Guinama
* Oxidante. Xi: Irritante. Xn: Nocivo. T/T+: Tóxico/muy tóxico. I/I+:
Inflamable/Muy inflamable. C: Corrosivo. N: Peligroso para el medio ambiente.

APARATOS, MONTAJES, INSTRUMENTACIÓN Y SOFTWARE
36
1.5. APARATOS, MONTAJES, INSTRUMENTACIÓN Y
SOFTWARE
Los aparatos, instrumentos y software utilizados en esta Tesis son los siguientes:
§ pH-ímetro Crison micropH 2000.
§ pH-ímetro Crison equipado con un electrodo sensible a gases de amoniaco.
§ Agitador magnético-Calefactor (Raypa, Spain).
§ Boma peristáltica Gilson Miliplus 3 (France).
§ Válvulas para FIA: Rheodyne (Coati, CA) 5041.
§ Unidad de digestión Kjeldahl: Tecator system 6, 1007 Digestor (Höganas, Sweeden).
§ Unidad de destilación Kjeldahl: Büchi 323 (Switzerland).
§ Centrifugadora: Labofugue 200 (Herraeus Sepatch, Germany).
§ Sistema cromatográfico equipado con una bomba cuaternaria (Hewlett Packard Series
1100, Palo Alto, CA, USA) y una válvula de 6 vías para alta presión Rheodyne
modelo 7000 (Figura 7A). Detector UV/vis (Hewlett Packard 1040 M Series II) o
detector programable de fluorescencia (Hewlett Packard 1046 A) (Figura 8B).
Estaba conectado con el sistema de almacenamiento y procesado de datos Hewlett
Packard Chem-Station.
Figura 8. A) Equipo cromatográfico HP1100. B)Detectores UV/vis y Fluorímetro.
A
B

37
§ Espectrofotómetro de fila de diodos HP 8452 UV-visible (Germany), equipado con
una celda de cuarzo de 1 cm de camino óptico, conectado a un PC Hewlett Packard
Vector XM 5/90, controlado por el software G1115AA (Figura 9).
Figura 9. Espectrofotómetro HP 8452 conectado a un PC Hewlett Packard Vector XM 5/90.
§ Sistema cromatográfico equipado con una bomba cuaternaria e inyector automático
(Hewlett Packard Series 1050, Palo Alto, CA, USA). Sistema de reacción Post-
Columna PCX 5100 (Pickering Laboratories, Mountain View, CA, USA) equipado
con dos bombas isocráticas que trabajan a flujo estable. Detector Jasco CL-1525
(Ishika-cho, Hachioji-shi, Tokio, Japan) controlado por el software cromatográfico
Borwin y con una interfaz Hercule Lite (JMBS, France) (Figura 10).
Figura 10. Equipo cromatográfico 1050, Sistema post-columna PCX-5100, detector Jasco
CL-1525 e interfaz Hercule Lite.

38
§ Fluorímetro Hitachi F-4500, 700v (Tokio, Japan) equipado con una celda de 1 cm de
camino óptico (Figura 11).
Figura 11. Fluorímetro modelo Hitachi F4500.
§ Fluorímetro Jasco FP-750 (Tokio, Japan), equipado con un módulo agitador y un
sistema para la inyección de muestra a través de un septum con una jeringa Hamilton
digital (Nevada, USA) (Figura 12).
Figura 12. Fluorímetro Jasco FP-750.
§ Detector quimioluminiscente FireFly CL Detector (Global FIA Inc. P.O. Box 480,
Fox Island, WA 98333) (Figura 13), controlado por un registrador o por el software
cromatográfico Borwin con una interfaz Hercule Lite (JMBS, France).
Figura 13. Detector FireFly CL.

39
Los esquemas utilizados para las separaciones cromatográficas de los
derivados dansilados son:
§ Para la derivatización en línea de aminas alifáticas con Dns-Cl acoplada a HPLC con
detección fluorescente (Apéndice 2), el esquema es el que se muestra en la Figura
14:
Figura 14. Esquema correspondiente a la derivatización en línea acoplada a la
separación cromatográfica (Apéndice 2).
§ Para la determinación quimioluminiscente de aminas alifáticas o de amonio en agua
mediante HPLC (Apéndices 3 y 5 respectivamente), se ha utilizado el mismo
esquema (Figura 15) de separación y sistema post-columna acoplado.
Figura 15. Esquema correspondiente a la separación cromatográfica de aminas
alifáticas (Apéndice 3) / amonio (Apéndice 5) acoplada a un sistema de reacción post-
columna con detección quimioluminiscente.
Columna
Acetonitrilo : Imidazol
W
Muestra
analítica
Gradiente
elución:
Bomba 1
Sistema Post- columna
Tampón pH 7
Peróxido de
hidrógeno 0.011M
Bomba 3
TCPO 2.5 mM
Bomba 2
Detector QL
0.35 ml/min
0.35 ml/min
Modo de
Fluorimetro
(Fluorescencia)
Bomba 1
Columna Analítica
Bomba 2.
A
W
Columna
Primaria

40
En esta Tesis, se han utilizados tres montajes de análisis por inyección en flujo
(FIA):
§ El montaje utilizado en el método propuesto para el screening de muestras de Cu(II)
(Apéndice 6), se muestra en la Figura 16:
Figura 16. Sistema FIA utilizado en el Apéndice 6.
§ El montaje utilizado en la elaboración de una guía para la eliminación de los errores
sistemáticos en la especiación de Cr(III) y Cr(VI) (Apéndice 7), así como en el
estudio de la influencia de los protocolos de acondicionamiento de muestras de agua
en la detección quimioluminiscente de elementos traza (Apéndice 8) se muestra en
la Figura 17:
Figura 17. Sistema FIA utilizado en los Apéndices 7 y 8.
Válvula de
inyección
Luminol 1.2 mM
Celda de
detección
EDTA 0.01M,
KOH 0.02 M
Muestra
Bomba
Desecho
Instrumento
Detector
H2O2 0.1 M
Bomba 1
v (mL/min)
Bomba 2
v (mL/min)
Muestra (10-6M
Coproporfirina I)
CTAC 10-2 M
H2O2 0.7 M
H2O
H2O
0.7
2.2
5
2.9
Baño
100ºC
400 µL 200 µL
200 µL
I2
50 µL
50 µL
TCPO
Detector
QL
L = 7.5 cm
L = 12 cm
I1

41
§ El montaje utilizado en la determinación del Nitrógeno Orgánico amino y amonio
mediante la reacción del luminol con Hipoclorito en medio básico (Apéndice 11) se
muestra en la Figura 18:
Figura 18. Sistema FIA utilizado en el Apéndice 11.
W
Celda de
detección
Bucle:
50 µL
I
W
Reactor,
400 µL
Muestra
H2O
Luminol 1 mM,
0.2M CO3
2-
/HCO3
- pH 11.2
Hipoclorito 9 µM,
0.144mM CO3
2-
/HCO3
- pH 11.2

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42
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47
2. RESULTADOS OBTENIDOS Y DISCUSIÓN

Capítulo 2. RESULTADOS OBTENIDOS Y DISCUSIÓN
49
2.1. REACCIÓN DEL TCPO
2.1.1. SCREENING DE AMINAS ALIFÁTICAS Y DISMINUCIÓN
DE SUS LÍMITES DE DETECCIÓN EN AGUAS.
Este apartado se ha desarrollado en tres partes:
§ Preconcentración y dansilación de aminas alifáticas utilizando cartuchos C18 de
extracción en fase sólida y posterior separación cromatográfica de los derivados
dansilados con aplicación al análisis de screening en muestras de agua
medioambientales. Detección UV o fluorescente.
§ Automatización del procedimiento anterior: Derivatización en línea de aminas
alifáticas con Dns-Cl acoplada a HPLC con detección fluorescente.
§ Determinación quimioluminiscente de los derivados dansilados de aminas alifáticas
formados en cartuchos C18, mediante HPLC. Aplicación a muestras de agua.

REACCIÓN DEL TCPO
50
2.1.1.1. PRECONCENTRACIÓN Y DANSILACIÓN DE AMINAS ALIFÁTICAS
UTILIZANDO CARTUCHOS C18 DE EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA.
APLICACIÓN AL ANÁLISIS DE SCREENING EN MUESTRAS
MEDIOAMBIENTALES DE AGUA.
Existe muy poca información acerca de la existencia de aminas alifáticas en
aguas residuales industriales y en aguas superficiales. La cromatografía gaseosa (GC) [1-
5] y la cromatografía líquida (LC) [6-12] son las principales técnicas utilizadas para la
determinación de estos analitos. En la Tabla 10 se muestran algunos de los
procedimientos descritos en la bibliografía para la determinación de aminas en muestras
de agua a niveles de concentración bajos utilizando GC y LC.
Tabla 10. Condiciones de derivatización de aminas alifáticas.
Reactivo Muestra Tratamiento de la muestra Detec. LD Ref.
Cromatografía Gaseosa (GC)
Pentafluobenziladehido Agua
residual
Deriv. directa 15-30 min a 80 º C,
pH 10 y SPME y espaciado de
cabeza.
FID
0.4- 26
ppb
[1]
----
Agua
residual
SPME y espaciado de cabeza
(30min)
NPD
/MS
3-56 ppb [2]
---- Agua Muestras acidificadas NPD 12-40ppb [3]
---- Agua
Muestras acidificadas y espaciado
de cabeza (80ºC y 15 min).
NPD
0.2-20 ppb
0.01-3ppm
[4]
Bencenosulfonil cloruro
Agua
residual y
superficial
Deriv. directa 30 min a Tª amb.
Medio básico y extracción con
CH2Cl2.
MS 0.1 ppb [5]
Cromatografía Líquida (LC)
N-hidroxisuccinamidil
fluoresceína-O-acetato
Patrones
Deriv. 30 min 45ºC en tampón
borato pH 8.5.
FL [2]
3,5-dinitrobenzoil
cloruro (DBN)
Agua
Deriv. en C18-SPE 2 min a Tª
amb. En tampón borato pH 10.
UV 2-5 ppb [3]
Acridina-9-acetil-N-
hidroxisuccinimida
Agua
residual
Deriv. directa 10 min a 50ºC en
tampón borato pH 8-9.
FL
17-87
fmol
[4]
Cloruro de Dansilo
(DNS-Cl)
Agua
Enriquecimiento en línea en pre -
columna IRC-50. Deriv. en línea
a 65ºC en tampón borato pH 11.
CL
15-300
ppb
[5]
Fenil isotiocianato
Agua de
río, grifo,
superficial
Deriv. directa 15 min a 40ºC en
tampón carbonato. Limpieza de la
solución derivatizada (C18).
UV
0.2-0.6
ppb
[6]
4-(5’,6’-
dimetoxibenzotizoil)
fenilisotiocianato
Patrones Deriv. 30 min a 80ºC en NH4OH. FL [7]
Fluram Agua
Amberlita CG-120, recogida en
HCl, evaporada y redisuelta en 1
mL de tampón borato. Deriv. pH
10.
UV
0.02-1.2
ppb
[8]
(FMOC) Agua
Deriv. en C18-SPE. 2 min a Tª
amb. y pH 10.
FL
0.25-5
ppb
[13]
Cloruro de Dansilo
(DNS-Cl)
Agua
residual
Deriv. en C18-SPE 15 min a 85ºC
en tampón carbonato pH 9.5.
UV-
FL
3-15 ppb
Este
trabajo

51
Debido a las propiedades químicas de las aminas alifáticas, y sus bajos niveles de
concentración en las muestras, la mayoría de los procedimientos descritos requieren
técnicas de enriquecimiento como la extracción líquido-líquido (LLE), o más
recientemente la extracción en fase sólida (SPE), o la micro extracción en fase sólida
(SPME), normalmente combinada con derivatización pre- o post-columna en los
procedimientos de HPLC. En cromatografía de gases, se ha utilizado la técnica de SPME-
espaciado de cabeza [1,2], mejorándose los límites de detección hasta en tres órdenes de
magnitud para el análisis de aminas en aire y en matrices acuosas. En HPLC, las aminas
de bajo peso molecular normalmente se extraen con resinas Amberlita CG-120 [12] o
sorbentes de intercambio catiónico [14], mientras que sus derivados pueden extraerse con
sorbentes C18 [10]. M. Cobo y col. [9] han propuesto diferentes estrategias y condiciones
combinando derivatización y extracción, que permiten la cuantificación de estos analitos
a niveles inferiores a mg/L. La derivatización en disolución ha sido aceptada como un
paso efectivo [15], sin embargo, como puede verse en la Tabla 10, existen muchos
inconvenientes como el excesivo manejo de la muestra, tiempos de reacción largos,
temperaturas elevadas o consumo de disolventes. El uso de SPE para la extracción de los
derivados [10] previamente formados en disolución, puede resolver algunos problemas, y
gracias a los elevados factores de concentración, se pueden obtener límites de detección
similares o incluso menores a los obtenidos utilizando GC-MS con una instrumentación
mucho más sencilla [5].
Sin embargo, los problemas relacionados con el proceso de derivatización todavía
permanecen (manejo de la muestra, falta de automatización, etc.). Una solución posible a
los problemas de pasos extra y de interferencias, es llevar a cabo la etapa de
derivatización en el soporte sólido [16].
En esta dirección, este grupo de investigación ha desarrollado una metodología en
la que todos los pasos de la preparación de la muestra (extracción, concentración,
derivatización y transferencia al sistema cromatográfico) se llevan a cabo en el mismo
soporte, en línea o fuera de línea. El método se basa en atrapar los analitos en el sorbente,
purificarlos con un disolvente adecuado y derivatizarlos pasando el reactivo a través de
los cartuchos. El analito y el reactivo se dejan reaccionar durante un período de tiempo, y
después el exceso de reactivo se elimina (si se requiere) pasando un disolvente adecuado
a través de los cartuchos. Por último, los derivados, se desorben y se recogen para
procesarlos posteriormente [17] o son transferirdos a la columna primaria en un sistema
en línea [18-19].
Se ha demostrado recientemente la utilidad de esta metodología utilizando el
reactivo-UV 3,5-dinitrobenzoil cloruro (DNB) y las aminas alifáticas (etilamina,
isopropilamina y dimetilamina) [7]. También se ha estudiado la derivatización asistida en
soporte sólido de algunas aminas alifáticas con 9-fluorenilmetil cloroformiato (FMOC)
[13]. Esta metodología la han aplicado recientemente D. Shangguan y col. [20] en la
determinación de aminoácidos y péptidos con FMOC y sorbente de sílice.
En este trabajo, se aplica la mencionada metodología al análisis de screening de
alquilaminas en muestras de agua utilizando el reactivo Cloruro de Dansilo (Dns-Cl)
como reactivo derivatizante. Las derivatizaciones con DnsCl se llevan a cabo

REACCIÓN DEL TCPO
52
habitualmente en medio acuoso-acetona saturado con carbonato sódico en tiempos de
reacción largos y a elevadas temperaturas de reacción, y en muchos casos, se requiere la
extracción de los analitos derivatizados para eliminar el reactivo en exceso. Sin embargo,
es interesante el estudio de procedimientos de dansilación simplificados debido a los
límites de detección tan bajos que se alcanzan. Estos límites de detección pueden
mejorarse porque los derivados dansilados proporcionan quimioluminiscencia con el
ácido oxálico bis(2,4,6-tricloro fenil éster) (TCPO/H2O2).
Se propone un método rápido y sencillo para la preconcentración y derivatización
seguido de su separación mediante HPLC y detección de aminas en muestras de agua
medioambientales a niveles de µg/l. Se estudian sistemáticamente 7 aminas alifáticas y
amonio, para obtener las mejores condiciones analíticas de retención y dansilación en
cartuchos C18. Se optimizan las condiciones de separación cromatográfica. Los derivados
de dansilo se registran a 333 nm con detección UV, y a λexc = 350 nm / λem = 530 nm con
detección fluorescente. Finalmente, el método se aplica a la determinación o screening de
las aminas estudiadas en muestras de agua. Más información acerca de las condiciones
experimentales empleadas, se refleja en el Apéndice 1 [21].
Derivatización en disolución
La respuesta obtenida para las diferentes aminas al derivatizarlas en disolución,
se tomó como referencia para las medidas en cartucho (conversión del 100%). El exceso
de reactivo se destruyó al calentar, por lo que no interfirió al tiempo de retención de los
analitos.
Preconcentración y derivatización en cartuchos C18
Los cartuchos Bond Elut C18, se seleccionaron para la preconcentración y
purificación de las aminas alifáticas basándonos en estudios previos [17]. No se observó
elución al pasar 1 mL de muestra ni al pasar el reactivo (Dns-Cl 12.5 mM en acetona :
tampón carbonato 33.3 mM pH 9.5 (2:3, v/v)) a través del cartucho.
Se estudiaron los parámetros de la reacción de derivatización: pH del medio,
tiempo y temperatura de reacción. Los intervalos estudiados para cada parámetro
manteniendo fijos los otros dos, así como los óptimos seleccionados, se muestran en la
Tabla 11. Al estudiar el pH de la reacción se observó que el rendimiento de la reacción
aumentaba hasta pH 9.5, a partir del cual se mantuvo constante (Figura 19 A). El estudio
del tiempo de reacción, proporcionó rendimientos similares entre 15 y 45 minutos. Un
tiempo de reacción de 60 minutos se consideró excesivo (Figura 19 B). El estudio de la
Temperatura de reacción, reveló un aumento importante del rendimiento al utilizar 85 ºC,
que se mantuvo hasta 110ºC (Figura 19 C). No se observaron productos de degradación
en las condiciones óptimas seleccionadas (pH 9.5, Tª 85ºC, Tiempo 15 min).

53
Tabla 11. Parámetros de reacción estudiados.
Parámetro Intervalo Parámetros fijos Óptimo Seleccionado
pH 8.5-11.4 25ºC, 30 min pH 9.5
Temperatura 25-100 ºC pH 9.5, 15 min 85 ºC
Tiempo 0-60 min pH 9.5, 85 ºC 15 min
Al utilizar detección UV, la determinación de hexilamina presentó dificultades
debido a su coelución junto con el exceso de reactivo, por lo que se requirió un paso de
lavado del exceso de reactivo previo a la desorción del soporte de los derivados
dansilados formados. Para ello se utilizó una disolución saturada de carbonato en
presencia de hidróxido sódico. Se optimizó la concentración de NaOH en el intervalo 0.1-
0.3 M, seleccionando como óptima la concentración 0.1 M, pues a concentraciones
superiores el rendimiento de la reacción disminuía entre un 20 y un 4% en función de la
amina estudiada. Por otra parte, al utilizar detección fluorescente, no hubo problemas de
interferencia con el exceso de reactivo, lo que simplificó el procedimiento en el cartucho
eliminando la fase de lavado del reactivo.
Como disolvente de elución de los derivados dansilados del soporte, se utilizó 1
mL de acetonitrilo.
40
60
80
100
120
140
160
180
200
8 9 10 11 12
pH
Areadepico
A)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 20 40 60
Tiempo (min)
AreadePico
B)
0
100
200
300
400
500
600
20 40 60 80 100
Temperatura (ºC)
AreadePico
C)
Figura 19. Área de Pico frente a: A) pH
de la reacción. B) Tiempo de reacción. C)
Temperatura de la reacción.
♦ Metilamina, Etilamina, • N-
Propilamina, ×× Butilamina, ∗ Pentilamina.
Condiciones: DnsCl 5 mM; Tampón
borato 20 mM; concentración de amina 5
mg/l.

REACCIÓN DEL TCPO
54
Con estos parámetros optimizados, se evaluó la eficiencia del método de
derivatización asistida en soporte sólido propuesto, comparando las áreas de pico
obtenidas utilizando el procedimiento en cartucho con las obtenidas en disolución, y se
concluyó que el procedimiento en cartucho era más efectivo que en disolución. En la
Tabla 12 se puede ver como todas las recuperaciones son superiores al 100%. Esto se
debe a que el reactivo y la amina se concentran en el soporte sólido facilitando la
reacción. Las desviaciones estándar relativas también mejoran al utilizar la derivatización
en cartucho.
Tabla 12. Comparación entre la derivatización en cartucho y en disolución.
Derivatización en
disolución
Derivatización SPE C18
Analito
DER (%) %REC DER (%)
NH4
+
25 (320 ± 70) 22
Metilamina 25 (123 ± 9) 7
Etilamina 26 (135 ± 14) 10
N-Propilamina 20 (146 ± 16) 11
Butilamina 15 (130 ± 16) 12
Dietilamina 17 (160 ± 20) 13
Pentilamina 15 (133 ± 11) 8
Hexilamina 14 (163 ± 19) 12
El volumen de muestra a procesar, se estudió desde 1 a 25 mL con la intención
de aumentar el factor de preconcentración, de forma que la concentración final fuera la
misma en todos los ensayos. Los porcentajes de recuperación de la señal obtenidos
tomando como referencia la señal para 1 mL de muestra procesado, para cada amina en
los diferentes volúmenes estudiados, se reflejan en la Tabla 13.
Tabla 13. Porcentajes de Recuperación en función del Volumen de muestra procesado.
Volumen Muestra (mL) 1 5 15 25 50 100
Analito Porcentaje de Recuperación (%)
NH4
+
100 87.8 39.3 29.4
MA 100 79.0 50.3 37.4 26.1 9.4
EA 100 81.1 44.6 31.6 19.1 8.7
DMA 100 92.5 63.2 73.8
BA 100 82.5 52.6 48.5 37.5 15.7
DEA 100 58.3 42.3 34.6
PeA 100 93.7 63.5 61.5 11.6 11.8
HA 100 88.5 58.8 63.4 35.1 17.5

55
A mayores volúmenes, se observaron pérdidas por elución, mayores cuanto
mayor era el carácter polar del analito. Como compromiso, se seleccionaron 5 mL para
los ensayos posteriores.
En cuanto al volumen de disolvente utilizado para la desorción de los productos
de reacción, se utilizó la mínima cantidad posible para alcanzar el máximo factor de
preconcentración, obteniéndose porcentajes de recuperación similares al utilizar 0.5 o 1
mL de acetonitrilo.
Se intentó mejorar la retención de las aminas alcalinizando los patrones a pH 11,
y las recuperaciones fueron entre el 85% y el 115% respecto a los patrones neutros. Sin
embargo, para el amonio se obtuvo una recuperación del 40%, debido a su transformación
a amoniaco.
Separación cromatográfica
Los derivados dansilados se separaron en el sistema cromatográfico estando el
orden de elución relacionado con su carácter polar. Los tiempos de retención fueron: 2.2,
3.2, 3.9, 4.8, 5.7, 6.2, 6.7, 7.8 y 8.2 para NH4
+
, MA, EA, DMA, BA, PeA, HA y 1,7-
diaminoheptano respectivamente. En la Figura 20, se muestran los cromatogramas
típicos para un blanco y una mezcla de aminas (10 mg/l NH4
+
, 7.5 mg/l DEA y 2.5 mg/l
del resto de aminas) para un volumen procesado de 1 mL y condiciones de reacción
óptimas, con detección UV (Figura 20 A) o de fluorescencia (Figura 20 B)). En 9
minutos el cromatograma se completa para los 7 analitos y el patrón interno. En
fluorescencia, el blanco fue más limpio y el ruido de fondo menor.
Características analíticas
En la Tabla 14, se muestran las curvas de calibrado obtenidas para cada amina
utilizando detección UV y fluorescente, así como los intervalos lineales y límites de
detección. La sensibilidad varió en función de la amina estudiada, y los límites de
detección mejores fueron del orden de µg/l con ambos tipos de detección al procesar 5
mL de muestra. El amonio pudo identificarse, pero no cuantificarse.
Los estudios de precisión dieron medidas de repetibilidad (en un mismo día) algo
mejores que las medidas de reproducibilidad (entre días). Las medidas de repetibilidad
para diferentes volúmenes de muestra estudiados se muestran en la Tabla 15, siendo
mejores a menor volumen de muestra procesado. Los valores de desviación estándar
relativa para las medidas de reproducibilidad, se situaron entre el 7 y el 15 %.

REACCIÓN DEL TCPO
56
Figura 20. Cromatogramas para blanco ( ) y mezcla de aminas ( ) con detección
A) UV a 333 nm, y B) Fluorescencia λexc = 350 nm / λem = 530 nm.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
Absorbancia
Tiempo (min)
NH4+
MA
DMA
BA
EA
PeA
HA
DEA
A)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
Fluorescencia
Tiempo (min)
NH4+
MA
DMA BA
EA
PeA HA
DEA
B)

57
Tabla 14. Características analíticas para los derivados amina-dansilo con detección UV o
fluorescente.
Analito (a ±± sa) (b ±± sb) sy/x n r
2 Intervalo
lineal (µµg/l)
LD
(µµg/l)
D
MA (7 ± 3) (470 ± 10) 6.3 15 0.991 10-500 2 FL
EA (1 ± 2) (465 ± 9) 4 9 0.997 10-500 2 FL
DMA (10 ± 2) (255 ± 7) 3 10 0.996 10-500 3 FL
BA (-1 ± 1) (346 ± 7) 3 15 0.995 10-500 3 FL
DEA (8 ± 1) (74 ± 2) 2 7 0.990 30-1500 4 FL
PeA (-4 ± 2) (425 ± 10) 6 15 0.990 10-500 2 FL
HA (-3 ± 2) (388 ± 10 ) 6 14 0.992 10-500 2 FL
MA (18 ± 4) (567 ± 19) 8 15 0.992 10-500 3 UV
EA (2 ± 3) (495 ± 18) 8 14 0.990 10-500 6 UV
DMA (64 ± 4) (442 ± 17) 10 8 0.990 10-500 6 UV
BA (-1.6 ± 2.5) (331 ± 14) 7 14 0.990 10-500 9 UV
DEA (5 ± 2) (66± 3) 3.5 11 0.990 30-1500 15 UV
PeA (-2.9 ± 4) (306 ± 18) 7 11 0.990 10-500 8 UV
HA (10 ± 1) (177 ± 4) 2 12 0.997 20-500 15 UV
MA* (-1 ± 6) (85 ± 3) 10 6 0.996 100-5000 48 UV
EA* (-11 ± 4) (58 ± 2) 7 8 0.997 100-5000 93 UV
DMA* (-2 ± 2) (47.5 ± 0.8) 3 10 0.9992 100-5000 75 UV
BA* (-18 ± 4) (36 ± 1) 5 8 0.995 100-5000 90 UV
DEA* (11 ± 5) (7 ± 1) 4 4 0.990 350-15000 340 UV
PeA* (-11 ± 4) (37 ± 2) 6 9 0.991 100-5000 90 UV
HA* (-20 ± 4) (35 ± 1.5) 5 6 0.994 100-5000 70 UV
Condiciones: Volumen procesado: 5 mL (o 1 mL)*; Volumen de elución: 0.5 mL (o 1 mL)*.
Tabla 15. Estudios de precisión. Repetibilidad (Desviación Estándar Relativa %).
Repetibilidad DER( %)
Analito
1 mL 5 mL 10 mL 25 mL
MA 8 4 4 4
EA 4 4 9 14
N-para 4 - 8 15
BA 4 8 6 2
DEA(*) - 14 15 8
PeA 4 - 6 3
HA - 4 3 -
Concentración: 5 mg/L para 1 mL. *15 mg/L para 1 mL.

REACCIÓN DEL TCPO
58
Análisis de muestras de agua
Para validar la exactitud del método se fortificaron cuatro muestras de agua reales
(Muestra 1: agua de riego, Muestra 2: agua de lago, Muestra 3: agua de grifo, Muestra 4:
agua residual) con cantidades conocidas de los analitos (Método de Adición Estándar),
utilizando patrón interno para mejorar los resultados.
Las pendientes obtenidas para los analitos más polares (amonio, metilamina,
etilamina y dimetilamina) aplicando el MOSA, fueron menores que las obtenidas con
patrones, lo que indicaba la presencia de efecto matriz. Sin embargo, para analitos no
polares (dietilamina, butilamina y pentilamina), el comportamiento al aplicar el MOSA
fue similar al obtenido con patrones. Además se observó que este comportamiento en las
recuperaciones, no dependía de la concentración, lo que se refleja en la Figura 21.
Figura 21. Porcentajes de recuperación en dos muestras de agua diferentes para las
diferentes aminas a diferentes niveles de concentración.
Los porcentajes de recuperación para las tres muestras de agua procesadas
utilizando 5 mL de muestra (Muestras 1, 2, y 3), se reflejan en la Tabla 16. Se puede
deducir un porcentaje de recuperación medio para cada analito puesto que no hubo
diferencias en las recuperaciones entre las diferentes muestras procesadas. Para deducir la
concentración en muestras, habría que aplicar el método de adición estándar o bien
utilizar la curva de patrones corregida por el factor de recuperación correspondiente a
cada analito.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.2 0.4 0.6
Conc (ppm)
%Rec(Alturadepico)
NH
MA
EA
DMA
BA
PEA
DEA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.1 0.2 0.3
Conc (ppm)
%Rec(Alturadepico)
NH
MA
EA
DMA
BA
PEA
DEA

59
Tabla 16. Porcentajes de recuperación y desviación estándar relativa para cada analito en
las diferentes muestras de agua.
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 %Rec Medio
Analito % Rec DER
(%)
% Rec DER
(%)
% Rec DER
(%)
% Rec DER
(%)
NH4
+
45±3 6 25±3 14 38±6 17 37±9 25
MA 46±9 19 38±2 5 65±9 14 51±14 27
EA 69±7 11 79±5 7 88±19 22 80±14 17
DMA 74±5 6 74±3 4 83±13 16 78±9 11
BA 101±17 17 112±4 3 103±20 19 106±13 12
DEA 109±11 10 105±4 4 109±14 13 107±8 8
PeA 94±18 20 112±4 3 119±14 11 108±16 15
La muestra de agua residual analizada, Muestra 4, contuvo una concentración de
aminas elevada, por lo que se requirió menor volumen para su análisis (0.2 mL de
muestra se llevaron a 1 mL). El screening de esta muestra (Figura 22) mostró la
presencia de amonio, metilamina, dimetilamina y pentilamina.
Figura 22. Cromatogramas para: a) Muestra 4. b) Muestra 4 fortificada con la mezcla de
1.25 mg/L de cada amina.
La fortificación de esta muestra con una mezcla de todas las aminas, dio
recuperaciones del orden del 100% para todas las aminas, lo que indicaba la ausencia de
efecto matriz. Las pendientes del MOSA fueron comparadas con un test t de comparación
de pendientes, y resultaron similares a las pendientes de las curvas de calibrado de
patrones con una probabilidad del 99%.
0 2 4 6 8 10
Absorbancia
Tiempo (min)
NH4+
EA DEA
BA
PeA
HA
I.S.
NH4+
MA
DMA
MA
DMA
PeA
I.S. a)
b)

REACCIÓN DEL TCPO
60
Para esta muestra, las concentraciones deducidas para cada analito utilizando el
MOSA o la curva de calibrado con patrones se muestran en la Tabla 17. Como puede
observarse, los errores relativos son aceptables en todos los casos.
Tabla 17. Concentraciones deducidas en la muestra de agua residual (% Error relativo)
Concentraciones deducidas
Analito
Concentrac.
Adicicionada
(mg/l) MOSA
Calibrado
patrones
1.5 1.14 (8.8%) 1.13 (9.6%)
Metilamina
2.5 2.61 (4.4%) 2.56 (2.4%)
1.5 1.34 (7.2%) 0.98 (21.6%)
Etilamina
2.5 2.49 (0.4%) 2.58 (3.2%)
1.5 1.13 (9.6%) 1.18 (5.6%)
Dimetilamina
2.5 2.56 (2.4%) 2.40 (4%)
1.5 1.22 (2.4%) 1.08 (13.6%)
Butilamina
2.5 2.52 (0.8%) 2.56 (2.4%)
1.5 1.08 (13.6%) 1.21 (3.2%)
Pentilamina
2.5 2.57 (2.8%) 2.50 (0%)
3.75 3.75 (0%) ---
Dietilamina
7.5 7.50 (0%) 7.51 (0.13%)
Conclusiones
La derivatización en cartuchos C18, fue más efectiva que la derivatización en
disolución. Las condiciones óptimas de derivatización fueron: pH de la reacción 9.5,
temperatura y tiempo de reacción: 85 o 100ºC y 15 o 10 minutos respectivamente, y
volumen de muestra a procesar 5mL o 1 mL. El procedimiento propuesto fue simple y
rápido y consumió menos tiempo que otros procedimientos de dansilación, siendo el
tiempo total de análisis (tratamiento de la muestra más cromatografía) menor de 25
minutos.
Se pudieron procesar hasta 5 mL de muestra con pocas pérdidas en las aminas
más polares. Las recuperaciones en muestras fueron independientes del tipo de muestra
analizada, pero dependientes del analito. El efecto matriz pudo corregirse aplicando el
MOSA o utilizando la curva de calibrado de patrones teniendo en cuenta los porcentajes
de recuperación.
En muestras cuyo contenido en aminas es a niveles de mg/L, como la muestra de
agua residual, el volumen a procesar fue de 0.2 mL diluido a 1 mL. En este caso, no hubo
efecto matriz, siendo las recuperaciones cercanas al 100% para todas las aminas.

61
El procedimiento propuesto pudo aplicarse con exactitud y reproducibilidad
satisfactorias a la determinación de siete aminas alifáticas a niveles de concentraciones
inferiores a los mg/L, y también para la identificación de amonio. El procedimiento se
utilizó para el screening de amonio y aminas en una muestra de agua residual.

REACCIÓN DEL TCPO
62
2.1.1.2. DERIVATIZACIÓN EN LÍNEA DE AMINAS ALIFÁTICAS CON Dns -Cl
ACOPLADA A HPLC CON DETECCIÓN FLUORESCENTE.
La marcada tendencia en Química Analítica hacia el desarrollo de sistemas
completamente automatizados, requería alguna aportación en este sentido. Los
procedimientos de trabajo en línea, se basan en los mismos principios que los
procedimientos de trabajo fuera de línea. La instrumentación requerida así como el
manejo de la misma, es mínimo frente al equipamiento convencional. Normalmente, no
requieren la continua intervención del operador, lo que se traduce en una menor
variabilidad y menores errores sistemáticos.
Con esta intención, y continuando con el trabajo anterior, se propuso la
derivatización en línea de aminas alifáticas con cloruro de dansilo acoplada a HPLC con
detección fluorescente.
Condiciones de enriquecimiento, lavado y derivatización
Para la reacción de derivatización en línea de aminas alifáticas con cloruro de
dansilo acoplada a la separación cromatográfica de los derivados dansilados formados
con detección fluorescente, se utilizó el montaje mostrado en la Figura 14 del Capítulo
1-Introducción (Pág. 39). En este montaje, las muestras se inyectaban en una precolumna
empaquetada con material de relleno C18 para el enriquecimiento, lavado y
derivatización de la muestra con el reactivo Dns-Cl. Más información acerca de las
condiciones experimentales se refleja en el Apéndice 2 [22].
Se optimizaron las condiciones de retención en la precolumna así como de
derivatización, tales como: volumen de muestra, concentración del reactivo, tiempo de
reacción, temperatura de reacción, relación reactivo:tampón y características de la fase
móvil. En la Tabla 18, se muestran los intervalos estudiados y las condiciones óptimas
escogidas en función de la máxima retención de los analitos en la precolumna, así como
la máxima reactividad en cuanto a la formación del derivado dansilado.
Tabla 18. Condiciones optimizadas e intervalos estudiados.
Parámetro Intervalo Óptimo
Concentración DnsCl 2.5 mM - 12.5 mM 5 mM
Volumen muestra 150 - 400 µL 150 µL
Temperatura 20 - 80ºC 60ºC
Tiempo reacción 10 - 30 min 10 min
Relación
Reactivo:tampón
40:60 o 30:70 40:60
Fase móvil Tampón pH 12 o H2O H2O

63
Condiciones cromatográficas
Además de las condiciones de retención y derivatización, se establecieron las
condiciones cromatográficas óptimas para el análisis de screening de aminas alifáticas en
muestras de agua utilizando cloruro de dansilo como reactivo de derivatización. Estas
condiciones así como la programación de tiempos se muestra en la Tabla 19.
Tabla 19. Condiciones cromatográficas experimentales para la retención, derivatización,
separación y detección en línea de aminas alifáticas.
Tiempo
(min)
Precolumna Columna Analítica
Posición de
la válvula
0
0-3.75
9-13.5
Inyección de Muestra:150µL
Inyección de Dns-Cl 5 mM: 40 µL
Inyección de tampón: 60 µL
Lavado de la muestra: Gradiente de 0.5
mL/min a 0 en 3.75 min
50:50(v/v)(acetonitrilo:imidazol pH 7)
(v flujo = 0.1 mL/min)
(gradiente v flujo = 0.1 a 1 mL/min)
A
13.5-16.5 Separación Analítica
70:30 (v/v) Acetonitrilo:Imidazol pH 7
modo gradiente
B
16.5-28.5
28.5-29.5
30.5
H2O:Acetonitrilo(gradiente a 100%
acetonitrilo)
H2O:Acetonitrilo (gradiente a 100%
agua)
Fin
modo gradiente hasta 90% MeCN
(gradiente v flujo = 1 a 0.1 mL/min)
A
Las curvas de calibrado lineales obtenidas para metilamina, etilamina,
dimetilamina, butilamina, dietilamina, pentilamina y hexilamina utilizando detección
fluorescente, así como los intervalos dinámicos de concentración, tiempos de retención
(tr), límites de detección (calculados como la concentración correspondiente a una
relación señal/ruido de 3) y otras figuras de mérito, se muestran en la Tabla 20. La
sensibilidad varió en función de la amina estudiada, obteniendo mayor sensibilidad y
menores límites de detección al aumentar la longitud de la cadena alifática.
Los cromatogramas típicos en las condiciones de reacción optimizadas, para un
blanco y una mezcla de aminas de concentración 1.25 mg/l para MA, EA y DMA, 0.75
mg/l para BA, 3.75 mg/l para DEA y 0.375 para PeA y HA, se muestran en la Figura 23.
Como puede observarse, la separación de las 7 aminas es buena y después de la
derivatización, el registro del cromatograma completo solo requiere 9 minutos.

REACCIÓN DEL TCPO
64
Tabla 20. Curvas de calibrado, parámetros analíticos y tiempos de retención para la
derivatización en línea de aminas alifáticas con Dns-Cl.
Amina (a ±± sa) (b ±± sb)
IL
(mg/L)
n r
2
sy/x
LD
(ìg/L)
tr (min)
MA (-40 ± 60) (130 ± 40) 0.5-2.25 3 0.921 60 7 1.86
EA (-50 ± 40) (90 ± 30) 0.5-2.25 3 0.922 30 15 2.4
DMA (52 ± 10) (289 ± 10) 0.5-2.5 5 0.996 19 11 3.07
BA (5 ± 13) (420 ± 30) 0.075-1.35 3 0.996 14 0.6 4.24
DEA (42 ± 16) (32.8 ± 1.4) 0.15-22.5 5 0.995 20 3 4.81
PeA (-30 ± 120) (2900 ± 200) 0.015-1 10 0.951 200 0.03 5.85
HA (-70 ± 50) (3360 ± 50) 0.015-2.5 11 0.998 120 0.05 7.28
Figura 23. Cromatogramas para la derivatización en línea de aminas alifáticas con Cloruro
de dansilo para un blanco y una mezcla de aminas.
Los estudios de precisión proporcionaron valores de repetibilidad buenos en las
condiciones óptimas estudiadas, siendo los porcentajes de desviación estándar relativa
(%DER) 19.8, 11.7, 10.8, 19.6, 18.4, 6.3 y 3.4 % para MA, EA, DMA, BA, DEA, PeA y
HA respectivamente (Concentraciones: 1.5 mg/l para MA, EA y DEA; 0.5 mg/l para
DMA, BA y PeA; y 0.2 mg/l para HA).
0 2 4 6 8 10
40
80
120
160
200
MA
EA
DMA BA
DEA
PeA
HA
S.I.
Tiempo (min)
Fluorescencia
Blanco
Mezcla de
aminas

65
Se analizó mediante este procedimiento la muestra de agua residual, que se
fortificó con la mezcla de aminas. Los porcentajes de recuperación obtenidos para las
diferentes aminas: 17%, 66%, 13%, 21%, 14%, 73% y 102% para MA, EA, DMA, BA,
DEA, PeA y HA respectivamente, aumentaron al aumentar la longitud de la cadena
alifática. Esta presencia de efecto matriz, habría de corregirse utilizando el método de
adición estándar si la finalidad del análisis fuera la determinación.
Basándonos en estos resultados, concluimos que podemos utilizar el
procedimiento propuesto para el screening de aminas alifáticas en aguas. El
cromatograma obtenido para la muestra de agua residual (Figura 24), mostró la presencia
de compuestos como metilamina, dimetilamina y pentilamina en esta muestra.
Figura 24. Cromatograma de screening de una muestra de agua residual.
Conclusiones
Las condiciones óptimas de retención en la precolumna y derivatización fueron:
150 ìL de muestra, DnsCl 5 mM, Tª 60ºC, 10 minutos de reacción, relación reactivo:
tampón 40:60, y fase móvil agua. Con la optimización de las condiciones
0 2 4 6 8 10
40
80
120
160
200
MA
DMA
PeA
HA I.S.
Fluorescencia
Tiempo (min)

REACCIÓN DEL TCPO
66
cromatográficas, en 30 minutos, se consiguió en línea la retención, derivatización y
separación cromatográfica de las 7 aminas alifáticas.
Este sistema presentó la ventaja de la completa automatización frente al sistema
presentado en el capítulo anterior (Apéndice 1, [21]). Además, las condiciones de la
reacción de derivatización fueron algo menos drásticas, con la ventaja de que la misma
precolumna podía reutilizarse inyección tras inyección. En el caso de la derivatización en
cartuchos de extracción en fase sólida, un mismo cartucho solamente podía reutilizarse
una sola vez. Se consiguió mejorar los límites de detección para Butilamina, Pentilamina
y Hexilamina, aunque para metilamina, etilamina, dimetilamina y dietilamina, los límites
de detección alcanzados fueron peores. Los estudios de precisión dieron %DER inferior
al 20% en todas las aminas.
La sensibilidad varió en función de la amina estudiada, aumentando al aumentar
la longitud de la cadena alifática.
Los estudios de recuperación de la cantidad fortificada en la muestra, dieron un
comportamiento similar al obtenido al utilizar el procedimiento fuera de línea (Apéndice
1, [21]), aumentando los porcentajes de recuperación al aumentar la longitud de la cadena
alifática. El efecto matriz habría de corregirse utilizando el MOSA para las aminas de
cadena corta. El procedimiento es aplicable al screening de aminas en muestras de agua.

67
2.1.1.3. DETERMINACIÓN DE AMINAS ALIFÁTICAS EN AGUA MEDIANTE
HPLC CON DETECCIÓN QUIMIOLUMINISCENTE.
Las aminas alifáticas son compuestos que se encuentran a bajas concentraciones
en algunos tipos de aguas, por lo que los métodos para su análisis han de ser
suficientemente sensibles. La sensibilidad y la selectividad necesarias se pueden alcanzar
por combinación de la derivatización de los analitos con técnicas de separación
(cromatografía líquida (LC), cromatografía gaseosa (GC) o electroforesis capilar (CE)) y
un método de detección de elevada sensibilidad (métodos quimioluminiscentes (QL),
electroquímicos o espectrometría de Masas). La técnica de detección quimioluminiscente
ha demostrado ser una herramienta sensible para la medida de niveles ultra trazas, con
sistemas ópticos baratos y simples que proporcionan bajo ruido de fondo y un amplio
intervalo dinámico [23].
La quimioluminiscencia de compuestos sintéticos como la lofina, el Luminol, los
ésteres de acridinio, ésteres de perioxalato y complejos de rutenio, se ha utilizado
ampliamente. Derivados del Luminol como el N-(4-(aminobutil)N-etilisoluminol (ABEI),
NN’dissinimidilcarbonato (DSC) [24-25], 4-isotiocianatoftalhidracina (ILITC) [26], 6-
isotiocianatobenzo(g)ftalacina-1, 4(2H,3H)-diona (IPO) [27], y ácido 4-(6,7-dihidro-5,8-
dioxotiazolo (4,5-g)ftalacina-2-il) benzoico N-hidroxisuccinimida éster (TPB-suc) [28],
se han utilizado como reactivos quimioluminiscentes para la determinación de
compuestos amino.
El Tris(bipiridil)rutenio(III) [Ru(bipi)3] se ha empleado para la determinación de
una gran variedad de compuestos de nitrógeno sin necesidad de derivatizar el analito
[24,29]. El método quimioluminiscente del [Ru(bipi)3] es muy selectivo para la
determinación de aminas terciarias, pero no muy sensible comparado con otras técnicas
de determinación quimioluminiscente. Este reactivo normalmente se electrogenera, dando
lugar a quimioluminiscencia electrogenerada (ECL) [30]. A pesar del elevado potencial
teórico de la ECL, solamente ciertas reacciones han encontrado aplicación en análisis,
debido a limitaciones como la presencia de especies interferentes, su compleja
optimización y su falta de reproducibilidad [31].
En presencia de un fluoróforo, los derivados oxálicos son los emisores
quimioluminiscentes no biológicos más eficientes. Los más utilizados recientemente son
el Bis-(2,4,6.triclorofenil)oxalato (TCPO), el bis (2,4-dinitrofenil)oxalato (DNPO) y el
Bis[2-(3,6,9-trioxadeciloxicarbonilfenil]oxalato. Las principales ventajas de estos
sistemas son la eficiencia y la flexibilidad. Estos sistemas requieren la presencia de un
compuesto fluorescente, obtenido normalmente a través de la reacción de derivatización
del analito. Se han utilizado reactivos derivatizantes como el Cloruro de Dansilo (Dns-Cl)
[32-33,18] para aminas biogénicas y anfetaminas, el naftaleno-2,3-dialdehido (ADA) [34]
para aminas primarias, y la luminarina [35] para aminas primarias y secundarias,
combinados con mezclado postcolumna con los reactivos TCPO y H2O2.
En este trabajo, se estudia la generación de quimioluminiscencia post-columna
con el sistema TCPO/H2O2, para aumentar la sensibilidad del procedimiento de
dansilación previamente expuesto (Apéndice 1, [21]) para aminas de bajo peso molecular

REACCIÓN DEL TCPO
68
en muestras de agua medioambientales, alcanzándose niveles por debajo de los ng/mL. Se
estudian sistemáticamente seis aminas alifáticas: metilamina, etilamina, butilamina,
pentilamina, hexilamina y dietilamina. Además, se incluyen también aminas biogénicas
como putrescina, cadaverina, espermina y espermidina en el estudio de screening. Por
último, se aplica el método a la determinación de aminas en muestras de agua reales. Más
información acerca de las condiciones experimentales se refleja en el Apéndice 3 [36].
Los resultados obtenidos con detección quimioluminiscente, se comparan con los
obtenidos con detección UV y fluorescente utilizando el reactivo cloruro de dansilo [21,
22] u otros reactivos como cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo (DNB) [7],
fluorenilmetilcloroformiato (FMOC) [13] y orto-ftaldialdehido/N-Acetil-L-Cisteína
(OPA/NAC) [37].
Condiciones de preconcentración y condiciones pre y post columna
Se utilizaron las condiciones de preconcentración y derivatización establecidas
previamente en el Apéndice 1 (Pág. 52-55). Los productos de reacción formados se
eluyeron con 0.5 mL o 1 mL de acetonitrilo. Los derivados dansilados se inyectaron en el
sistema cromatográfico y se mezclaron después de su separación, con el TCPO y el H2O2.
En cuanto a las condiciones postcolumna, los parámetros que afectaban a la
respuesta quimioluminiscente de acuerdo con los estudios previos [38-39] eran:
temperatura, pH, cantidad de agua, catalizador, disolvente, concentración de TCPO,
concentración de H2O2, volumen del tubo de mezclado, volumen de la celda de detección
y velocidades de flujo de los diferentes canales. Los parámetros establecidos para este
trabajo fueron: temperatura ambiente, acetonitrilo como disolvente, imidazol como
catalizador, velocidades de flujo inferiores a 0.6 mL/min, longitud del tubo de mezclado
mínima para el montaje, volumen de la celda de detección fijado por el instrumento de
medida, concentración de TCPO superior a 0.1 mM y relación TCPO:H2O2 cercana a 5.
Los parámetros más críticos, la concentración y el pH del Imidazol (evaluados en la
bibliografía en los rangos 0.1-5 mM y pH 5-7), dieron la máxima relación señal/ruido a
concentración 1 mM y pH 7, siendo la velocidad del flujo 1.5 mL/min.
El producto de reacción entre el TCPO y el H2O2 (el 2,4,6-triclorofenol), puede
dar lugar a efecto quenching disminuyendo la señal quimioluminiscente. Para evitar este
producto, ambos reactivos se prepararon por separado y se mezclaron en el sistema (ver
montaje en la Figura 15 del Capítulo 1-Introducción, Pág. 39). Se observó que la
sensibilidad era 5 veces superior cuando el TCPO (preparado en una mezcla
acetonitrilo:tetrahidrofurano), se mezclaba con los derivados antes que el H2O2. La
concentración de TCPO se varió entre 0.5-5mM a 0.35 mL/min, aumentando la
sensibilidad al aumentar la concentración del TCPO, pero no se observaron diferencias
entre las concentraciones 2.5 mM y 5 mM, por lo que se eligió como concentración
óptima de TCPO 2.5 mM. Al variar la concentración del H2O2, se observó que la
intensidad de QL disminuía al aumentar la concentración por encima de 5 mM, además

69
de aumentar la línea base (ruido de fondo), mientras que al trabajar en el intervalo 11-
5mM, la señal se mantuvo estable. En la Tabla 21, se resumen las condiciones
experimentales óptimas para los pasos pre y post columna.
Tabla 21. Condiciones pre y postcolumna óptimas para la determinación de aminas.
Paso Parámetros experimentales
Pre-columna:
Preconcentración
Derivatización en cartuchos C18
1 mL Metanol
1 mL tampón carbonato pH 12, 10mM
1 mL/5 mL muestra
0.5 ml reactivo Dns-Cl
Tª 110ºC-10 min
Elución 1 mL Acetonitrilo
Separación Cromatográfica de los
derivados dansilados.
Inyección de muestra: 20 µl
Gradiente: 0 min. 50:50, 9 min (80:20)
(MeCN:imidazol pH 7), v flujo = 1.5 mL/min
Post-columna:
Reacción Quimioluminiscente de los
derivados dansilados previamente
separados.
TCPO 2.5 mM, 0.35 ml/min
H2O2 11 mM, 0.35 ml/min
La eficiencia de la reacción para cada amina medida por separado, respecto a la
medida en la mezcla de las seis aminas, se evaluó mediante los porcentajes de
recuperación de señal (Señal mezcla*100/Señal por separado), los cuales fueron:
(108±14), (100±11), (114±3), (88±3), (78±5) y (109±16) para MA, EA, BA, PeA, HA y
DEA respectivamente. Estos porcentajes tan próximos al 100%, indicaron que no había
diferencias significativas al trabajar con la mezcla de aminas.
Para aumentar el factor de enriquecimiento se estudió el volumen de muestra a
procesar entre 1 y 25 mL. En la Figura 25, puede observarse como al utilizar 25 mL, se
produjeron importantes pérdidas por elución de los analitos, de modo que para mejorar
los límites de detección en la determinación de las aminas, podían utilizarse volúmenes
de 5 o 10 mL.
0
20
40
60
80
100
%Recuperación
MA
EA
BA
DEA
PeA
HA
V = 1 ml
V = 5 ml
V = 10 ml
V = 25 ml
Figura 25. Porcentajes de recuperación para las diferentes aminas estudiadas
en función del volumen de muestra procesado.

REACCIÓN DEL TCPO
70
Condiciones cromatográficas
Para la separación de las seis aminas alifáticas, se empleó el Gradiente de Fase
Móvil 1 (acetonitrilo:imidazol 50:50 a t = 0 min, 80:20 a t = 9 min, 50:50 a t = 10min), y
los cromatogramas típicos obtenidos muestran la total separación de las seis aminas
(Figura 26) en tan solo 7 minutos, con tiempos de retención 2.27, 2.79, 4.33, 4.81, 5.27 y
6.31 min, para MA, EA, BA, DEA, PeA y HA respectivamente. En esta misma figura, se
muestra también el cromatograma del blanco yel cromatograma correspondiente a una
mezcla que incluye además de estas 6 aminas, 4 aminas biogénicas (putrescina,
cadaverina, espermina y espermidina). Como puede observarse en la Figura 26, los picos
correspondientes al blanco no interfirieron en los picos de las aminas en estudio. También
se observó que utilizando este gradiente de elución, la Putrescina coeluye con la
Pentilamina.
0 4 8 12 16
Tiempo (min)
SeñalQuimioluminiscente
Fase Móvil 1
Blanco
Aminas Alifáticas
Aminas Alifáticas +
Aminas Biogénicas
R
R
R
R
R
R
1
2
3 4
5
6
1
2 34
5+7 8
6
9
10
Figura 26. Cromatogramas correspondientes a blanco, patrón de aminas alifáticas y patrón
de aminas alifáticas + aminas biogénicas, utilizando el gradiente de Fase Móvil 1. R-
Reactivo, 1-MA (concentración 0.15 mg/l), 2- EA (0.240 mg/l), 3-BA (0.3 mg/l), 4- DEA (0.48
mg/l), 5-PeA (0.3 mg/l), 6-HA (0.3 mg/l), 7-Put (0.3 mg/l), 8-Cad (0.3 mg/l), 9-Spd (0.3 mg/l),
10-Spm (1.12 mg/l).
El Gradiente de Fase Móvil 2 (acetonitrilo:imidazol 50:50 isocrático de a t = 0 a
13 min, gradiente hasta 90:10 a t = 17 min, 50:50 a t = 20min), se empleó para la
separación de las 10 aminas (alifáticas + biogénicas). El cromatograma completo del
blanco y de una mezcla de las 10 aminas se muestra en la Figura 27. El registro con las

71
10 aminas separadas duró 20 minutos y los tiempos de retención fueron: 2.41, 3.17, 6.38,
7.54, 9.51, 10.74, 13.65, 14.54, 17.6 y 18.52 minutos, para MA, EA, BA, DEA, PeA, Put,
Cad, HA, Spd y Spm respectivamente. Este gradiente permitió la separación de los picos
de Pentilamina y Putrescina que coeluían al utilizar el Gradiente de Fase móvil 1.
0 4 8 12 16 20
Tiempo (min)
R
R
R
R
1
2 3
4
5
7 8
6
9
10
Fase Móvil 2
Aminas Alifáticas +
Aminas Biogénicas
Blanco
Figura 27. Cromatogramas correspondientes a blanco y patrón de aminas alifáticas +
aminas biogénicas, utilizando el gradiente de Fase Móvil 2. R-Reactivo, 1-MA
(concentración 0.15 mg/l), 2- EA (0.240 mg/l), 3-BA (0.3 mg/l), 4- DEA (0.48 mg/l), 5-PeA
(0.3 mg/l), 6-HA (0.3 mg/l), 7-Put (0.3 mg/l), 8-Cad (0.3 mg/l), 9-Spd (0.3 mg/l), 10-Spm
(1.12 mg/l).
Curvas de calibrado y parámetros analíticos
Para evaluar las posibilidades cuantitativas del método propuesto, se estudiaron
las curvas de calibrado Altura de Pico frente a Concentración (mg/l) para cada amina
utilizando la Fase Móvil 1. En la Tabla 22, se muestran los resultados obtenidos
utilizando volúmenes de patrón de 1, 5 y 10 mL. Se observa buena linealidad en todos los
casos, estando los intervalos lineales en los µg/L. Las sensibilidades (pendiente de los
calibrados) aumentaron del orden de 4-5 veces al procesar volúmenes de 5 mL frente a 1
mL, y del orden de 10 veces al procesar volúmenes de 10 mL frente a 1 mL.
Los límites de detección establecidos como la concentración requerida para
generar una relación señal/ruido de 3, para los volúmenes de patrón procesados de 1, 5

REACCIÓN DEL TCPO
72
(elución con 0.5 o 1 mL de acetonitrilo), 10 y 25 mL, se muestran en la Tabla 23. Los
mejores límites de detección se alcanzaron procesando 5 mL de patrón y eluyendo los
derivados dansilados con 0.5 mL de acetonitrilo, o bien procesando 10 mL de muestra y
eluyendo con 1 mL de acetonitrilo.
Tabla 22. Parámetros analíticos de los derivados amina-dansilo detectados por
quimioluminiscencia.
Amina V (mL)
b ±± sb
(L· mg
-1
)
a ±± sa
(Voltios)
sy/x r
2
n LI (µµg/L)
MA 1 1900 ± 120 25 ± 14 17 0.9887 5 17-200
EA 1 1010 ± 30 -3 ± 5 6 0.9987 4 3-320
BA 1 570 ± 40 -8 ± 9 12 0.9904 4 13-400
PeA 1 820 ± 50 -8 ± 12 15 0.9920 4 7-400
HA 1 630 ± 20 2 ± 6 7 0.9969 4 7-400
DEA 1 239 ± 17 7 ± 6 8 0.9856 5 13-640
MA 5 10500 ± 500 16 ± 14 15 0.9973 3 4.3-40
EA 5 4300 ± 500 -17 ± 18 20 0.9629 5 0.7-64
BA 5 1790 ± 160 -5 ± 8 9 0.9838 4 3-80
PeA 5 3000 ± 300 -9 ± 14 16 0.9732 5 2-80
HA 5 2800 ± 200 -9 ± 10 11 0.9847 5 1.7-80
DEA 5 860 ± 50 3 ± 4 5 0.9919 4 4-128
MA 10 22300 ± 1500 52 ± 10 15 0.9915 4 3-10
EA 10 10100 ± 500 3 ± 6 9 0.9944 4 0.5-16
BA 10 5600 ± 600 4 ± 8 12 0.9787 4 2-20
PeA 10 9000 ± 500 1 ± 7 10 0.9935 4 1-20
HA 10 10300 ± 300 5 ± 4 6 0.9984 4 1-20
DEA 10 2870 ± 150 2 ± 3 5 0.9943 4 3-32
Tabla 23. Limites de detección (µg/L) obtenidos con detección quimioluminiscente a
diferentes volúmenes de muestra y diferentes volúmenes de elución. Comparación con los
valores obtenidos con otros sistemas de detección y reactivos.
Detección
Reactivo
QL
DNSCl
UV
DNSCl
FL
DNSCl
UV
DNB
FL
FMOC
FL
OPA/NAC
V Muestra
V Elución
1 ml
1 ml
5 ml
1 ml
5 ml
0.5 ml
10 ml
1 ml
25ml
1 ml
5 ml
0.5 ml
5 ml
0.5 ml
5 ml
0.5 ml
5 ml
0.5 ml
10 ml
2 ml
MA 5 1.3 0.9 0.8 2 3 2 - 0.5 5
EA 0.8 0.2 0.15 0.15 0.2 6 2 5 0.25 6
BA 4 0.9 0.5 0.6 0.8 9 3 - 1 10
PeA 2 0.6 0.3 0.3 0.5 8 2 - 5 23
HA 2 0.5 0.3 0.3 0.3 15 2 - 2.5 -
DEA 4 1.3 0.8 0.8 0.9 15 4 - - -

73
Los estudios de precisión en función del volumen de patrón procesado se
muestran en la Tabla 24. Los valores de desviación estándar relativa fueron adecuados
independientemente del volumen de muestra, siendo los valores de repetibilidad similares
a los de reproducibilidad. Se seleccionó como volumen óptimo 5 mL. Si bien la precisión
fue algo pobre para la dietilamina, para otras aminas como la pentilamina, se mejoró este
parámetro de un 20 a un 0.9% (ver Tabla 24).
Tabla 24. Estudios de precisión (DER %). Repetibilidad y reproducibilidad del método
utilizando diferentes volúmenes de muestra.
Repetibilidad
(% DER)
Reproducibilidad
(% DER)Analito
1 ml 1 ml 5 ml 10 ml
Metilamina 6 0.8 11 7
Etilamina 10 4 10 17
Butilamina 3 6 16 13
Pentilamina 5 20 0.9 9
Hexilamina 11 1.3 3 8
Dietilamina 16 10 29 9
El método propuesto se aplicó al análisis de varias muestras de agua. La
fortificación de las muestras con cantidades conocidas de los analitos, se utilizó para
validar la exactitud del método. En la Tabla 25 se muestran las concentraciones
fortificadas encontradas para cada una de las muestras analizadas. Para las muestras de
agua de grifo (S1), agua de riego (S2), agua de lago (S3), y agua residual (S4), las
concentraciones halladas por el método fueron muy cercanas a las reales adicionadas,
siendo los porcentajes de recuperación medios (± desviación estándar): 113 (± 22, n=7),
100 (± 19, n=4), 114 (± 11, n=7) y 99 (± 11, n=12) % para S1, S2, S3 y S4
respectivamente. Estos valores se consideraron aceptables teniendo en cuenta los niveles
de concentración ensayados. En todos los casos, indicaron la ausencia de efecto matriz.
Sin embargo, la muestra de agua marina analizada (S5), dio porcentajes de
recuperación cercanos al 100% (101 ± 22) para aminas con 1C o 2C, mientras que aminas
con mayor número de átomos de C, dieron porcentajes de recuperación elevados, entre
150 y 200 %. Por tanto, para las aminas con más de 2 C, debido al efecto matriz, la
concentración en esta muestra debería calcularse utilizando el método de adición estándar
(MOSA) en lugar de la curva de calibrado de patrones.

REACCIÓN DEL TCPO
74
Tabla 25. Concentración de amina fortificada y concentración de amina fortificada
encontrada (µg/L) en muestras de agua reales.
Concentración fortificada (µg/L) Concentración encontrada (µg/L)
Muestra
MA EA BA PeA HA DEA MA EA BA PeA HA DEA
20 32 40 64 15 31 50 88
S1 80 80 128 106 97 136
S2 20 32 40 40 19 26 39 51
40 40 47 51
S3
40 64 80 80 128 52 72 80 88 133
100 160 200 200 200 320 90 120 178 194 186 360
100 200 200 200 112 222 189 202S4
200 200 218 211
20 32 17 39
S5
40 65 80 31 68 110
Se encontró y cuantificó Metilamina utilizando la curva de calibrado de patrones
en agua de lago (8.8±0.3 µg/l), agua de riego (7±3 µg/l) y agua residual (6000±700 µg/l),
en la que también se encontró Pentilamina (3100±200 µg/l). En agua de grifo, se encontró
y cuantificó Dietilamina utilizando la curva de calibrado de patrones (13±3, n=3) µg/l y
utilizando la curva de adición estándar (15 µg/L, n=5), siendo los resultados similares. En
agua de mar no se detectaron ninguna de las aminas estudiadas. Las muestras de agua
residual y de agua marina, se analizaron también utilizando el procedimiento
cromatográfico descrito en el Capítulo previo (Apéndice 1, [21]), utilizando dansilación
asistida en soporte sólido y detección fluorescente. Con este procedimiento, no se detectó
ninguna amina al analizar la muestra de agua marina, al igual que en el método propuesto,
y para la muestra de agua residual los resultados fueron (6040 ± 900 µg/L, n=3) y (2960 ±
160 µg/L, n=3) para metilamina y pentilamina respectivamente. Ambos valores pueden
considerarse estadísticamente iguales (con un nivel de confianza del 95%) a los obtenidos
por el método propuesto.
El cromatograma obtenido para el análisis de screening de la muestra de agua
residual (Figura 28) utilizando la Fase Móvil 1, indicó la presencia de metilamina y
putrescina y/o pentilamina; utilizando la Fase Móvil 2, se confirmó la presencia de
pentilamina y metilamina.
Los límites de detección obtenidos utilizando el procedimiento de screening
propuesto para las aminas alifáticas y biogénicas en el agua residual, calculado como 3
veces la señal del fondo dividido por la pendiente, fueron: 0.066, 0.053, 0.015, 0.2, 0.011,
0.0075, 0.027, 0.0076, 0.011 y 0.06 mg/L para MA, EA, BA, DEA, PeA, Put, Cad, HA,
Spd y Spm respectivamente.

75
0 4 8 12 16 20
Tiempo (min)
R 1
R
R 1
R
5 o 7
5
Fase M óvil 1
Fase M óvil 2
Figura 28. Cromatogramas correspondientes a una muestra de agua residual utilizando la
Fase Móvil 1 y la fase Móvil 2. R-Reactivo, 1-MA, 5-PeA y 7-Put.
Comparación con otros sistemas de detección
La detección quimioluminiscente permitió alcanzar los límites de detección más
bajos, como se observa en la Tabla 23. Para cada procedimiento se han considerado los
mejores volúmenes de muestra y de elución. Utilizando los derivados dansilados, los
límites de detección pueden mejorar desde 75 a 3 veces respecto a las medidas con
detección UV, y desde 10 a 2 veces respecto a las medidas en fluorescencia dependiendo
de la amina. Por otra parte, otros reactivos fluorescentes como FMOC y OPA/NAC,
dieron límites de detección más elevados que los que proporcionó la detección
quimioluminiscente.
Los valores de repetibilidad y reproducibilidad de la detección fluorescente y
quimioluminiscente utilizando derivados dansilados, fueron comparables. Para la
detección fluorescente, se obtuvieron %DER entre 4 y 14% (calculadas de 3 réplicas de 5
mL de mezcla de aminas a concentraciones de 1mg/L excepto DEA a 3 mg/L). Los
valores para la detección QL son los mostrados en la Tabla 24.
En el trabajo de dansilación de aminas con detección UV o fluorescente, se
requirió un paso de limpieza en el soporte sólido para eliminar el blanco reactivo. Este
paso producía una elución parcial de algunas aminas, especialmente de las más polares, lo
que se observó también al aplicar el procedimiento a muestras reales, requiriéndose la

REACCIÓN DEL TCPO
76
aplicación del MOSA para calcular las concentraciones en las muestras. Sin embargo, al
utilizar la detección quimioluminiscente, este paso de lavado no se incluyó en el
procedimiento, obteniéndose recuperaciones más elevadas para las aminas más polares,
con lo que no apareció efecto matriz. La única excepción fue la muestra de agua marina
que, para el análisis de aminas con más de dos átomos de C, requirió la aplicación del
MOSA.
Conclusiones
En esta parte de la Tesis, se estudió la detección quimioluminiscente de aminas
para mejorar sus límites de detección. Para ello, la dansilación se realizó en soporte sólido
como tratamiento precolumna. Los derivados dansilados se inyectaron en el sistema
cromatográfico y se mezclaron con TCPO/H2O2 para generar la quimioluminiscencia.
Se consiguió la cuantificación de las aminas alifáticas a niveles de ìg/L con
exactitud y reproducibilidad satisfactorias. Estos niveles de concentración son adecuados
para la monitorización de las aminas alifáticas en muestras de agua reales.
No hubo diferencias significativas en la cuantificación de los analitos entre los
diferentes tipos de muestra ensayados.
El método también se empleó con propósitos de screening en presencia de otras
aminas alifáticas como las poliaminas espermina, espermidina, putrescina y cadaverina.
Se optimizó un procedimiento de screening para separar las diez aminas.

77
2.1. DISMINUCIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DE AMONIO
EN AGUA E INCREMENTO DE LA EXACTITUD DE SU
DETERMINACIÓN.
El amonio es un micronutriente en los sistemas acuosos. Tiene un papel
fundamental en el ciclo del nitrógeno. Cuando se encuentra en concentraciones elevadas,
la cantidad de nutrientes aumenta en los sistemas acuosos aumentando la actividad
biológica, que lleva a un incremento del crecimiento de algas, turbidez, olor, mal sabor y
toxicidad. El amonio puede encontrarse en aguas superficiales, subterráneas o marinas a
bajas concentraciones, del orden de 10 µg/L. En aguas residuales, puede hallarse a
elevadas concentraciones, del orden de 30 mg/L debido a los procesos de amonificación y
de reducción de nitrato.
La legislación especifica las características del método de análisis que se utilice
para estimar su concentración. Su exactitud, precisión, y límite de detección han de ser el
10% del valor paramétrico [40].
Los métodos de referencia como la detección espectrofotométrica de amonio
utilizando el reactivo de Nessler, la reacción del indofenol o el electrodo selectivo de
amonio, se han utilizado ampliamente [41]. Además, en los últimos años se han
desarrollado nuevos métodos. En la Tabla 26, se resumen algunas de las características
analíticas como el límite de detección, el intervalo dinámico lineal y la técnica empleada,
para algunos de los métodos publicados en la bibliografía.
Los métodos de inyección en flujo han sido los más destacados en los últimos
años, normalmente combinados con sistemas como colectores de flujo [47], detectores de
fluorescencia con guía de ondas [49], sistemas quimioluminiscentes [50], detección
fluorimétrica basada en la complejación de amonio con o-ftaldialdehido y tioglicolato
[53], y detector de fila de diodos con el reactivo de Nessler [44]. También se han descrito
métodos que utilizan cromatografía iónica [46,48] y electrodos selectivos de amonio
[42,43,51,54].

REACCIÓN DEL TCPO
78
Tabla 26. Resumen de algunos procedimientos descritos en la bibliografía para la
determinación de amonio.
Ref. Técnica
LD
(µµg/L)
Intervalo
Lineal (mg/L)
[42]
Método de lavado para la determinación en flujo de
amonio con un electrodo iónico de gases.
- 0.1 – 10
[43]
Determinación NH4
+
en flujo. Detector electrodo de
gases.
3.85 3.857e-3 – 1.2857
[44]
Sistema FIA con 3 detectores: potenciométrico,
conductimétrico y fotométrico (DAP). Reactivo de
Nessler.
-
0.05 - 0.9
[45]
Sistema FIA con pre-concentración en resina de
intercambio catiónico. Basado en la reacción de
Nessler.
3 0.05 - 0.5
[46] Cromatografía iónica con detección fila de diodos. 18 0.36– 18
[47]
Sistema FIA con colector de flujo. Detección
fluorimétrica basada en la reacción OPA/sulfito/NH4
+
y pre-concentración
0.054 9e-5 - 0.135
[48] Cromatografía iónica. 12.8 0.05 – 5
[49]
Sistema FIA con detección fluorimétrica utilizando
una guía de ondas, basado en la reacción
OPA/sulfito/NH4
+
.
1.87 0.0107 - 0.0535
[50]
Sistema FIA quimioluminiscente basado en la
reacción del luminol.
7.2 0.0535 – 5.35
[51]
Biosensor iónico amperométrico basado en un
electrodo de carbono modificado.
107 0.107-1.3375
[52]
Sistema FIA con detección amperométrica indirecta
de los iones amonio. Electrodo modificado de
Clinoptilolito.
90 0.36-18
[53]
Sistema FIA con detección fluorimétrica. Basado en la
reacción OPA/tioglicolato.
2.675e-3 – 5.35
[54] Electrodo selectivo de amonio. 0.155 0.18-1.8
El estudio de la determinación de amonio se ha abordado en dos partes, con la
intención de aportar nuevos métodos que mejorasen la sensibilidad y selectividad de los
de referencia:
§ En la primera parte, se desarrolla un método fluorimétrico para la determinación de
amonio en muestras de agua basado en la formación de un isoindol. Además se hace
un estudio comparativo con los métodos de Nessler y Electrodo Selectivo de amonio,
que se revisan previamente a su utilización.
§ En la segunda parte, se propone un método para la determinación quimioluminiscente
de amonio en aguas por HPLC. El amonio se derivatiza en disolución con el reactivo
cloruro de dansilo, y posteriormente el derivado se separa mediante HPLC y se hace
confluir post-columna con TCPO y H2O2 generando la señal quimioluminiscente.

79
2.1.2.1. DETERMINACIÓN DE AMONIO EN MUESTRAS DE AGUA
UTILIZANDO EL REACTIVO OPA-NAC. ESTUDIO COMPARATIVO CON
LOS MÉTODOS DE NESSLER Y ELECTRODO SELECTIVO DE AMONIO.
En este capítulo, se propone un método basado en la derivatización de amonio
con el reactivo o-Ftaldialdehido (OPA) y N-Acetil-L-Cisteína (NAC) en condiciones
básicas. El derivado isoindólico formado se detectó fluorimétricamente a λexcitación = 415
nm y λemisión = 485 nm o λexcitación = 333 nm y λemisión = 462.5 nm.
Se establecieron las condiciones óptimas para obtener la máxima sensibilidad y
selectividad, y los resultados se compararon con los obtenidos utilizando el método del
reactivo de Nessler y el método del electrodo selectivo. Los tres métodos ensayados, se
examinaron quimiométricamente para evaluar la presencia o ausencia de errores
sistemáticos y mejorar sus incertidumbres al analizar muestras desconocidas. Se
compararon las ventajas y desventajas de cada uno de ellos en términos de sensibilidad,
selectividad, exactitud y precisión. Más información acerca de las condiciones
experimentales se refleja en el Apéndice 4 [55].
Método de OPA-NAC
Se observó una variación de la señal fluorescente del isoindol formado en la
reacción amonio/OPA/NAC con el tiempo de reacción, diferente en función de la
longitud de onda seleccionada. A λexc = 415 nm / λemisión = 485 nm, la señal aumentaba
con el tiempo, alcanzando un máximo a 5 minutos (óptimo seleccionado) (Figura 29 a);
por otra parte, a λexc = 333 nm / λem = 462.5 nm, la señal disminuía con el tiempo,
seleccionándose como óptimo 2 minutos (Figura 29 b). Los espectros de emisión
fluorescente para un blanco y un patrón de amonio, a λexc = 415 nm / λemisión = 485 nm (t
reacción 5 min) y λexc = 333 nm / λem = 462.5 nm (t reacción 2 minutos), se muestran en
la Figura 30 a) y b) respectivamente.
Se optimizaron las condiciones de la reacción de derivatización: concentraciones
del reactivo OPA/NAC y pH del Tampón Borato, utilizando un diseño factorial 32
(Tabla
27) a dos niveles de pH (10.6 (-) y 10.8 (+)), dos concentraciones de OPA (8.8 mM (-) y
15 mM (+)), y dos concentraciones de NAC (8.8 mM (-) y 60 mM (+)). Las condiciones
óptimas (máxima sensibilidad) seleccionadas fueron: 8.8 mM OPA:NAC (1:1) a pH 10.8.
En la Tabla 28 se dan los resultados en cuanto a la importancia e interacción entre los
factores estudiados siendo el valor Dreferencia = 14.88.

REACCIÓN DEL TCPO
80
Figura 29. Señal fluorescente frente al tiempo. a) λexc = 415 nm / λem = 485 nm; b) λexc = 333
nm / λem = 462.5 nm.
Figura 30. Espectros de emisión de fluorescencia. a) λexc = 415 nm / λem = 485 nm (t
reacción 5 min); b) λexc = 333 nm / λem = 462.5 nm (t reacción 2 min).
Tabla 27. Diseño factorial de optimización de las concentración de reactivos y pH.
pH OPA NAC
1 + - -
2 + + -
3 + + +
4 + - +
5 - - -
6 - + -
7 - + +
8 - - +
0
300
600
900
1200
1500
0 5 10 15
Tiempo (min)Fluorescencia
b)
NH4+
Blanco
0
300
600
900
1200
1500
0 5 10 15
Tiempo (min)
Fluorescencia
a)
Blanco
NH4+
0
500
1000
1500
2000
2500
420 470 520 570
λλ emisión (nm)
Fluorescencia
a)
Blanco
1.4 mg/L NH4+
0
500
1000
1500
2000
2500
380 480 580
λλ emisión (nm)
Fluorescencia
b)
Blanco
1.4 mg/L NH4+

81
Tabla 28. Importancia e interacción entre los factores: pH, [OPA] y [NAC].
Factor o
interacción
Valor D Conclusión
PH 32.82 DpH > Dreferencia
OPA 58.65 DOPA > Dreferencia
NAC 976.50 DNAC > Dreferencia
Importancia de los factores:
[NAC] > [OPA] > pH
PH/OPA 11.26 DpH/OPA < Dreferencia No hay interacción
PH/NAC 32.17 DpH/NAC > Dreferencia
OPA/NAC 58.34 DOPA/NAC > Dreferencia
Dos interacciones importantes:
OPA/NAC > pH/NAC
Las curvas de calibrado de amonio a las diferentes λexc y diferentes tiempos de
reacción, y otros parámetros analíticos como límites de detección, límites de
cuantificación y desviación estándar del procedimiento, se muestran en la Tabla 29.
Como la reactividad del OPA-NAC con aminas primarias es bien conocida, se
estudió su interferencia en la determinación de amonio a las dos longitudes de onda de
excitación. A λexc = 415 nm, MA, EA, IPA y β-FEA no dieron ninguna señal fluorescente
significativa, incluso a concentraciones del orden de 15 y 30 mg/l. La curva de calibrado
de amonio en presencia de 1 mg/L de MA (Tabla 29) corrobora este hecho, manteniendo
tanto la pendiente como la ordenada igual a la curva de calibrado de patrones sin MA. Por
otra parte, en la Tabla 29 se observa que a λexc = 333 nm, la pendiente de la curva de
calibrado en presencia de MA, fue similar a la obtenida con patrones sin MA; no así
ocurrió para la ordenada, lo que indica que a esta λexc, la metilamina está contribuyendo a
la señal obtenida.
Tabla 29. Curvas de calibrado de amonio y parámetros analíticos utilizando el reactivo
OPA-NAC.
Condiciones
t
(min)
a ±± sa
b ±± sb
(n, r
2
, sy/x)
DL
(mg/L)
QL
(mg/L)
SDP
(sy/x/b)
OPA/NAC 8.8mM
(1:1), λexc = 415 nm
5 48 ± 11
759 ± 7
(10, 0.9983, 17)
0.07 0.2 0.02
OPA/NAC 8.8mM
(1:1), λexc = 333 nm
5 610 ± 30
360 ± 40
(6, 0.943, 60)
0.5 1.6 0.16
OPA/NAC 8.8mM
(1:1), λexc = 333 nm
2 450 ± 50
1380 ± 70
(6, 0.9899, 90)
0.19 0.6 0.06
* OPA/NAC 8.8mM
(1:1), λexc = 415 nm
5 60 ± 11
737 ± 16
(5, 0.9985, 18)
0.07 0.2 0.02
* OPA/NAC 8.8mM
(1:1), λexc = 333 nm
2 1380 ± 110
1380 ± 160
(5, 0.962, 180)
- - 0.13
* Calibrado de amonio en presencia de 1 mg/l de MA.

REACCIÓN DEL TCPO
82
Estudios de confirmación: Método de OPA-NAC, Nessler y Electrodo Selectivo.
Revisión del Método de Nessler
En primer lugar, se estudió la influencia de la preparación del reactivo Nessler
(en exceso de HgCl2 (NR1) o con la cantidad justa hasta la aparición del precipitado rojo
(NR2)). Los resultados obtenidos fueron similares requiriéndose únicamente en el caso
del NR2 la adición de 100 µl de NaOH 6N. Se varió el volumen de reactivo Nessler
utilizado para la reacción entre 50-300 µl (en 2.5 ml), seleccionándose como óptimo 100
µl. Como agente complejante de interferentes, se estudió la adición de EDTA o de
Tartrato sódico-potásico, pero el EDTA impidió la reacción, por lo que se seleccionó
tartrato de concentración 0.708 mM. Para eliminar el precipitado que se formaba a
elevadas concentraciones de amonio (superiores a 2.5 mg/l) se utilizó PVA y Triton X-
100, pero ninguno de ellos consiguió eliminarlo.
En la Tabla 30 se muestran las curvas de calibrado de amonio y otros parámetros
analíticos a diferentes tiempos de reacción y en diferentes condiciones experimentales.
Puede observarse que las pendientes, los límites de detección y cuantificación y la
desviación estándar del procedimiento son similares en todas las condiciones estudiadas.
Tabla 30. Curvas de calibrado de amonio y parámetros analíticos utilizando el Método de
Nessler.
Condiciones
t
(s)
( b ±± sb ) ( a ±± sa ) sy/x , r2
, n
LD
mg/L
LC
mg/L
DEP
sy/x/b
100 µl NR1, Sin
tartrato
600 (0.126 ± 0.003) (0.041 ± 0.006) 0.013, 0.997, 9 0.3 1.1 0.11
0 (0.123 ± 0.003) (0.044 ± 0.008) 0.014, 0.997, 8 0.4 1.2 0.12
210 (0.123 ± 0.003) (0.049 ± 0.008) 0.015, 0.997, 8 0.4 1.2 0.12
390 (0.123 ± 0.003) (0.052 ± 0.007) 0.014, 0.997, 8 0.3 1.1 0.11
100 µl NR1,
0.0708 M tartrato
600 (0.123 ± 0.003) (0.054 ± 0.007) 0.013, 0.997, 8 0.3 1.1 0.11
0 0.130 ± 0.007 0.096 ± 0.009 0.014, 0.992, 5 0.3 1.1 0.11100 µl NR1, 0.708
mM tartrato. H2O
nanopura tratada
120 0.125 ± 0.006 0.105 ± 0.008 0.012, 0.994, 5 0.3 1.0 0.10
50 µl NR1,
0.708 mM tartrato
600 (0.1018 ±
0.0011)
(0.0266 ±
0.0017)
0.003, 0.999, 4 0.08 0.3 0.03
0 (0.125 ± 0.003) (0.010 ± 0.009) 0.014, 0.998, 5 0.3 1.2 0.12
210 (0.131 ± 0.006) (0.018 ± 0.015) 0.02, 0.995, 5 0.6 1.8 0.18
390 (0.132 ± 0.006) (0.018 ± 0.015) 0.02, 0.994, 5 0.6 1.9 0.19
100 µl NR2,
100 µl NaOH,
0.708 mM tartrato
600 (0.132 ± 0.06) (0.018 ± 0.015) 0.02, 0.994, 5 0.6 1.9 0.19
0 0.1196 ± 0.0017 0.011 ± 0.005 0.007, 0.999, 5 0.18 0.6 0.06
210 0.125 ± 0.005 0.020 ± 0.012 0.019, 0.996, 5 0.5 1.5 0.15
390 0.126 ± 0.005 0.022 ± 0.013 0.02, 0.996, 5 0.5 1.6 0.16
100 µl NR2, 100 µl
NaOH, 0.708 mM
tartrato, H2O
nanopura tratada.
600 0.127 ± 0.005 0.023 ± 0.013 0.02, 0.996, 5 0.5 1.6 0.16
0 (0.111 ± 0.007) (0.062 ± 0.019) 0.03, 0.988, 5 0.8 2.7 0.27
210 (0.117 ±0.004) (0.089 ± 0.011) 0.017, 0.996, 5 0.4 1.5 0.15
390 (0.116 ± 0.004) (0.098 ± 0.011) 0.019, 0.996, 5 0.5 1.6 0.16
100 µl NR2,
100 µl NaOH,
0.708 mM tartrato,
100 µl PVA 600 (0.115 ± 0.005) (0.103 ± 0.013) 0.02, 0.995, 5 0.5 1.8 0.18

83
Revisión del Método de Electrodo Selectivo
Las curvas de calibrado de amonio, E(mV) frente a Log ( +
4NH
C ), dieron una
respuesta lineal como la que se muestra en la Figura 31-1. Las respuesta de las aminas
utilizando este método fue polinómica, y diferente para cada amina (Figura 32 a).
Además la respuesta de las aminas en presencia de amonio, fue diferente a la obtenida sin
amonio (Figura 32 b). Por otra parte, la linealidad de la curva de calibrado de amonio se
perdió en presencia de una concentración fija de amina ajustándose los datos a una
función polinómica, como puede verse en la Figura 31-2.
Se concluyó que el método del electrodo selectivo de amonio, presentaba error
sistemático en presencia de aminas.
Figura 32. Curvas de calibrado de: a) Aminas. b) Aminas en presencia de 1 mg/l de amonio.
(♦ metilamina, etilamina, isopropilamina, ×× β-feniletilamina)
Figura 31. Curvas de calibrado
de: 1-Amonio. 2-Amonio en
presencia de MA (1 mg/l).
-140
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
-1.5 -0.5 0.5 1.5 2.5
LOG(NH4+)
E(mV)
1
2
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
C amina (mg/L)
E(mV)
a)
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
0 5 10 15 20
C amina (mg/L)
E(mV)
En presencia de 1 mg/L NH4+
b)

REACCIÓN DEL TCPO
84
Aplicación del Método de Nessler
Mediante un test t (á = 0.05) se comprobó que el tratamiento de decloración y
precipitación de los cationes de las muestras, no afectaba a los resultados, siendo la
pendiente de la curva realizada con patrones tratados, similar a la pendiente de la curva de
patrones sin tratamiento (ver en Tabla 30).
Para evaluar la presencia o ausencia de errores sistemáticos, se aplicaron el
MOSA y el Youden a tres muestras de agua. Al aplicar el MOSA, las pendientes fueron
en todos los casos estadísticamente diferentes a la pendiente de la curva de calibrado de
patrones. Para las tres muestras, las pendientes variaban en función del volumen de
muestra estudiado y del tratamiento aplicado. Este comportamiento se refleja en la
Figura 33.
Figura 33. Pendientes de las curvas de calibrado al aplicar el Método de Nessler en las
diferentes condiciones estudiadas. (♦) Agua de riego (S1) ( ) Agua residual (S2) ( ) Agua
de fuente (S3). Condiciones: NR1 o NR2 (Reactivo de Nessler 1 o 2); T: Muestra Tratada;
NT: Muestra no tratada; TNC: Muestra tratada sin declorar; V: Volumen de muestra (mL);
Volumen total= 2.5 mL.
El estudio del error sistemático constante mediante el método de Youden [56],
dio una ordenada en el origen diferente de cero para la muestra de agua residual (S2)
desde t = 210 s a t = 390 s, por lo que el valor del TYB (Blanco Total de Youden) se tuvo
en cuenta al calcular la concentración de amonio en la muestra. La Figura 34, muestra
este resultado.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
NT,V=2.4
TNC,V=2.4
T,V=2.4
T,V=2.4
T,V=1.5
T,V=1.5
T,V=0.05
NT,V=0.05
T,V=0.1
T,V=0.1
T,V=0.2
T,V=2.2
Condiciones
(b±sb)
NR1 NR2
Valor de
Referencia

85
Figura 34. Gráfico de Youden a diferentes tiempos para la muestra de agua residual.
De estos estudios, se concluyó que al utilizar el Método del Reactivo Nessler para
calcular la concentración de amonio en muestras de agua reales, habría de aplicarse el
Método de Adición Estándar (MOSA) teniendo en cuenta el valor del TYB cuando fuese
necesario, o aplicar el GHPSAM [57], que permite determinar la concentración del
analito en muestras desconocidas eliminando ambos errores sistemáticos a la vez.
Las concentraciones de amonio encontradas en las tres muestras estudiadas
utilizando este método aplicando el MOSA o el GHPSAM, se muestran en la Tabla 31.
Estas concentraciones responden a las concentraciones habituales de amonio en estos
tipos de muestras.
Aplicación del Método de Electrodo Selectivo
En la bibliografía [58] se recomendaba aplicar el método de adición estándar si la
muestra presentaba cantidades muy bajas de amonio, por lo que se aplicó el MOSA a la
muestra de agua de riego. La pendiente del MOSA (b ± sb) = (-56.3 ± 0.5), resultó
estadísticamente igual a la pendiente de la curva de calibrado con patrones (b ± sb) = (-6.6
± 1.2). El cálculo de la concentración de amonio en las muestras, se realizó por medida
directa de la señal e interpolación en la curva de calibrado de patrones. Los resultados se
muestran en la Tabla 31.
-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Volumen de muestra (ml)
Absorbancia
t=0s
t=390s
t=300s
t=210s
t=90s

REACCIÓN DEL TCPO
86
Tabla 31. Concentración de amonio hallada en muestras reales utilizando los diferentes
métodos estudiados.
Muestra Método Por
Tiempo
(s)
Conc
(mg/l)
(C ±± s)
Medida directa - 0.0901
Electrodo
Selectivo
(0.089 ± 0.002)
MOSA 210 0.1545
MOSA 300 0.1725
MOSA 390 0.1721
(0.166 ± 0.010)
GHPSAM 210 0.1733
GHPSAM 300 0.2253
Nessler
GHPSAM 390 0.1733
(0.19 ± 0.03)
MOSA (λexc = 415nm) 300 0.1984
S1
OPA-NAC
MOSA (λexc = 333nm) 120 0.1688
(0.18 ± 0.02)
Electrodo
Selectivo
(16.8 ± 1.0)
MOSA 210 17.3592
MOSA 300 18.1065
MOSA 390 18.5709
(18.0 ± 0.6)
GHPSAM 210 16.75
GHPSAM 300 -
Nessler
GHPSAM 390 17.5
(17.1 ± 0.5)
MOSA (λexc = 415nm) 300 14.2195
S2
OPA-NAC
MOSA (λexc = 415nm) 300 13.9740
(14.10 ± 0.17)
Electrodo
Selectivo
(0.45 ± 0.02)
MOSA 210 0.3014
MOSA 300 0.3379Nessler
MOSA 390 0.3297
(0.323 ± 0.019)
MOSA (λexc = 415nm) 300 0.3842
S3
OPA-NAC
MOSA (λexc = 333nm) 120 0.3523
(0.37 ± 0.02)
Aplicación del Método de OPA-NAC
La aplicación de Método de Youden dio ordenada en el origen estadísticamente
igual a cero a λexc = 415 nm para las tres muestras, mientras que a λexc = 333 nm, la
muestra de agua residual presentó error sistemático constante.

87
Las curvas de calibrado obtenidas al aplicar el MOSA (Tabla 32), mostraron que
a λexc = 415 nm, ninguna de las tres muestras presentaba error sistemático proporcional,
por lo que la concentración podía deducirse a partir de la curva de calibrado de patrones.
Por otra parte, a λexc = 333 nm las muestras S1 y S3 estaban libres de errores sistemáticos
proporcionales, pero la muestra de agua residual presentó efecto matriz. Por tanto, para
calcular la concentración de la muestra 2, habría que utilizar los datos a λexc = 415 nm.
Las concentraciones de amonio halladas en las muestras, se reflejan en la Tabla 31.
Tabla 32. Curvas de adición estándar para muestras reales utilizando el Método OPA-NAC.
Muestra
λλex (nm) a ±± sa b ±± sb (n, r
2
, sy/x)
S1 415 103 ± 17 710 ± 20 (6, 0.9958, 30)
S1 333 550 ± 50 1380 ± 70 (6, 0.99, 90)
S2 415 466 ± 4 688 ± 5 (6, 0.9997, 7)
S2 333 3999 ± 16 480 ± 20 (5, 0.9943, 30)
S3 415 62 ±12 803 ± 17 (6, 0.9983, 20)
S3 333 540 ± 40 1440 ± 60 (6, 0.9932, 80)
Comparación de resultados
Los resultados de la Tabla 31, se compararon mediante un test t de muestras
relacionadas, obteniéndose siempre valores de tcalc < ttab siendo los valores de á
superiores a 0.05 : 0.213, 0.190, 0.113 para las comparaciones OPA-NAC frente a
Electrodo Selectivo, OPA-NAC frente a Nessler y Electrodo Selectivo frente a Nessler,
respectivamente. Con estos valores, se concluyó que los resultados eran similares en los
tres métodos estudiados.
En la Tabla 33 se reflejan las principales propiedades de los tres métodos. Se
observa que los límites de detección y cuantificación que se obtuvieron al utilizar el
Método OPA-NAC fueron inferiores a los obtenidos con los métodos de Nessler o
Electrodo selectivo. El intervalo dinámico de concentraciones para el Método OPA-NAC
abarca concentraciones más bajas. Los estudios de precisión dieron valores de desviación
estándar relativa (DER%) similares para los tres métodos: 15-3 %, 16-5% y 18-1% para
el Nessler, electrodo selectivo y OPA-NAC respectivamente.
El Método de Nessler presentó la desventaja de la aparición de un precipitado
cuando se trabajó con muestras reales, y además se detectaron errores sistemáticos
constantes y proporcionales, que requerían la aplicación del MOSA y el Youden, o bien
la aplicación del GHPSAM, para el cálculo de la concentración de amonio en las
muestras. Por su parte, el Método del Electrodo Selectivo, permitió determinar el amonio
por medida directa de la muestra, aunque presentaba la desventaja de la interferencia de
aminas con señal no aditiva. Por último, el Método OPA-NAC, no presentó efecto matriz,

REACCIÓN DEL TCPO
88
pudiéndose calcular la concentración de amonio a partir de la curva de calibrado de
patrones. Este método resultó además selectivo a ëexc = 415 nm.
Tabla 33. Propiedades analíticas de los tres métodos estudiados.
MétodosPropiedades
analíticas Nessler Electrodo Selectivo OPA/NAC
Intervalo
dinámico
0.85-5 mg/L 5 -100 mg/L 0.2 -1.4 mg/L
Límite de Detección 0.6 mg/L 1.6 mg/L 0.07 mg/L
Reproducibilidad ** ** **
Selectividad Método selectivo Interferencia de aminas Método selectivo
Coste ** * **
Rapidez 4 muestras/hora 7 muestras/hora 7 muestras/hora
En los tres métodos las señales analíticas variaron en función del tiempo. En el
Método de Nessler, la señal se midió a los 10 minutos para asegurar una señal estable. En
el método del electrodo selectivo, la señal se midió cuando el valor del potencial
permanecía estable durante 1 minuto. En el método de OPA-NAC, el tiempo de reacción
fueron 5 minutos.
Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, se concluyó que el método de
OPA-NAC podía utilizarse para la determinación de amonio aportando rapidez,
selectividad y sensibilidad. El límite de detección alcanzado está por debajo del requerido
por el Official Journal of European Communities para establecer la calidad del agua de
consumo humano.
Conclusiones
En este trabajo, se propuso el uso de la mezcla OPA-NAC como reactivo
derivatizante para el amonio. El isoindol fluorescente formado se detectó selectivamente
en presencia de aminas excitando a 415 nm. El procedimiento optimizado se comparó con
el método de Nessler y el método de Electrodo Selectivo, que fueron revisados
previamente a su utilización.
La aplicación del método de Nessler a muestras reales presentó algunos
problemas como la formación de precipitado y el efecto matriz. Para calcular la
concentración de amonio, se requirió la aplicación del MOSA o del GHPSAM. Por su
parte, la aplicación del método del Electrodo Selectivo a muestras reales presentó el
problema de la interferencia de aminas con señal no aditiva.
Sin embargo, al utilizar el método de OPA-NAC, la concentración de amonio se
podía calcular a partir de la curva de calibrado de patrones, aporta mejores límites de
detección y presenta una velocidad de muestreo similar a la del electrodo selectivo.

89
2.1.2.2. DETERMINACIÓN QUIMIOLUMINISCENTE DE AMONIO EN AGUAS
POR HPLC.
Los métodos de referencia para la determinación de amonio, Nessler, el indofenol
y electrodo selectivo, presentan problemas de selectividad [55,59-61]. En la bibliografía
se han descrito algunos procedimientos para mejorarla. En estos trabajos, se ha utilizado
una resina de intercambio aniónico ligeramente básica [62] o bien una columna de
intercambio catiónico de alta capacidad [63], para separar el amonio de otros cationes
inorgánicos y/o aminas alifáticas que pueden presentar las muestras de agua.
Existen también métodos para medir amonio basados en las reacciones de
derivatización con o-ftaldialdehido (OPA), como el reactivo OPA-sulfito [59] o más
recientemente el OPA-tioglicolato [64] y el OPA-NAC (descrito en el capítulo
precedente, Apéndice 4 [55]) por formación de derivados fluorescentes, que si bien
presentan mejores prestaciones que los anteriores, pueden conducir a errores sistemáticos
en algunas ocasiones, ya que la fluorescencia del fondo debida a compuestos orgánicos
naturales no suele ser insignificante en aguas naturales [59].
También se han desarrollado procedimientos quimioluminiscentes para la
determinación de amonio [65-66] debido a su elevada sensibilidad, rapidez, simplicidad y
viabilidad. El reactivo utilizado normalmente es el luminol combinado con el hipoclorito,
en sistemas de inyección en flujo, pero no ha sido descrita su aplicación a HPLC para
mejorar su selectividad.
Aunque la reacción entre los compuestos de nitrógeno y el cloruro de dansilo
(DnsCl) es bastante conocida, no se ha aplicado a la determinación cuantitativa de iones
amonio con sistema de detección fluorimétrico o con generación quimioluminiscente
post-columna (con reactivos como Bis-(2,4,6-triclorofenil)oxalato, TCPO). Sin embargo,
la reacción de dansilación se ha estudiado ampliamente para la determinación de analitos
como aminas biogénicas en plantas [67], aminas de bajo peso molecular en muestras de
agua como se ha descrito en capítulos precedentes [68,21,36], fenoles en aguas
superficiales [69], residuos de pesticidas del tipo fenoxil N-metilcarbamato en zumos de
frutas [70] y anfetaminas en muestras de orina [71,18].
Basándonos en la experiencia de nuestro grupo de investigación en la
derivatización de aminas con Cloruro de Dansilo y TCPO [36,71,18], se desarrolla en este
trabajo un método quimioluminiscente rápido, sensible y selectivo para el screening y
cuantificación de amonio en muestras de agua de baja concentración de amonio (<0.5
mg/l), pero también aplicable a muestras de concentración más elevada.
El método se basa en la derivatización directa de amonio en la muestra (sin
ningún tratamiento previo) con el reactivo cloruro de dansilo, seguido de HPLC para
separar la señal analítica del amonio de la respuesta de otros compuestos de nitrógeno.
Después de la separación en una columna analítica C18, los derivados se mezclaron con
el TCPO/H2O2 y se registró la señal quimioluminiscente.

REACCIÓN DEL TCPO
90
Se estudió la interferencia de los derivados de aminas en la señal del derivado de
amonio, y también se propuso un procedimiento para el screening de aminas alifáticas y
amonio en muestras de agua de diferente naturaleza. Además, el método se aplicó a varias
muestras después de aplicar el tratamiento Kjeldahl, para obtener valores de Nitrógeno
Kjeldahl Total.
Más información acerca de las condiciones experimentales se puede encontrar en
el Apéndice 5.
Optimización de la dansilación precolumna del amonio
La dansilación convencional de aminas se basa en la reacción directa con cloruro
de dansilo en presencia de una concentración elevada de bicarbonato, y algunos autores
recomiendan que la reacción transcurra durante toda la noche (12 horas a temperatura
ambiente). En este trabajo, el amonio se derivatizó de acuerdo con las condiciones
establecidas por Marcé y col. para poliaminas [67], con algunas modificaciones
introducidas para hacer más rápido el procedimiento. Para establecer las condiciones
óptimas, los derivados dansilados se inyectaron en el sistema cromatográfico, y la
reacción quimioluminiscente post-columna se llevó a cabo siguiendo el procedimiento
descrito por nuestro grupo de investigación para aminas alifáticas previamente
desarrollado [36] (ver el montaje utilizado en la Figura 15, Pág. 39 del Capítulo 1-
Introducción). El derivado dansilado de amonio eluyó a un tiempo de retención de 2.4
minutos (Figura 35).
El cromatograma del blanco presentó un pico al mismo tiempo de retención que
el pico del amonio. Este pico aparecía en mayor o menor medida en función de la
cantidad de disolvente empleado (Acetonitrilo 1, Scharlau) en la disolución del reactivo.
Se intentó separar este pico del pico del derivado de amonio, mediante la utilización de
diferentes gradientes de elución y también utilizando una precolumna con diferentes tipos
de relleno (CN, C18, SCX, o SAX) insertada mediante una válvula de conmutación, pero
en ningún caso se obtuvo separación, lo que indicaba que el pico se debía a una
contaminación de amonio en el disolvente empleado.
Por ello, se ensayaron diferentes disolventes: acetona, acetonitrilo 2 (J.T.Baker),
tetrahidrofurano y metanol. La mezcla del reactivo contenía 0.9 mL de disolvente (0.72
mL más 0.18 mL de disolución de reactivo DnsCl 5 mM), 0.2 mL de tampón carbonato
0.1 M de pH 9 y 1 mL de agua nanopura o patrón de amonio.
Aunque con disolventes como tetrahidrofurano (THF) o metanol, no apareció
pico de blanco, ninguno de ellos fue apropiado. El metanol disminuyó mucho la
eficiencia de la reacción post-columna, y el THF impidió la reacción de dansilación al
encontrarse el reactivo DnsCl y el NH4
+
en dos fases diferentes. La acetona presentó el
mismo comportamiento que el acetonitrilo 1, siendo apropiada para llevar a cabo ambas
reacciones (pre- y post- columna), pero presentaba un pico de blanco significativo. Al

91
utilizar Acetonitrilo 2 (J.T.Baker), el pico del blanco no fue significativo, siendo la
eficiencia de la reacción del amonio muy buena (Figura 35). Con estos resultados, se
seleccionó Acetonitrilo 2 (J.T.Baker) para los siguientes experimentos.
Figura 35. Cromatogramas del blanco y patrón de amonio de 0.187 mg/L en las condiciones
óptimas de derivatización.
Se ensayaron diferentes volúmenes de disolvente para seleccionar el mínimo
necesario para llevar a cabo la reacción de derivatización sin perder la respuesta del
amonio. En la Figura 36 se muestra la influencia del volumen de disolvente en la señal
del blanco. Se seleccionaron 0.4 mL de acetonitrilo como volumen óptimo por
proporcionar la menor señal del blanco sin pérdidas en la respuesta del amonio.
La concentración del reactivo DnsCl en la mezcla de reacción, se estudió en el
intervalo 0.15-0.75 mM, manteniendo constante el volumen de acetonitrilo en 0.4 mL. Se
escogió como concentración de reactivo óptima 0.3 mM, pues proporcionaba la menor
señal del blanco (ver Figura 36) sin que hubiera pérdidas en la respuesta del amonio.
0 1 2 3 4
Tiempo (min)
NH4+
Blanco
Patrón

REACCIÓN DEL TCPO
92
Figura 36. Altura de pico del Blanco frente a Volumen de Acetonitrilo (Concentración de
DnsCl fija 0.45 mM) o frente a concentración de DnsCl (Volumen de acetonitrilo fijo 0.4 mL).
De acuerdo con estos resultados, las condiciones óptimas seleccionadas fueron las
que se muestran en la Tabla 34: 0.4 mL de cloruro de dansilo 1.5 mM disuelto en
Acetonitrilo (J.T.Baker), 0.05 mL de tampón carbonato 0.2 M pH 9 y 1.55 mL de patrón
de amonio/muestra. En esta Tabla, se comparan las condiciones establecidas por Marcé y
col. [67] con las optimizadas en este trabajo. Como puede verse, se simplificó el
procedimiento original para hacerlo más rápido.
Tabla 34. Comparación del procedimiento de derivatización en disolución establecido por
Marcé y col.[67] y el procedimiento de derivatización en disolución optimizado.
Procedimiento de Marcé y colaboradores Procedimiento optimizado en este trabajo
200 ìL muestra/patrón + 40 ìL patrón
interno + 200 ìL de carbonato sódico
saturado + 400 ìL DnsCl 5 mg/ml en acetona
1.55 mL muestra/patrón + 50 ìL de tampón
carbonato 0.2 M pH 9 + 400 ìL DnsCl 1.5 mM
en acetonitrilo
Incubar en la oscuridad toda la noche a Tª
ambiente o calentar 10 min a 70 ºC
Calentar 10 minutos a 70ºC
Añadir 100 ìL de Prolina de 100 mg/ml e
incubar en la oscuridad 30 minutos
Inyectar 20 ìL en el sistema cromatográfico
Extraer los derivados dansilados en 500 ìL
de tolueno y mezclar 30 segundos
Separar 400 ìL de la fase orgánica, secar y
redisolver en 800 ìL de acetonitrilo
Pasar a través de un filtro de tamaño de poro
0.45 ìm
Inyectar 20 ìL en el sistema cromatográfico
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
Volumen de Acetonitrilo (mL) o
Concentración de DnsCl (mM)
AlturadePicodelBlanco(V)
Volumen de acetonitrilo Variable
Concentración de DnsCl Variable
Condiciones óptimas0.18 mL
0.4 mL
0.65 mL
0.9 mL
0.15 mM 0.3 mM
0.75 mM
0.45 mM

93
En la Tabla 35 se muestra la curva de calibrado obtenida en las condiciones
óptimas de derivatización. Se obtuvo buena linealidad en el intervalo 0.027-0.75 mg/L de
amonio, y el límite de detección establecido como la concentración requerida para
generar una relación (S/N)=3 fue de 8 µg/L. El cromatograma correspondiente al límite
de detección aparece en la Figura 37-2. El límite de detección alcanzado por el método
está muy alejado del límite establecido por la legislación (0.5 mg/L de amonio para
muestras de agua no digeridas, y 2 mg/L par muestras de agua tratadas mediante el
método de Kjeldahl).
En la Tabla 35, también se muestran las curvas de calibrado obtenidas utilizando
una concentración de reactivo menor (0.15 mM) y utilizando la concentración óptima de
reactivo en presencia de diferentes salinidades. Al utilizar concentración de DnsCl 0.15
mM, la sensibilidad fue el 13% de la obtenida en las condiciones de concentración de
reactivo óptimas. Los valores de la pendiente obtenidos en diferentes salinidades fueron
estadísticamente similares a los obtenidos en ausencia de NaCl a un nivel de probabilidad
del 95%. Por tanto, el método no estaba influenciado por la salinidad.
Tabla 35. Ecuaciones de las curvas de calibrado (Altura de Pico(Voltios) frente a
Concentración de NH4
+
(mg/L)) obtenidas en diferentes condiciones.
Condición DnsCl NaCl
Curva de Calibrado
Y = (a ±± sa) + (b ±± sb)· C
(n, r
2
, sy/x)
LD
(µg/L)
Intervalo
Lineal
(mg/L)
1 0.15 mM
Y = (12 ± 6) + (130 ± 10)· C
(5, 0.9814,9)
60 0.28-1
2 0.3 mM
Y = (2 ± 7) + (960 ± 30)· C
(10, 0.9935, 16)
Y* = (3 ± 90) + (12300 ± 400)· C
(10, 0.9929, 205)
8 0.027-0.75
3 0.3 mM 3.5 g/l
Y = (14± 5) + (930 ± 30)· C
(3, 0.9998, 3)
8 0.027-0.75
4 0.3 mM 35 g/l
Y =(19 ± 14) + (980 ± 70)· C
(3, 0.9942, 16)
8 0.027-0.75
*Area de Pico(Voltios) frente a Concentración de NH4
+
(mg/L).
En la Tabla 36 se muestran los estudios de precisión y exactitud del método a
diferentes niveles de concentración. La reproducibilidad y repetibilidad del método
fueron buenas independientemente de la concentración ensayada, obteniéndose valores de
porcentaje de desviación estándar relativa (%DER) entre 2.6-7.2 % y 4-8.6 %
respectivamente. La exactitud del método se evaluó analizando varios patrones de
concentración conocida, y como puede verse en la Tabla 36, resultó satisfactoria,
proporcionando errores relativos (%Er) entre 5-9.8%. Incluso a niveles de concentración
de amonio muy bajos (0.028 mg/L), la exactitud del método fue buena con un error
relativo del 6%.

REACCIÓN DEL TCPO
94
Tabla 36. Estudios de precisión (%DER) y exactitud (%Er) proporcionados por el método a
diferentes niveles de concentración de amonio (n, número de réplicas).
Reproducibilidad Repetibilidad Exactitud
NH4
+
(mg/L) %DER (n) NH4
+
(mg/L) %DER (n) NH4
+
(mg/L) %Er (n)
0.11 6.2 (5) 0.028 5.8 (4)
0.15 7.2 (4)
0.165 8.6 (5) 0.055 5 (4)
0.2 4.0 (3) 0.165 5.9 (3)
0.3 2.6 (4)
0.5 8.4 (3) 0.193 9.8 (3)
Para evaluar la selectividad del método y conociendo la reactividad del Cloruro
de Dansilo con compuestos de nitrógeno, se estudió la posible interferencia de las aminas
en la señal de amonio. En los sistemas acuosos, las aminas se suelen encontrar a niveles
de ìg/L, y muy raras veces a niveles de mg/L. La Figura 37-3 muestra el cromatograma
obtenido para una mezcla de amonio y aminas (MA, EA, DMA, N-PrA, BA, DEA, PeA y
HA), y como ha sido demostrado en capítulos anteriores, no se observó solapamiento
entre los picos.
Figura 37. Cromatogramas correspondientes a: 1. Blanco. 2. Patrón de amonio de 8µg/L
(LD). 3. Mezcla de varias aminas contaminadas de amonio: MA 0.1 mg/L, EA 0.2 mg/L, N-
PrA 0.3 mg/L, DMA 0.3 mg/L, BA 0.3 mg/L, DEA 0.5 mg/L, PeA 0.3 mg/L y HA 0.3 mg/L.
Se fortificó un patrón de amonio con 0.1 mg/L de MA, DMA, DEA y PeA, (que
son las aminas que hasta el momento habíamos encontrado en muestras de agua) para
estudiar la posibilidad de consumo del reactivo por parte de las aminas, y el porcentaje de
0 2 4 6 8 10
Tiempo (min)
NH4+
R
MA
EA
N-PRA + DMA
BA
DEA PEA
HA
R
1
2
3
LD NH4+

95
recuperación de la señal del amonio fue del 89.3%, por lo que se consideró que no
afectaba su presencia a la determinación de amonio aún encontrándose a niveles
superiores a los que estas se presentan en aguas.
Se analizaron 10 muestras de agua reales, y en varias de ellas se encontró amonio.
A modo de ejemplo, en la Figura 38, se muestran los cromatogramas por triplicado
obtenidos para la muestras de agua residual (dilución 1:130) (A) y de lago (dilución
1:8.25) (B). Ambas presentaban amonio en diferentes concentraciones.
Figura 38. Cromatogramas de las muestras de agua (3 réplicas). A) Agua residual.
B) Agua de lago.
Para validar la exactitud del método se fortificaron las muestras con
concentraciones de amonio conocidas. Al aplicar el MOSA, las muestras de agua
natural(S1), de grifo (S2), de fuente (S3), de riego 2 (S5), de lago(S6) y residual (S10),
presentaron pendientes similares a las de la curva de calibrado con patrones (ver Tabla
35) a un nivel de confianza del 95% como lo demostró el test t [72] dado en la Tabla 37,
por lo que no había efecto matriz y la concentración de amonio en las muestras podía
calcularse a partir de la curva de calibrado de patrones con resultados exactos. Para la
muestra S4 (agua de riego 1) la pendiente de la curva de calibrado del MOSA fue similar
a la de la curva de calibrado de patrones a un nivel de confianza del 98%. Para las
muestras de agua marina, solo S7 dio pendientes similares a un nivel de confianza del
99%, mientras que S8 y S9 presentaron efecto matriz como puede verse en la Tabla 37.
En presencia de efecto matriz, la concentración de amonio debe calcularse aplicando el
0 1 2 3 4
Tiempo (min)
NH4+
NH4+
A)
B)

REACCIÓN DEL TCPO
96
MOSA. Las ecuaciones del MOSA (ordenada: a (sa), pendiente: b (sb), r2
, n, syx) para las
muestras S8 y S9 fueron: 57(5), 490(30), 0.9976, 4, 8.8 y 55(5), 320(30), 0.9707, 5, 8.6,
respectivamente. Las pendientes del MOSA fueron inferiores a la pendiente de la curva
de calibrado de patrones de amonio (Tabla 35).
Tabla 37. Test t de comparación de pendientes de las ecuaciones del MOSA para todas las
muestras evaluadas con la pendiente de la curva de calibrado de patrones de amonio.
Los valores tabulados corresponden a un nivel de confianza del 95 % excepto *(98 %) y
**(99 %).
Muestra Fcalc Ftab Conclusión 1 tcalc ttab Conclusión 2
S1-Natural 3.988 17.443
Varianzas
Homogéneas
1.086 2.7767
Pendientes
similares
S2-Grifo 6.150 799.5
Varianzas
Homogéneas
2.940 3.1824
Pendientes
similares
S3-Fuente 3.205 864.16
Varianzas
Homogéneas
0.614 2.7764
Pendientes
similares
S4-Riego 1 1.606 864.16
Varianzas
Homogéneas
3.540
2.7764
3.7469*
Pendientes
similares
S5-Riego 2 92.003 17.443
Varianzas no
Homogéneas
2.024 12.603
Pendientes
similares
S6-Lago 44.31 17.443
Varianzas no
Homogéneas
1.264 12.496
Pendientes
similares
S7-Marina 1 2.23 799.5
Varianzas
Homogéneas
3.894
3.1824
5.84**
Pendientes
similares
S8-Marina 2 5.36 17.443
Varianzas
Homogéneas
5.960
2.7764
4.6041**
Efecto matriz
S9-Marina 3 5.421 17.443
Varianzas
Homogéneas
8.137
2.7764
4.6041**
Efecto matriz
S3- Kjeldahl 1.659 647.79
Varianzas
Homogéneas
0.071 4.3027
Pendientes
similares
S4- Kjeldahl 2.378 16.044
Varianzas
Homogéneas
0.057 2.5707
Pendientes
similares
S6- Kjeldahl 2.726 647.79
Varianzas
Homogéneas
2.311 4.3027
Pendientes
similares
S9- Kjeldahl 3.409 864.16
Varianzas
Homogéneas
0.619 2.7764
Pendientes
similares
S10- Kjeldahl 1.571 799.5
Varianzas
Homogéneas
1.179 3.1824
Pendientes
similares
En la Tabla 38 se muestran las concentraciones encontradas en la muestra a las
dos concentraciones de amonio adicionado, y los errores para estas muestras fueron
inferiores en todos los casos al 10.7% excepto en la muestra S7, que presentó pendiente
del MOSA similar a la de la curva de calibrado de patrones a un nivel de confianza del
99% (para esta muestra los errores relativos fueron algo mayores). Los cromatogramas
típicos de la muestra de agua de fuente fortificada con 0, 0.15 y 0.3 mg/L de amonio se
muestran el la Figura 39.

97
Tabla 38. Concentración de amonio encontrada en muestras reales fortificadas con amonio a
diferentes niveles de concentración antes y después del tratamiento Kjeldahl.
Amonio libre Después del tratamiento Kjeldahl
NH4
+
adicionado
0.15 mg/L
NH4
+
adicionado
0.3 mg/L
NH4
+
adicionado
0.15 mg/L
NH4
+
adicionado
0.3 mg/L
Muestra Concentración encontrada (%Er) Concentración encontrada (%Er)
S1-Natural 0.155 (3.3%) 0.268 (10.7%)
S2-Grifo 0.141 (6%)
S3-Fuente 0.135 (9.3%) 0.299 (0.3%) 0.138 (8%) 0.299 (0.3%)
S4-Riego 1 0.145 (3.3%) 0.268 (10.7%) 0.141 (6%) 0.278 (7.3%)
S5- Riego 2 0.135 (10%) 0.271 (9.7%)
S6-Lago 0.145 (3.3%) 0.283 (5.7%) 0.169 (12.7%) 0.327 (9%)
S7-Marina 1 0.189 (26 %) 0.354 (18%)
S9-Marina 3 0.147 (2%) 0.291 (3%)
S10-Residual 0.149 (0.3%) 0.304 (1.3%) 0.148 (1.3%) 0.320 (6.7%)
Figura 39. Cromatogramas de la muestra de agua de fuente fortificada con 0, 0.15 y 0.3
mg/L de amonio.
En la Tabla 39 se describe la respuesta de screening que proporciona el método
propuesto tomando como referencia la concentración límite establecida en la legislación.
Se encontró amonio en las muestras S3, S6, S7, S8, S9 y S10, pero solo el agua residual
(S10) y el agua marina 1 (S7), superaron el límite establecido por la legislación (0.5
mg/L). En la Tabla 39 se muestra además la concentración de amonio hallada en las
0 2 4 6
Tiempo (min)
S2
S2 + 0.15 mg/l NH4+
S2 + 0.3 mg/l NH4+
NH4+
NH4+
NH4+

REACCIÓN DEL TCPO
98
muestras utilizando la curva de calibrado de patrones de amonio (Tabla 35) y utilizando
el MOSA, observándose resultados similares. El agua de fuente y el agua residual se
analizaron también utilizando el método de OPA-NAC anteriormente descrito (Apéndice
4, [55]). Los resultados fueron 0.37 (s=0.02, n=3) y 32 (s=0.4, n=3), respectivamente.
Ambos valores pueden considerarse estadísticamente similares (a un nivel de confianza
del 95%) a los obtenidos por el método propuesto. El amonio cuantificado en el agua
residual debería observarse con reservas, debido a la gran dilución llevada a cabo en la
muestra tanto por el método quimioluminiscente como por el fluorescente.
Un grupo representativo de estas muestras se trató para evaluar el Nitrógeno
Kjeldahl Total. El test t presentado en la Tabla 37, indicó que la pendiente del MOSA era
similar a la de la curva de patrones de amonio. Por tanto, ninguna de las muestras
presentaba efecto matriz, pudiéndose obtener la concentración de amonio a partir de la
curva de calibrado con patrones. Para validar la exactitud, las muestras tratadas mediante
el procedimiento Kjeldahl, se fortificaron con concentraciones conocidas de amonio, y las
concentraciones de amonio halladas se muestran en la Tabla 38. Como puede observarse,
se obtuvieron errores relativos bajos, entre el 0.3 y el 12.7%.
La concentración de amonio en las muestras después de aplicar el tratamiento
Kjeldahl, fue superior en todos los casos a la concentración del amonio libre (Tabla 39).
Las muestras de agua de fuente, residual y de lago, dieron una respuesta de screening
positiva, siendo su concentración superior al límite establecido por la legislación (2
mg/L).
Tabla 39. Respuesta de screening y Concentración de amonio deducida para las muestras
estudiadas.
Muestra
Límite
legislado
(mg/l)
Respuesta
Screening
Concentración NH4
+
(C ±± s) (mg/l) (n=3)
Curva patrones
Concentración NH4
+
(C ±± s) (mg/l) (n)
MOSA
S1-Natural 0.5 No - -
S2-Grifo 0.5 No - -
S3-Fuente 0.5 No (0.367 ± 0.012) 0.347 (n=5)
S4-Riego 1 0.5 No - -
S5-Riego 2 0.5 No - -
S6-Lago 0.5 No (0.352 ± 0.014) 0.378 (n=5)
S7-Marina 1 0.5 Si (3.8 ± 0.1) 3.108 (n=5)
S8-Marina 2 0.5 No Efecto matriz 0.098 (n=5)
S9-Marina 3 0.5 No Efecto matriz 0.147 (n=5)
S10-Residual 0.5 Si (30 ± 4) 30.69 (n=4)
S3 Kjeldahl 2 Si (2.28 ± 0.12) 2.34 (n=3)
S4 Kjeldahl 2 No (0.56 ± 0.10) 0.595 (n=4)
S6 Kjeldahl 2 Si (3.05 ± 0.13) 2.71 (n=3)
S9 Kjeldahl 2 No (0.81 ± 0.08) 0.885 (n=5)
S10 Kjeldahl 2 Si (169 ± 18) 152.6 (n=4)

99
Conclusiones
En este trabajo se estudió la detección quimioluminiscente del amonio con la
intención de mejorar la selectividad y sensibilidad de su determinación. Se utilizó el
procedimiento de dansilación en disolución. El derivado dansilado se separó mediante un
sistema de HPLC y se mezcló post-columna con los reactivos TCPO/H2O2 generándose la
quimioluminiscencia.
Se consiguió la cuantificación de amonio a niveles bajos (0.027-0.75 mg/L) con
buena exactitud (errores inferiores al 9.8%) y precisión (%DER entre 2-8.6%). El método
resultó selectivo frente a la presencia de aminas en la muestra y puede aplicarse para el
screening y cuantificación del amonio en muestras de agua, siendo el límite de detección
de 8 ìg/L, nivel que está muy alejado del límite establecido por la legislación (0.5 mg/L
para muestras de agua no digeridas, y 2 mg/L para muestras de agua tratadas mediante el
procedimiento Kjeldahl).
El amonio se pudo cuantificar a partir de la curva de calibrado de patrones para
casi todos los tipos de muestras de agua analizados: embotellada (natural), de grifo, de
lago, de fuente, de riego y residual. Sin embargo, dos de las tres muestras de agua marina
ensayadas, requirieron la aplicación del método de adición estándar para la cuantificación
del amonio debido a la presencia de efecto matriz, efecto que desapareció al aplicar el
tratamiento Kjeldahl.

REACCIÓN DEL TCPO
100
2.2. MÉTODO DE SCREENING DE MUESTRAS PARA Cu(II).
La necesidad de respuestas analíticas rápidas y fiables es incuestionable. Los
métodos de screening de muestras [73-74] proporcionan una respuesta binaria Si/No, que
indica si los analitos en cuestión están presentes en la muestra a un nivel de concentración
por encima o por debajo de un nivel de corte establecido. Con esto, se consiguen algunas
ventajas, como la reducción de los costes, rapidez, simplicidad y minimización de errores
debido a las diferencias entre el muestreo y el análisis.
Los métodos de screening tienden a dar información cualitativa más que
cuantitativa, requieren muy poco o ningún tratamiento de la muestra, son rápidos y
normalmente requieren confirmación mediante el uso del método convencional para las
muestras cuyo resultado ha sido positivo. Ha de establecerse el límite de detección, el
valor de corte alrededor del cual se establecerán las posibilidades de error del método, el
umbral o valor establecido por el cliente o la legislación (marcará la respuesta Sí/No), y
las incertidumbres de los valores anteriores.

101
2.1.3.1. MÉTODO AUTOMÁTICO DE INYECCIÓN EN FLUJO PARA EL
SCREENING DE MUESTRAS DE AGUA PARA Cu(II), BASADO EN LA
REACCIÓN QUIMIOLUMINISCENTE DE COPROPORFIRINA I-Cu (II) /
TCPO / H2O2.
Igarashi y col. [75] propusieron un método para la determinación de Cu(II)
basado en la reacción quimioluminiscente de la Coproporfirina I-Cu(II)/TCPO/H2O2 en
estático. Basándonos en estos estudios, se propone en este capítulo un método automático
para el screening de muestras de agua para Cu (II), basado en la reacción
quimioluminiscente del peroxioxalato. La Coproporfirina I es el fluoróforo. En presencia
de Cu(II), por efecto quenching, la emisión quimioluminiscente disminuye. Se utilizó un
detector quimioluminiscente simple diseñado para inyección en flujo.
Se analizaron varias muestras de agua y se validó el método mediante el análisis
de un patrón de referencia certificado, verificándose su utilidad para cumplir con la
legislación vigente sobre Cu (ver Tabla 3, Pág. 14 del Capítulo1-Introducción)
El montaje de inyección en flujo utilizado es el que se muestra en la Figura 16
Pág. 40 del Capítulo 1-Introducción. Más información acerca de las condiciones
experimentales se incluye en el Apéndice 6.
Estudio de la señal del Detectorde Quimioluminiscencia FireFly
Se evaluó la sensibilidad del detector utilizando el procedimiento en flujo descrito
para la reacción del Cr(III)/Luminol/H2O2 [76]. Las curvas de calibrado Log-Log y los
límites de detección obtenidos por nuestro grupo de investigación en publicaciones
recientes [76-78] utilizando el espectrofluorímetro Hitachi F-4500, así como la curva
obtenida con este detector, se muestra en la Tabla 40. El detector de
Quimioluminiscencia FireFly presentó sensibilidad similar al Hitachi F-4500, con la
ventaja de ser mucho más simple y presentar mucho menor coste.
Tabla 40. Comparación de sensibilidad de los detectores en la reacción QL
Cr(III)/luminol/H2O2.
Referencia (loga ±± sloga) (b ±± sb)
Límite de
detección (µµg/l)
Detector
[18] (1.91 ± 0.03) (1.19 ± 0.03) 1.3 Hitachi F4500
[19] (1.97 ± 0.07) (1.25 ± 0.07) 1.2 Hitachi F4500
[20] (1.84 ± 0.03) (1.16 ± 0.03) 1.6 Hitachi F4500
Este trabajo (1.04 ± 0.06) (1.25 ± 0.06) 1.4 FireFly QL

REACCIÓN DEL TCPO
102
Optimización del sistema de flujo
La medida del espectro de emisión del blanco dio un máximo a 622 nm (Figura
40 A). Una vez conocido el máximo de emisión, se registró la curva cinética de la
reacción. En tan solo 10 segundos, se formaba el intermedio correspondiente y se
desactivaba, como se muestra en la Figura 40 B.
Figura 40. A) Espectro de emisión QL del blanco de Coproporfirina I. B) Curva cinética de
la reacción QL Coproporfirina I/TCPO/H2O2.
La optimización del sistema se llevó a cabo con la disolución blanco de
Coproporfirina I, considerando óptimas las variables que maximizaban su señal, ya que el
Cu(II) contribuye a su disminución. En la Tabla 41 se muestran las variables del sistema
optimizadas, el intervalo de estudio y el valor óptimo seleccionado.
Tabla 41. Optimización de las variables químicas y físicas del sistema de inyección en flujo.
Variable
Intervalo
estudiado
Óptimo seleccionado
Concentración CTAC 2· 10
-5
– 9· 10
-2
M 1· 10
-2
M
Concentración H2O2 0.1 – 1 M 0.7 M
Concentración TCPO 1 – 10 mM 5 mM
% MeCN:THF 0%:100% – 100%:0% 75%:25%
pH 4.7-10.3 7.4
V flujo Bomba 2 10 - 48 rpm 40 rpm
Volumen Bucle 50 – 500 µl 50 µl
Distancia de la válvula de
inyección (IV) al detector (QLD)
LIV1-QLD= 12 - 24 cm
LIV2-QLD=7.5 - 15 cm
LIV1-QLD= 12 cm
LIV2-QLD=7.5 cm
Longitud de la guía de ondas 17 – 50 cm 17 cm
Tiempo de reacción
Coproporfirina I-Cu(II)
1 – 10 min 5 min
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
400 500 600 700
λλ (nm)
SeñalQL
A) Máximo 622 nm
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (s)
SeñalQL
B)

103
En cuanto a las variables químicas estudiadas, destacar que la presencia de CTAC
sensibilizó la reacción por ofrecer un entorno más adecuado. El H2O2 y el TCPO debían
llegar al detector por separado para alcanzar la máxima sensibilidad. Sus concentraciones
se variaron de acuerdo con los estudios recientes de esta reacción quimioluminiscente
[79-80]. El TCPO se preparó en acetonitrilo:tetrahidrofurano 75:25 para evitar su
degradación y obtener la máxima sensibilidad. El pH óptimo para la reacción se obtuvo
con tampón bórax 0.1 M a pH 7.4.
En cuanto a las variables físicas, del estudio de la velocidad de la bomba 2, se fijó
una velocidad de flujo para el TCPO de 2.9 ml/min, y para la Coproporfirina I, de 5
ml/min. El volumen del bucle seleccionado fue de 50 ìL. Volúmenes mayores dieron
problemas de reproducibilidad y presión. Dada la rapidez de la reacción, parámetros
como la distancia desde las válvulas de inyección al detector o la longitud de la guía de
ondas fueron estudiados. En ambos casos, los valores óptimos fueron las mínimas
distancias posibles. La sensibilidad aumentó 10 veces al acortar la distancia de las
válvulas de inyección al detector, además de evitarse problemas de dispersión del bolo de
muestra. Por su parte, al disminuir la longitud de la guía de ondas, la sensibilidad
aumentó 2.5 veces.
Con todas estas variables optimizadas, la concentración de Coproporfirina I
empleada para la reacción con Cu(II) fue 1· 10-6
M, concentraciones inferiores no dieron
reacción. Se incorporó el Cu(II) al sistema y se estudió el tiempo de reacción Cu(II)-
Coproporfirina I en el baño de agua. El efecto quenching aumentaba al aumentar en
tiempo de reacción, seleccionándose como óptimo 5 minutos.
Sensibilidad y selectividad del método
Se obtuvieron las curvas de calibrado de Cu(II) en diferentes condiciones de
velocidad de flujo de los portadores de Coproporfirina I y CTAC/H2O2 (0.7/0.5 o 2.2/0.7)
y diferentes condiciones de tiempos de reacción en los baños, t1 y t2 (min). Los resultados
se muestran en la Tabla 42.
Tabla 42. Curvas de calibrado de Cu(II) y parámetros analíticos en diferentes condiciones
(IL: Intervalo lineal; LD: Límite de detección).
vbomba1 (ml/min)
(porph. /
CTAC-H2O2)
t1 t2 a ±± sa b ±± sb
IL
(µµg/l)
LD
(µµg/l)
n, r2
, sy/x /b
0.7/0.5 5 2 4300 ± 40 -18.3 ± 0.7 0-125 17 12, 0.984, 5.38
0.7/0.5 5 2 4370 ± 110 -18.9 ± 1.3 0-125 17 8, 0.972, 8.96
0.7/0.5 5 5 6770 ± 30 -30.7 ± 0.4 0-125 10 5, 0.999, 1.32
2.2/0.7 4 0 3840 ± 20 -19.0 ± 1.0 0-32 17 4, 0.994, 1.22
2.2/0.7 5 0 4255 ± 18 -36.6 ± 1.0 0-32 8.7 4, 0.999, 0.58
2.2/0.7 5 0 5010 ± 50 -30.7 ± 0.8 0-100 10 10, 0.994, 2.83

REACCIÓN DEL TCPO
104
Las dos primeras curvas obtenidas en las mismas condiciones (velocidades de
flujo 0.7/0.5 y t1/t2 5/2 minutos) mostraron la reproducibilidad del sistema, siendo el
porcentaje de recuperación de la primera respecto a la segunda del 97%. Al utilizar
velocidades de flujo 0.7/0.5 y t1=5 minutos, se observó un aumento de sensibilidad de
1.65 veces al aumentar t2.
Al aumentar las velocidades de flujo (2.2/0.7), no se requirió un tiempo de parada
en el segundo baño, obteniéndose una pendiente similar a los casos anteriores. Cuando el
tiempo de reacción se incrementó en un minuto más, la sensibilidad fue casi el doble,
obteniéndose el mejor límite de detección de 8.7 ìg/L, nivel que f ue 5.8 veces inferior al
límite establecido por la legislación para Cu(II) en aguas (50 ìg/L). Los límites de
detección se calcularon como 3· sblanco/b, siendo sblanco = 105.96 (n=9).
La curva de calibrado en estas últimas condiciones de máxima sensibilidad, se
obtuvo en el intervalo 1-100 ìg/L, que fue el intervalo lineal, pues a concentraciones
superiores de Cu(II), la señal permaneció constante. Los registros de inyección en flujo
obtenidos se muestran en la Figura 41.
Figura 41. Registros de inyección en flujo de los patrones de la curva de calibrado de Cu(II).
Los estudios de repetibilidad y reproducibilidad para un patrón de 15.9 y 17.3
ìg/l de Cu(II) respectivamente, dieron porcentajes de desviación estándar relativa
(%DER) del 16% y 12%. Los porcentajes de recuperación fueron del 93% y 109%
respectivamente. Estos valores están en concordancia con la precisión y exactitud
requerida en análisis de trazas.
0 4 8
Tiempo (min)
0
2000
4000
6000
0 µg/l
31.8 µg/l
47.7 µg/l
79.4 µg/l
95.3 µg/l

105
Para validar la exactitud del método, se utilizó además un Material de Referencia
Certificado, SRM © 1640, de agua dulce (ver composición Pág. 121). El método dio una
concentración de Cu(II) en el material de referencia de (96 ± 14) ìg/L (Valor de
Referencia del SRM 1640: 85.2 ìg/L). El porcentaje de recuperación fue (113 ± 17) %
(n=3), quedando demostrada la exactitud del método.
Para comprobar la selectividad del método, se estudió el límite de tolerancia
(concentración a la cual la señal se modificaba más de un 10%) de los siguientes iones
metálicos: Na+
, Mg2+
, K+
, Ca2+
, Ag+
, Mn2+
, Ni2+
, Zn2+
, Al3+
, Sn2+
, Pb2+
, Hg2+
, Fe2+
, Fe3+
,
Cd2+
, Cr3+
y Co2+
. Los iones Na+
, Mg2+
, K+
, Ca2+
, Ag+
, Mn2+
, Ni2+
y Zn2+
solo
interfirieron a concentraciones muy elevadas, entre 5 y 500 mg/l, que no son habituales
en muestras de agua. Al3+
, Sn2+
, Hg2+
, Cd2+
, Cr3+
y Co2+
tuvieron límites de tolerancia más
bajos, pero en ningún caso superaron los límites establecidos por la legislación.
Solamente Pb2+
, Fe2+
y Fe3+
dieron un límite de tolerancia por debajo de su límite
establecido por la legislación, pero estaba por encima de su concentración habitual en
aguas, por lo que el método fue suficientemente selectivo para la determinación de Cu(II).
En la Tabla 43 se muestran los límites de tolerancia obtenidos, así como los límites
establecidos por la legislación y su concentración habitual en aguas, para los iones más
tóxicos estudiados.
Tabla 43. Estudio de la interferencia de iones metálicos.
Interferente
Límite Legislado
(µµg/L)
Conc. en aguas
naturales (µµg/L)
Limite de
Tolerancia (µµg/L)
Al(III) 10 3000
Fe(III) 2000 500 2000
Fe(III) 2000 500 2000
Sn(II) 300
Pb(II) 50 1 30
Hg(II) 1 0.07 300
Cd(II) 5 0.03 30
Co(II) 0.05 30
Cr(III) 50 1 3000
Fiabilidad del método para el screening de muestras de agua para Cu(II)
A concentraciones cercanas al límite de detección, se pueden producir un
determinado porcentaje de falsos positivos y falsos negativos. Para tener un valor de
referencia, se estableció un valor de corte a concentración 2LD. Se consideró un falso
positivo cuando una muestra de concentración inferior al nivel de corte, daba una
respuesta positiva. Se consideró un falso negativo cuando una muestra de concentración
igual o superior al nivel de corte, daba una respuesta negativa.

REACCIÓN DEL TCPO
106
En la Figura 42, pueden verse los porcentajes de falsos positivos y negativos
correspondientes a la medida de patrones de concentraciones cercanas al límite de
detección: 0.5LD, 1LD, 1.5LD, 2LD, 3LD y 3.5LD ìg/L. Como puede observarse, a
partir de 3.5LD, el porcentaje de falsos desaparece. Este valor está lejos del valor
legislado (50 ìg/L), por lo que no se cometerán errores al utilizar el método para el
screening de muestras.
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
4,3 8,7 13 17,3 26 30,3
%FP%FN
µg/l
Límite
Detección
Nivel de
Corte
0.5DL
1DL
1.5DL
2DL 3DL 3.5DL
Figura 42. Porcentajes de falsos positivos (%FP) y falsos negativos (%FN) en patrones de
Cu(II) a concentraciones cercanas al límite de detección(DL).
Aplicación a muestras de agua
El método se aplicó al screening y cuantificación de Cu(II) en muestras de agua
reales. De las seis muestras analizadas de forma directa, solamente la muestra de agua de
fuente dio una respuesta positiva (Tabla 44).
Tabla 44. Resultados obtenidos en el screening y determinación de Cu(II) en muestras de
agua reales.
Muestra
Respuesta
de screening
Conc. en la muestra
(C ±± s) (µµg/l)
Cadicionada
(µµg/l)
%Rec ±± s
S1, muestra sintética No - 31.77 92 ± 16 (n=6)
S2, agua natural No - 31.77 102 ± 19 (n=3)
S5, agua de grifo No - 50 83 ± 11 (n=3)
S6, agua de fuente Si (61 ± 5) (n=8) 50 119 ± 12 (n=3)

107
Los porcentajes de recuperación obtenidos al fortificar las muestras con Cu(II),
fueron cercanos al 100%, como puede observarse en la Tabla 44. Estos resultados
validaron la exactitud del método, ya confirmada con el estudio del patrón de referencia
certificado.
Conclusiones
En este apartado de la Tesis, se propuso un sistema automático para la
determinación de Cu(II) y el screening de muestras de agua. Se optimizaron las
condiciones químicas y físicas de la reacción: CTAC 1· 10-2
M, H2O2 0.7 M, TCPO 5 mM,
Acetonitrilo:THF 75:25, tampón bórax pH 7.4, velocidad de las bombas rápida puesto
que la reacción se da en menos de 10 segundos, y distancias desde las válvulas de
inyección al detector, las mínimas posibles para evitar dispersiones.
El intervalo lineal de concentraciones fue de 10 a 100 ìg/L, siendo el límite de
detección 8.7 ìg/L (muy por debajo del límite establecido por la legislación, 50 ìg/L). La
precisión del método fue adecuada, siendo los valores de %DER del 12% al 16%. Los
estudios de selectividad dieron límites de tolerancia superiores a las concentraciones
legisladas en la mayoría de iones estudiados. En los casos en que fueron inferiores,
estaban a niveles no habituales en muestras de aguas.
La exactitud del método se evaluó mediante la fortificación de las muestras de
agua analizadas, cuyos porcentajes de recuperación fueron cercanos al 100%. Además, el
método se validó mediante un patrón de referencia certificado proporcionando también
resultados bastante exactos.
Además, se estudió la fiabilidad del método para el screening de muestras de
agua y se vio que solo aparecían falsos positivos y negativos a niveles cercanos al límite
de detección. Por tanto el método permitía filtrar las muestras cuyo contenido superaba el
límite establecido por la legislación (50ìg/L) de un conjunto de muestras de estudio, con
fiabilidad adecuada.

109
2.2. REACCIÓN DEL LUMINOL
1.1. MEJORA DE LA EXACTITUD DE LA DETERMINACIÓN
DE Cr(III), Cr(VI) Y Co(II).
Validar un método de análisis consiste en verificar y documentar su validez, es
decir, su adecuación a los requisitos establecidos por el usuario. Estos requisitos se
denominan parámetros de calidad o características significativas de método. Pueden
distinguirse tres tipos de parámetros de calidad:
§ Estadísticos: Precisión, exactitud, selectividad, límite de detección, intervalo
dinámico y robustez. Este tipo de parámetros son los que son estudiados más a fondo,
y se denominan parámetros analíticos o figuras de mérito. De entre ellos, la exactitud
es el parámetro más difícil de garantizar.
§ Operativos: Rapidez, equipamiento necesario, instrumentación requerida, necesidades
energéticas, complejidad en la preparación de la muestra, etc..
§ Económicos: Inversión inicial, costes de mantenimiento, personal requerido, etc..
La validación de la exactitud de un método puede llevarse a cabo por diferentes
vías:
§ Estudio de errores sistemáticos.
§ Comparación del resultado del método que se está ensayando con el(los) resultado(s)
obtenido(s) utilizando otro(s) método(s) basado(s) en principios físico-químicos
distintos.
§ Aplicación del método a un material de referencia certificado cuya composición en
uno o varios analitos ha sido certificada por un organismo de prestigio.
§ Participación en un ejercicio de comparación interlaboratorio.
La reacción quimioluminiscente del luminol con peróxido de hidrógeno, se ha
utilizado para la determinación de iones metálicos como Cr(III) y Co(II), que actúan
como catalizadores. En esta Tesis se estudian tres aspectos que inciden en la exactitud de
la determinación de Cr(III), Cr(VI) y Co(II):
§ Elaboración de una guía para la eliminación de errores sistemáticos en la especiación
de Cr(III) y Cr(VI).
§ Estudio de la influencia de los protocolos de acondicionamiento de muestras de agua
en la detección quimioluminiscente de elementos traza.
§ Propuesta de un modelo de calibración multivariada aplicada a la determinación
quimioluminiscente simultánea de cobalto y/o cromo.

REACCIÓN DEL LUMINOL
110
2.2.1.1. ELABORACIÓN DE UNA GUÍA PARA LA ELIMINACIÓN DE
ERRORES SISTEMÁTICOS EN LA ESPECIACIÓN DE Cr(III) Y Cr(VI)
EMPLEANDO LA REACCIÓN DEL LUMINOL CON H2O2. APLICACIÓN A
MUESTRAS DE AGUA.
La determinación de niveles traza en muestras de agua medioambientales
requiere técnicas analíticas de elevada sensibilidad y selectividad. Para la determinación
de cromo en muestras de agua, se han utilizado diferentes métodos, como la
espectrofotometría, fluorimetría, fluorescencia de rayos X, espectrometría de absorción
atómica, espectrometría de emisión atómica, cromatografía, métodos electroquímicos y
análisis quimioluminiscente. La técnica quimioluminiscente proporciona métodos para el
análisis de trazas que son atractivos debido a su elevada sensibilidad y bajo coste.
En la bibliografía se han descrito diferentes procedimientos para la determinación
de Cr(III) y Cr(VI) (previa reducción a Cr(III) con H2O2 en HCl) en muestras de agua
basados en la reacción del luminol con peróxido de hidrógeno, tal como se muestra en la
Tabla 45. En todos los casos, la señal de emisión se registra a 425 nm y se utiliza EDTA
como agente complejante o separación cromatográfica para evitar interferencias de otros
metales. En la Tabla 45, se refleja como los límites de detección varían en función del
procedimiento utilizado.
En este apartado se profundiza en la especiación de Cromo centrándose en la
exactitud, para lo que se ha estudiado:
§ El paso de calibración, utilizando diferentes modelos: potencial o Log-Log e intervalo
lineal, utilizando el sistema luminol/H2O2.
§ El efecto de algunos interferentes y la interferencia de la matriz en estas
determinaciones en presencia de EDTA.
§ Una discusión acerca de la utilidad del método de adición estándar (MOSA) en
función del modelo de calibración elegido.
§ Evaluación de la exactitud y precisión del procedimiento para la cuantificación de
Cr(III) y Cr(VI).
§ Desarrollo de un protocolo a seguir para evitar errores sistemáticos en la especiación
de cromo.

111
Tabla 45. Estudios recientes basados en la reacción del luminol-H2O2 para cromo.
Ref. Método
Límite Detección
(µµg/L)
[81]
Determinación de Cr(III) y Co. Separación
cromatográfica.
15
[82]
Determinación Cr(III) Inyección en Flujo. EDTA como
agente complejante.
0.01
[83]
Determinación de Cr(VI) y Cr(III). SO2 como reductor.
Separación cromatográfica.
Cr(III): 50
Cr(VI): 100
[84]
Determinación de Cr(VI) y Cr(III). Inyección en flujo.
H2O2 en HCl como agente reductor. EDTA como agente
complejante.
0.01
[85]
Determinación de Cr(III) y Cr(VI) por cromatografía
iónica. Sulfito sódico como agente reductor.
Cr(III):120
Cr(VI):90
[86] Determinación de Cr(III). Inyección en flujo. 500
[87]
Determinación Cr(VI) y Cr(III) con separación
cromatográfica y una segunda columna cromatográfica
para la reducción de Cr(VI) a Cr(III).
2
[88] Determinación de Cr(III). Inyección en flujo. 5.2
Modelos de Calibración para Cr(III), Cr(VI) y Cr Total
Las curvas de calibrado Señal-Concentración, siguen una ecuación potencial del
tipo: S = a· Cb
, que al tomar logaritmos se transforma en una recta del tipo: LogS = Loga
+ b· LogC. También se han obtenido las ecuaciones de las rectas de calibrado
considerando únicamente el intervalo donde el comportamiento es lineal.
Se ensayaron reactivos de diferentes calidades: HCl(p.a.) / NaHCO3(r.a.) /
Na2CO3· 10H2O(p.a.), o bien HCl(trace pure) / Na2CO3(p.a.), y se observó que la señal del
blanco desaparecía al utilizar los reactivos de mayor pureza: HCl(trace pure) /
Na2CO3(p.a.).
En la Tabla 46, se muestran las curvas de calibrado Log-Log e intervalo lineal
para el Cr(III) y para el Cr(VI) utilizando reactivos para análisis de trazas, y en el caso
del Cr(VI), a dos niveles de HCl diferentes (1· 10-3
M y 5· 10-3
M). Al observar los
intervalos lineales, se dedujo que a mayor concentración de HCl, la sensibilidad era
mayor, lo que significa que la concentración de HCl utilizada en la reducción de Cr(VI) a
Cr(III) es un parámetro a controlar.

112
Tabla 46. Curvas de calibrado para Cr(III) y Cr(VI).
Curva de calibrado
Cr HCl (M)
Log-Log:
a ±± sa; b ±± sb
(n, sy/x, r
2
)
Intervalo lineal:
a ± sa; b ± sb
(n, sy/x, r
2
)
Cr(III)* -
1.06±0.07; 1.70±0.07
(10, 0.04, 0.9861)
-330±70; 97±6
(10, 80, 0.9689)
Cr(VI) 1· 10
-3 1.576±0.012; 1.403±0.013
(40, 0.02, 0.9967)
-189±8; 115.9±1.1
(30, 17, 0.9976)
Cr(VI) 5· 10
-3 1.927±0.008; 1.314±0.009
(40, 0.014, 0.9984)
-252±17; 197±2
(30, 40, 0.996)
En la Figura 43 se muestran los picos de inyección en flujo obtenidos para el
calibrado de Cr(VI) con los reactivos de mayor pureza (HCl(trace pure) / Na2CO3(p.a.)),
y concentración de HCl 5· 10-3
M para el tratamiento de reducción de Cr(VI) a Cr(III).
Figura 43. Registros de señal para la curva de calibrado de Cr(VI) con HCl 5· 10
-3
M.
Se llevó a cabo el estudio de mezclas de Cr(III) y Cr(VI), para examinar la
posible determinación de Cr Total. En la Figura 44, puede observarse el solapamiento
entre las curvas potenciales de Cr(VI) y Mezcla (Cr(VI)+Cr(III)) a dos niveles de
concentración de HCl utilizado en el tratamiento de reducción (HCl 1· 10-3
M y HCl 5· 10-
3
M). Las curvas de calibrado potenciales de las mezclas dieron pendientes similares a las
de las curvas de calibrado potenciales de Cr(VI), cuando se expresa la concentración de
Cromo como Cromo Total (más información puede verse en el Apéndice 7, [77]). De
estos resultados, se deduce que la conversión de Cr(VI) a Cr(III) después del tratamiento
de reducción, es del 100 %.
0
1000
2000
3000
4000
Señalquimioluminiscente
0 g/L
3 g/L
6 g/L
10 g/L
15 g/L
µ
µ
µ
µ
µ

113
Figura 44. Curvas de calibrado potenciales para Cr(VI) (♦HCl 1· 10
-3
M, HCl 5· 10
-3
M) y
para Mezclas (Cr(III)+Cr(VI))( HCl 1· 10
-3
M, ×× HCl 5· 10
-3
M).
Por otra parte, al utilizar curvas de calibrado en el intervalo lineal, las pendientes
fueron similares si se representaban frente a Cr(VI) adicionado o frente a Cr Total, lo que
indicaba que en el intervalo lineal, Cr(III) y Cr(VI) se comportaban igual después del
tratamiento de reducción. En la Tabla 47, pueden observarse estos resultados a los dos
niveles de HCl utilizados para el tratamiento de reducción.
Tabla 47. Curvas de calibrado en el intervalo lineal para las mezclas de Cr(III)+Cr(VI).
Cr HCl (M) (a ±± sa) (b ±± sb) n r
2
Cr Total 1· 10
-3
(-270 ± 20) (129 ± 3) 20 0.9906
Cr (VI) adicionado 1· 10
-3
(120 ± 20) (129 ± 3) 20 0.9906
Cr Total 5· 10
-3
(-300 ± 50) (193 ± 4) 20 0.9932
Cr(VI) adicionado 5· 10
-3
(270 ± 20) (193 ± 4) 20 0.9932
Los calibrados obtenidos para mezclas (Figura 44, Tabla 47) fueron similares a
los obtenidos para Cr(VI) (Tabla 46).
Con esto, se concluyó que el método se puede aplicar para la especiación de
Cromo en muestras de agua, determinando la concentración de Cr(III) previamente al
tratamiento de reducción utilizando la correspondiente curva de calibrado, y después
determinando el Cr Total utilizando la curva de calibrado preparada en las condic iones de
reducción. El Cr(VI) se determinará por diferencia. Para evitar el uso de dos curvas de
calibrado, se puede optar por acidificar las muestras con HCl y medir la CL del Cr(III) en
estas condiciones.
y = 37.695x
1.4028
R
2
= 0.9967
y = 84.534x
1.3144
R
2
= 0.9984
y = 46.845x
1.3307
R
2
= 0.9945
y = 90.704x
1.2507
R
2
= 0.9971
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 5 10 15 20
Cr(VI) + Cr(III) (µµ g/l)
SenyalCL

114
En la Tabla 48 se muestran algunos parámetros analíticos correspondientes a las
determinaciones de Cr(III), Cr(VI) y Cr Total. La precisión y exactitud fueron buenas, tal
como se muestra en la Tabla 48.
Tabla 48. Parámetros analíticos para las determinaciones de Cr(III), Cr(VI) y Cr Total.
Precisión (%cv)** Exactitud (%Er)***
Cr, HCl (M) Cal* L.D. L.C.
%cv5 %cv10 %cv15 % Er5 % Er10 % Er15
Cr(III)
P
L-L
LI
1.9
1.9
2
4
4
4
12
2
12
9
1.4
9
10
1.4
10
5
5
5
4
4
5
5
5
6
%cv5.1 %cv10.3 %cv15.4 % Er5.1 % Er10.3 % Er15.4
Cr(VI),
HCl1· 10-3
P
L-L
LI
1.1
1.1
1.9
3
3
4
4
0.6
4
3
0.4
3
5
0.7
5
1.3
0.2
5
3
0.5
5
2
0.3
1.5
Cr(VI),
HCl5· 10-3
P
L-L
LI
1.8
1.8
1.8
4
4
4
3
0.5
4
1.3
0.17
3
2
0.3
5
2
0.4
5
7
0.9
3
5
0.6
0.9
%cv30.1 %cv35.3 %cv50.7 % Er30.1 % Er35.3 % Er50.7
Cr Total,
HCl1· 10-3
P
L-L
LI
2
2
3
5
5
5
6
0.9
6
4
0.5
4
2
0.3
-
0.3
0.03
0.003
1.2
0.16
0.002
4
0.6
-
Cr Total,
HCl5· 10-3
P
L-L
LI
1.3
1.3
2
3
3
4
5
0.7
5
3
0.3
3
1.8
0.2
-
0.4
0.04
0.0014
0.11
0.017
0.0013
1.2
0.15
-
* P: Curva de calibrado potencial. L-L: Curva de calibrado doble logarítmica. LI: Intervalo lineal.
** %cv: Coeficiente de variaciónconcentración adicionada (µg/l).. ***Er: Error relativoconcentración adicionada (µg/l).
Estudio de interferencias
Se demostró que el Cr(VI) no interfería en la determinación directa de Cr(III) en
concentraciones inferiores a 10 mg/l.
El Co(II) interfirió en la determinación directa de Cr(III) a niveles superiores a 50
µg/l, aumentando su interferencia después de aplicar el tratamiento de reducción debido a
la presencia del HCl. Las curvas de calibrado de Cr(III)/Cr(VI) en presencia de Co(II):
Directa (Cr(III)): y = (82 ±± 6)· C + (110 ±± 50) y después del tratamiento con HCl 5· 10-3
M
(Cr(VI)): y = (175 ±± 9)· C + (2280 ±± 90), dieron pendientes similares a las obtenidas sin
Co(II) (ver Tabla 46), lo que demostró la aditividad entre las señales de Cr y Co.
En cuanto a los otros cationes y aniones estudiados: Cu(II), Mn(II), Ni(II),
Mg(II), Ca(II), Fe(III), Cl-
, Br-
y SO4
2-
, no produjeron interferencias.

115
Aplicación a muestras reales
S Método de adición estándar (MOSA)
En la bibliografía no existen referencias acerca del uso de curvas potenciales para
la evaluación del efecto matriz. Partiendo de datos simulados, se predijo cómo se
modificarían los coeficientes a y b del modelo de curva potencial y=a· Cb
. Se plantearon
dos suposiciones:
- Si no hubiese Cromo en la muestra, pero sí efecto matriz, un %Conversión (P) entre
el 80-120 %, provocaría cambios en el coeficiente a, pero no en b, de forma que: y =
a· (P· C)b
= (a· Pb
)· Cb
= a’· Cb
. Este efecto puede observarse en la Figura 45.
Figura 45. Influencia del efecto matriz en las curvas potenciales. ♦Conversión 100%.
Conversión 80 %. Conversión 120%.
- Si la muestra contuviese Cromo, no podríamos utilizar las curvas potenciales porque
no conoceríamos la concentración de Cromo Total, con lo que este modelo no sirve
para evaluar el efecto matriz.
Se estudió el comportamiento de un polinomio, y = a· X2
+ b· X + c, al adicionar
diferentes concentraciones de analito y en ausencia de efecto matriz. El coeficiente a se
conserva, tal como puede verse en la Tabla 49, variando los coeficientes b y c. Los datos
experimentales, no se adaptaron a este tipo de comportamiento, dando también una
variación en el coeficiente a, tal como se observa en la Tabla 49.
y = 24.88x1.2631
y = 32.985x1.2631
y = 41.526x1.2631
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
-15 5 25 45 65
Cromo Total
SeñalCL

116
Tabla 49. Curvas de calibrado simuladas y reales utilizando modelos de calibración
polinómicos.
Conc.
Cr (µµg/l)
Datos simulados Datos experimentales
0 y = 0.266· X2
+ 105.7· X + 2402.2 y = 0.4688· X2
+ 71.158· X - 134.16
5 y = 0.266· X2
+ 108.36· X + 2937.4 y = 0.4076· X2
+ 79.802· X + 182.53
10 y = 0.266· X2
+ 111.02· X + 3485.8 y = 0.3646· X2
+ 86.627· X + 557.03
15 y = 0.266· X2
+ 113.68· X + 4047.5 y = 0.3056· X2
+ 97.317· X + 1423
20 y = 0.266· X2
+ 116.34· X + 4622.6 y = 0.266· X2
+ 105.7· X + 2402.4
En el caso de que hubiese efecto matriz, en los datos polinómicos simulados,
ninguno de los coeficientes del modelo se conservarían, con lo que se descartó para su
evaluación.
Con estos resultados, se concluyó que no se podían utilizar este tipo de curvas
para la evaluación del efecto matriz, siendo únicamente posible diagnosticarlo si se
utilizaban los intervalos lineales de concentración por comparación de las pendientes de
calibración obtenidas.
S Muestra de HCl
El estudio de las rectas de adición estándar en una muestra de HCl que estaba
contaminada con todos los interferentes estudiados, dio porcentajes de recuperación en
pendiente respecto a la curva de calibrado de Cr(VI), entre el 94-114% cuando se trabajó
en condiciones de reducción con HCl 5· 10-3
M y en el intervalo lineal de concentraciones.
Al utilizar el volumen mayor de muestra (AE6) (ver Apéndice 7, [77]), el porcentaje de
recuperación fue del 136%, por estar ya fuera del intervalo lineal (Tabla 50). El valor de
la pendiente de la adición estándar sirve para garantizar que la muestra está dentro del
intervalo lineal de Cromo establecido por el método.
Tabla 50. Pendientes y porcentajes de recuperación para la muestra de HCl.
Adición Estándar b ±± sb %Recuperación
AE1 185 ± 5 93.9%
AE2 200 ± 7 101.5%
AE3 216 ± 3 109.6%
AE4 225 ± 12 114.2%
AE5 193 ± 4 98%
AE6 268 ± 12 136%

117
S Muestras de agua
Se analizaron tres muestras de agua y un patrón de referencia certificado.
Las adiciones estándar realizadas a dos volúmenes de una muestra de agua de
grifo en condiciones de reducción con HCl 5· 10-3
M, dieron pendientes similares a las
curvas de calibrado de patrones: (165 ± 7) y (206 ± 4), con porcentajes de recuperación
del 83.7 % y 104.6 % respectivamente, por lo que el MOSA se puede aplicar con
garantía.
La aplicación del método de Youden antes y después del tratamiento de
reducción, dio ordenada en el origen significativa en ambos casos: (170 ± 40) y (100 ±
40). Estos valores habrán de tenerse en cuenta para calcular la concentración de cromo en
las muestras. Se observó que al aplicar el tratamiento de reducción, el valor del Youden
disminuía, con lo que la señal que resultaba de la medida directa, sería debida a Cr(III) y
a otras especies que desaparecían al aplicar el tratamiento de reducción. En los casos en
que se observe este efecto, solo se podrá determinar el Cromo Total.
El estudio de una muestra de agua mineralno proporcionó ninguna señal antes ni
después del tratamiento de reducción, por lo que la muestra no contenía cromo. El
análisis de esta muestra de agua mineral fortificada con 2.5 ìg/l de Cr(III) y 2.5 ìg/l
Cr(VI), por el método quimioluminiscente propuesto y por el método de referencia de la
difenilcarbazida [89], dio resultados similares (Tabla 51). Además los porcentajes de
recuperación del Cromo adicionado a la muestra, fueron entre el 83-92 % utilizando el
método QL, lo que reflejaba la exactitud del método.
Tabla 51. Determinación de Cromo en una muestra de agua mineral.
Método de Referencia
Concentraciones (ìg/l)
Método CL
Concentraciones (ìg/l)
Cr(III) Cr Total Cr(VI) Cr(III) Cr Total Cr(VI)
Muestra (1.5±0.4) (1.7±0.2) - (1.56±0.05) (1.83±0.09) -
Muestra
fortificada
(3.2±0.3) (6.1±0.3) (2.9±0.3) (3.7±0.1) (5.97±0.07) (2.3±0.2)
La validación de la exactitud del método se completó al analizar la muestra de
agua certificada (SRM © 1640), cuyo valor estimado fue (38.2 ± 1) ìg/l de Cromo (III)
frente al valor certificado (38.6 ±1.6) ìg/l Cr(III).

118
Conclusiones
Se ha demostrado que para obtener resultados exactos en la especiación de
Cromo, se han de tener en cuenta las siguientes consideraciones:
§ En la preparación de los reactivos hay que utilizar reactivos de pureza elevada
(HCl(trace pure) / Na2CO3(p.a.)), para obtener blancos adecuados.
§ El Cr(III) tiene un comportamiento diferente antes y después de tratamiento de
reducción debido a la ausencia o presencia de HCl en la muestra respectivamente. Las
mezclas de Cr(III) y Cr(VI) dieron señales analíticas aditivas después del tratamiento.
Se puede utilizar la misma curva de calibrado para la determinación de Cr(III) y
Cr(VI) si se utiliza HCl en los patrones.
§ La conversión de Cr(VI) a Cr(III) es cuantitativa en las condiciones propuestas. A
partir del estudio de interferencias, se observó que el Co(II) era un interferente fuerte
si no se controla el pH y la concentración de EDTA. Sin embargo, sus señales son
aditivas.
§ Para estudiar el efecto matriz, necesariamente se ha de utilizar el intervalo lineal de
concentración. En las muestras analizadas no se encontró efecto matriz. Se propone
utilizar el valor de la pendiente del MOSA para garantizar la ausencia de errores del
método dada su robustez. El tratamiento de reducción utilizado para la determinación
del Cr(VI), aumentaba la selectividad de la determinación de Cr(III). Para algunas
muestras reales el método solo puede ser utilizado para la determinación de Cromo
Total.
§ Siguiendo el protocolo establecido, la comparación con el método de referencia y el
resultado del patrón de referencia certificado SRM © 1640, indican que los resultados
obtenidos son exactos.

119
2.2.1.2. INFLUENCIA DE LOS PROTOCOLOS DE ACONDICIONAMIENTO
DE MUESTRAS DE AGUA EN LA DETECCIÓN QUIMIOLUMINISCENTE DE
ELEMENTOS TRAZA.
La conservación de las muestras es un problema analítico interesante debido a
que la completa estabilidad de todos los constituyentes de la muestra es imposible de
alcanzar. Después de la recogida de la muestra, los procedimientos de conservación
solamente retrasan los cambios químicos y biológicos [89]. Los procesos de adsorción en
la pared de los recipientes ocurren en muestras almacenadas sin acidificar y sin congelar.
Las muestras pueden almacenarse no acidificadas pero congeladas para conservar la
distribución original de las especies [90]. Independientemente de la temperatura de
almacenamiento, muchos autores recomiendan la acidificación inmediatamente después
del muestreo si se quieren analizar iones metálicos.
El análisis inmediato para la determinación de metales en muestras de agua es
siempre recomendable, o bien un tiempo de preservación corto de la muestra filtrada a
baja temperatura (4ºC). En estos casos, la medida se realiza sin ningún otro paso de
acondicionamiento. El análisis de agua embotellada se realiza también sin necesidad de
ningún paso de acondicionamiento, sin embargo, el método más común de
acondicionamiento para la determinación de metales en muestras de agua, es la adición de
un ácido, como el HCl para corregir el pH hasta 2-3. Las muestras previamente filtradas
se almacenan en frascos de plástico a 4ºC, el tiempo máximo recomendado es de 6 meses.
El procedimiento de conservación a largo plazo utiliza la adición de HNO3. Las
muestras se filtran, acidifican y guardan a 4ºC. Las botellas de polietileno se introducen
en bolsas de plástico aluminizado. El tiempo de almacenaje puede durar incluso 2-3 años.
Este es el protocolo de acondicionamiento que siguen los materiales de referencia
certificados.
La quimioluminiscencia proporciona sensibilidad y selectividad y acoplada a la
inyección en flujo (FI), rapidez y reproducibilidad en la inyección de la muestra y
mezclado de los reactivos, como se ha demostrado en el apartado anterior. Estos factores,
junto al bajo coste comparado con la técnicas de AAS e ICP, la simplicidad y la
posibilidad de realizar análisis in situ, hace a la determinación quimioluminiscente
combinada con la inyección en flujo, extremadamente atractiva para la determinación de
elementos traza en muestra de agua medioambientales.
En la Tabla 52, se muestra una selección de las determinaciones
quimioluminiscentes de iones metálicos en muestras de agua utilizando inyección en flujo
descritas en la bibliografía [91-108]. La reacción más utilizada es la de oxidación del
luminol con peróxido de hidrógeno en medio básico catalizada por iones metálicos. Para
cuantificar Fe(II), Fe(III), Mn(II) y Cu(II), se requiere un paso de preconcentración,
normalmente por cromatografía de intercambio iónico. Para complejar Mn(II) y Co(II), se
han utilizado enmascarantes como EDTA, citrato sódico, 8-quinolinol o ácido fosfórico.
En función de estas condiciones, los parámetros analíticos de los diferentes
procedimientos se ven afectados.

120
Tabla 52. Estudios de la determinación quimioluminiscente en flujo de iones metálicos en
muestras de agua.
Ref. Iones Reacción Pre-
conc.
Consideraciones del método Muestra de
agua
[91] Mn(II) luminol-H2O2 Si Muestra acidificada AcH-AcNH4
+
pH=5.0.
Conc Mn: 0.05-0.5 µg/L
Marina
[92] Fe(II) luminol-H2O2 Si H3PO4 en patrones/muestras pH=6.
Conc Fe: 10-70 µg/L.
-
[93] Co(II)
Cu(II)
Fe(II)
luminol-H2O2 Si Patrones 0.01mol/L HCl. Fase móvil ácido
oxálico pH=4.2. Conc Co: 0.05-4 µg/L. Cu:
20-200 µg/L. Fe semicuantitativo.
-
[94] Fe(III) sulfoflavina-
H2O2
Si Patrones 5⋅10-3
mol/L HCl. Muestra acidif. a
pH=5.5. Conc Fe: 0.02-5.6 µg/L.
Marina
[95] Fe(III) luminol-H2O2 Si Muestra acidif. AcH-AcNH4
+
a pH=3.0.
Conc Fe(III): 0.005-0.1 µg/L.
Oceánica
[96] Cr(VI) luminol-hexa -
cianoferrato(II)
Si No acondicionamiento.
Conc Cr: 0.04-1 µg/L.
Residual
[97] Co(II) Ácido gálico-
H2O2
Si Muestras en ac fórmico/formato amónico a
pH=3.6. Conc Co: 0.0006-1 µg/L.
Marina de
referencia
[98] Mn(II) luminol-H2O2 Si Patrones en HCl 0.1mol/L.
Conc Mn: 0.002-110 µg/L.
Marina de
referencia
[99] Fe(II)
Fe(III)
luminol-O2. Si Patrones en HCl a pH=3.5.
Conc Fe: 0.001-1 µg/L.
suelo, río,
lluvia, lago
[100] Fe(II)
Fe(III)
luminol-O2. Si Patrones y muestras 0.1mol/L HCl.
Conc Fe: 0.002-0.56 µg/L.
Oceánica y
marina
[101] Fe(II)
Total Fe
Sulfoflavina-
H2O2
Si Patrones en HCl. Muestras en tampón acetato
pH=4.4. Conc Fe: 0.05-11 µg/L.
Lluvia, río
grifo, costa
[102] Co(II)
Fe(II)
Fe(III)
pirogalol-H2O2-
NaOH,
Si Patrones 0.01 mol/L en HCl purificado.
Conc Co: 5-850 µg/L. Fe: -
estuario
[103] Cr(III)
Fe(II)
Co(II)
luminol - H2O2-
haluro
No Con / sin EDTA. Conc Cr: 0.005-5.2 µg/L.
Fe: 0.6-56 µg/L. Co: 0.06-59 µg/L.
-
[104] Co(II)
Mn(II)
luminol -IO4
-
No Muestras H3PO4. Para deter Mn, 8-quinolinol,
y para determ Co y Mn adic citrato. Conc Co:
0.01-12 µg/L. Mn: 0.02-9 µg/L.
fresca y
contaminada
[82] Cr(III) luminol-H2O2 No Patrones y muestras 10-4
M EDTA y 3⋅10-4
M
H3PO4. Disol. H2O2 10-3
M en EDTA.
Conc Cr: 0.01-6 µg/L.
mineral,
potable,
contaminada
[105] Mn(II) TCNQ-O2-OH-
EosinaY
No No acid. Análisis inmediato. Disol. DDAB
vesicular. Conc Mn: 4 – 4000 µg/L.
potable
[106] Fe(II)
Mn(II)
luminol-IO4
-
No No acidif. o -fenantrolin activador determ. Fe.
TEA agente complejante determ. Mn. Conc.
Fe: 0.003-0.1 µg/L. Mn: 0.005-0.1 µg/L.
Suelo,
potable
[86] Cr(III) luminol-H2O2 No H3PO4 en patrones/muestras pH=3.7. EDTA
10-4
M, portador carbonato 0.1 M y bromuro
0.3 M pH=10.8. Conc Cr: 0.5-500 µg/L.
grifo
[107] Cu(II) fenantrolina-
H2O2
No Patrones en HCl a pH=3. Muestras a pH=2.
Conc Cu: 0.006-0.45 µg/L.
marina
[88] Cr(III) luminol-H2O2 No EDTA 10-3
M en patrones/muestras.
Conc Cr: 5.2-5200 µg/L
natural
[108] Cr(III) luminol-H2O2 No Portador EDTA- CO3
-
pH 10.8. Muestras en
condic ácidas. Conc Cr: 0.5-50 µg/L.
río, grifo y
potable

121
En la bibliografía no existen referencias que estudien la influencia de las
condiciones de acondicionamiento de las muestras en la señal quimioluminiscente. En
este apartado, se estudia la señal quimioluminiscente directa producida por la reacción del
luminol-peróxido de hidrógeno catalizada por iones metálicos como Cr(III), Co(II),
Fe(II), Fe(III), Ni(II) y Mn(II) en función del protocolo de acondicionamiento de la
muestra. Se han evaluado muestras sin acidificar o acidificadas con HCl o HNO3, tanto en
estático como en flujo, y en presencia o ausencia de EDTA. No se ha utilizado ningún
procedimiento de preconcentración.
Señal QL de muestras no acidificadas (sin acondicionar)
Se estudió inicialmente la señal quimioluminiscente de patrones preparados en
agua ultrapura. La legislación especifica los niveles de concentración máximos
permitidos para los metales en estudio en: 200 µg/L para Fe, 20 µg/L para Ni, 2 mg/L
para Cu y 50 µg/L para Cr [40]. La composición de un agua natural en componentes traza
puede ser descrita por el material de referencia certificado SRM © 1640 (Tabla 53).
Tabla 53. Composición del material de referencia certificado SRM © 1640: agua dulce.
Fracciones de masa certificadas
Fracciones de masa de
referencia
El
em
ent
o
µµg/
Kg
Ele
men
to
µµg/
Kg
Elemento µµg/Kg
Aluminio 52.0 ± 1.5 Cobalto 20.28 ± 0.31 Cobre 34.3 ± 1.6
Antimonio 13.79 ± 0.42 Hierro 34.3 ± 1.6 Litio 27.89 ± 0.14
Arsénico 26.67 ± 0.41 Plomo 27.89 ± 0.14 Níquel 27.4 ± 0.8
Bario 148.0 ± 2.2 Manganeso 121.5 ± 1.1 Potasio 994 ± 27
Berilio 34.94 ± 0.41 Molibdeno 46.75 ± 0.26 Rubidio 2.00 ± 0.02
Boro 301.1 ± 6.1 Selenio 21.96 ± 0.51 Zinc 53.2 ± 1.1
Cadmio 22.79 ± 0.96 Plata 7.62 ± 0.25 Calcio 7.045 ± 0.089
Cromo 38.6 ± 1.6 Estroncio 124.2 ± 0.7 Magnesio 5.819 ± 0.056
Vanadio 12.99± 0.37 Silicio 4.73 ± 0.12
Sodio 29.35 ± 0.31
Talio* < 0.1
* Valor de Fracción de masa informativo.

122
Se midió inicialmente la quimioluminiscencia utilizando el sistema de inyección
en flujo. Ni(II) y Mn(II) dieron señales QL similares a las del blanco. Fe(II) y Fe(III)
solo dieron señales significativas a niveles superiores a los límites legislados (0.2 mg/l),
por lo que sería necesario utilizar un paso de preconcentración para aplicar el método a la
determinación de estos metales. Cr(III), Co(II) y Cu(II) dieron señales significativas para
su cuantificación.
Las curvas de calibrado doble-logarítmicas y en los intervalos lineales de
concentración, en las diferentes condiciones experimentales ensayadas, se muestran en la
Tabla 54. Se utilizó la altura de pico como señal analítica. El intervalo lineal de
concentraciones fue: para Cr(III) 3-15 µg/L, para Co 2-8 µg/L, y para Cu, hasta 20 µg/L.
En ausencia de EDTA, los límites de detección calculados para una relación señal/ruido
de 3, estuvieron entre 0.5-2 µg/L. Estos valores son similares a los que se obtienen
utilizando absorción atómica electrotérmica para elementos traza [109].
También se estudió el uso de EDTA como agente complejante de interferentes,
añadiéndolo a la muestra o al portador (tampón o KOH), de forma que el complejo metal-
EDTA se formaba antes o durante el sistema de flujo respectivamente. En presencia de
EDTA, se obtiene que la sensibilidad del Co(II) disminuye drásticamente. Para el Cu(II),
la señal desapareció completamente.
La sensibilidad del Cr(III) disminuyó al adicionar EDTA 0.01 M al portador,
como puede verse en la Tabla 54. Al utilizar EDTA 5· 10-3
M en el portador (tampón), se
observó que la sensibilidad para el Cr(III) era similar a la obtenida en ausencia de EDTA,
por lo que en estas condiciones, la sensibilidad se mantenía, y la reacción era además
selectiva para Cr(III).
Para el procedimiento en estático, las curvas de calibrado para Cromo y Cobalto
en presencia de EDTA 3· 10-3
M, se muestran en la Tabla 55. Como puede verse, la
sensibilidad del Cr resultó 3 veces superior a la del Co. Al adaptar el montaje FIA al
fluorímetro utilizado para las medidas en estático, la curva de calibrado que se obtuvo
para Cr fue: y = (0.07 ± 0.05) + (0.30 ± 0.02)· C (r2
= 0.997, sy/x = 0.07), por lo que la
pérdida de sensibilidad del procedimiento en flujo respecto al procedimiento en estático,
fue del orden del 60%.

123
muestras no acidificadas. Procedimiento en flujo.
Sin
EDTA
EDTA en la
muestra
EDTA en el
portador de KOH
(a)
EDTA en el
portador de
tampón(b)
Conc EDTA (M) - 1⋅⋅10-2
5⋅⋅10-3
1⋅⋅10-2
5⋅⋅10-3
1⋅⋅10-2
5⋅⋅10-3
Doble logarítmica
Cr(III) log a 1.82±0.06 2.4±1.7 1.5±0.6 2.2±1.5 1.84±0.03 1.9±0.7 2.32±0.03
a 66±9 247±54 32±4 163±34 69±5 99±6 211±16
b 1.32±0.06 0.4±0.1 1.14±0.06 0.65±0.09 1.16±0.03 0.95±0.03 0.92±0.04
r2
0.977 0.7086 0.9846 0.8284 0.9907 0.9926 0.985
n, sy/x 4, 0.0135 3, 0.208 3, 0.1090 4, 0.202 4, 0.0763 3, 0.0625 4, 0.1466
Co(II) log a 3.0±0.1 -0.6±1.2 -0.7±1.7 0.44±0.16 0.8±0.4 1.5±0.7 1.0±0.3
a 1009±121 0.27±0.06 0.21±0.02 2.7±1.0 6.8±2.6 32±5 10±2
b 0.70±0.08 1.53±0.05 1.51±0.02 1.08±0.08 0.82±0.08 0.62±0.03 0.86±0.04
r2
0.8941 0.9919 0.9442 0.9502 0.9112 0.9821 0.9825
n, sy/x 4, 0.1373 3, 0.0887 3, 0.162 4, 0.1406 4, 0.1466 3, 0.053 4, 0.065
Cu(II) log a 2.45±0.04 - - - - - -
a 265±34 - - - - - -
b 0.69±0.04 - - - - - -
r2
0.9809 - - - - - -
n, syx 4, 0.0682 - - - - - -
Intervalo Lineal
Cr(III) b0 108±77 115±50 -9±17 45±49 -17±32 30±19 6±44
b1 155±8 51±6 47±2 69±5 105±3 85±2 176±4
r2
0.9647 0.8943 0.9816 0.9327 0.9868 0.9937 0.9913
n, sy/x 5, 172.3 4, 111.6 4, 38.54 5, 110.62 5, 72.47 4, 42.62 5, 97.98
Co(II) b0 251±190 2.4±23 22±13 -19±33 19±18 87±31 37±17
b1 553±39 3.1±0.3 1.8±0.2 4.2±0.3 2.71±0.15 4.1±0.3 4.64±0.12
r2
0.9396 0.9166 0.9606 0.949 0.9604 0.9648 0.9899
n, sy/x 5, 425.76 3, 43.23 3, 103.35 5, 74.24 5, 41.79 4, 66.78 5, 35.56
Cu(II) b0 98±38 - - - - - -
b1 111±3 - - - - - -
r2
0.9972 - - - - - -
n, sy/x 5, 58.61 - - - - - -
(a) 0.02 mol/L KOH
(b) 0.3 mol/L CO3
2-
/HCO3
-
(pH=10.8)

124
Tabla 55. Parámetros analíticos de las curvas de calibrado de patrones no acidificados
utilizando el procedimiento en estático.
Metal Metal adicionado bo ±± sb0 b1 ±± sb1 syx R
2
n
Cr - 0.3 ± 0.6 0.75 ± 0.05 1.2 0.97 8
Co - -0.2 ± 0.7 0.24 ± 0.01 0.9 0.99 5
Co - -0.2 ± 1 0.27 ± 0.01 3 0.99 8
Co - -0.2 ± 0.6 0.26 ± 0.01 0.8 0.996 4
Cr 80 µg/L Co 19 ± 3 0.85 ± 0.11 3 0.98 3
Cr 100 µg/L Co 30.5 ± 0.3 0.77 ± 0.02 0.3 0.999 3
Cr 200 µg/L Co 53.1 ± 0.8 0.68 ± 0.16 3 0.95 3
Co 20 µg/L Cr 16 ± 2 0.26 ± 0.02 3 0.98 5
Co 20 µg/L Cr 15 ± 2 0.24 ± 0.04 2 0.97 3
Co 40 µg/L Cr 39 ± 3 0.23 ± 0.04 3 0.94 4
Señal QL de muestras acondicionadas con HCl 5· 10-3
M
Para el procedimiento en flujo, se evaluó la etapa de calibración en condiciones
ácidas con la adición de HCl 5· 10-3
M. Se estudió el efecto de la presencia de EDTA en el
portador o en la muestra obteniéndose un comportamiento similar al obtenido en muestras
no acidificadas. En la Tabla 56 se muestran los parámetros de calibración para los
diferentes modelos de calibración obtenidos en las diferentes condiciones experimentales.
Las sensibilidades alcanzadas fueron similares a las obtenidas en las condiciones
de no acidificación, obteniéndose límites de detección sin EDTA similares a los del
apartado anterior. En presencia de EDTA, la sensibilidad del Cr(III) se mantiene igual
que sin acondicionar; para el Cu(II) la señal quimioluminiscente desaparece; y para el
Co(II) la sensibilidad aumenta ligeramente respecto a los valores sin acondicionamiento
de HCl, alcanzándose límites de detección del orden de 50 µg/l.
Para el procedimiento en estático, las sensibilidades obtenidas para Cr y Co en
presencia de EDTA fueron 0.898 y 0.35 respectivamente. Estos valores fueron similares a
los establecidos en la Tabla 55, para muestras no acondicionadas.

125
muestras acidificadas con HCl 5· 10
-3
M. Procedimiento en flujo.
Sin
EDTA
EDTA en la muestra
EDTA en
portador-
KOH(a)
EDTA en portador-
Tampón(b)
Conc EDTA (M)
- 1⋅⋅10-2
5⋅⋅10-3
5⋅⋅10-3
1⋅⋅10-2
5⋅⋅10-3
Doble Logarítmica
Cr(III) log a 2.31±0.02 1.2±0.3 1.3±0.5 2.1±1.1 2.1±0.9 2.5±1.6
a 203±8 18±2 22±3 129±13 144±9 334±39
b 0.88±0.02 1.43±0.05 1.50±0.06 0.89±0.04 0.89±0.03 0.78±0.05
r2
0.9958 0.9913 0.9870 0.9747 0.9914 0.9574
n, s y/x 4, 0.0383 3, 0.217 3, 0.1312 4, 0.0979 4, 0.0628 4, 0.1122
Co(II) log a 2.99±0.03 1.0±0.7 -(0.8±1.4) 0.7±0.6 0.9±0.2 1.4±0.3
a 976±78 11±5 0.17±0.04 6±4 9±1 25±2
b 0.81±0.05 1.04±0.09 1.63±0.06 1.14±0.15 0.88±0.02 0.718±0.017
r2
0.9621 0.9442 0.9914 0.8595 0.9948 0.9939
n, s y/x 4, 0.0916 3, 0.162 3,0.0972 4, 0.263 4, 0.041 4, 0.0319
Cu(II) log a 3.06±0.04 - - - - -
a 1276±146 - - - - -
b 0.30±0.03 - - - - -
r2
0.8783 - - - - -
n, s y/x 4, 0.0744 - - - - -
Intervalo Lineal
Cr(III) b0 71±30 -15±22 -80±56 69±48 39±19 153±137
b1 144±3 54±3 90±6 93±5 106±2 184±14
r2
0.9938 0.9773 0.9528 0.9629 0.9963 0.9368
n, s y/x 5, 68.16 4, 49.72 4, 126.41 5, 108.95 4, 42.82 5, 275.59
Co(II) b0 374±184 79±55 -10±26 83±41 31±9 66±12
b1 613±37 11.1±0.8 3.4±0.4 9.6±0.6 5.33±0.13 6.55±0.18
r2
0.85354 0.9606 0.9095 0.9701 0.9955 0.9953
n, s y/x 5, 411.12 3, 103.35 3, 49.57 3, 77.97 3, 16.56 3, 20.27
Cu(II) b0 483±389 - - - - -
b1 131±27 - - - - -
r2
0.8185 - - - - -
n, s y/x 3, 606.64 - - - - -
(a) 0.02 mol/L KOH
(b) 0.3 mol/L CO3
2-
/HCO3
-
(pH=10.8)
Señal QL de muestras acondicionadas con HNO3 0.5 M
Se estudió la emisión quimioluminiscente en condiciones drásticas (HNO3 0.5M).
En estas condiciones y utilizando el procedimiento en flujo, las curvas de calibrado
obtenidas sin EDTA para Cr (III), Co(II) y Cu(II), dieron sensibilidades bastante peores
que en las anteriores condiciones de acondicionamiento (ver Tabla 57). Sin embargo, la
pendiente para el Cr(III), fue similar a la obtenida en patrones no acidificados o

126
acidificados con HCl, en presencia de EDTA 0.01M. Los límites de detección en ausencia
de EDTA calculados para una relación señal/ruido de 3, fueron: 3, 3.5 y 10 µg/L para
Cr(III), Co(II) y Cu(II) respectivamente.
muestras acidificadas con HNO3 0.5 M. Procedimiento en flujo.
Doble Logarítmico Intervalo Lineal
Cr(III) Co(II) Cu(II) Cr(III) Co(II) Cu(II)
log a 2.6 ± 1.6 2.8 ± 1.6 2.6 ± 1.6 b0 513 ± 29 484 ± 48 579 ± 15
a 455 ± 44 678 ± 43 367 ± 38 b1 60 ± 3 130 ± 10 9.1 ± 0.5
b 0.39 ± 0.05 0.35 ± 0.04 0.26 ± 0.03 r2
0.9619 0.9296 0.9717
r2
0.8799 0.8816 0.9143 n, sy/x 5, 66.33 5, 108.63 4, 31.80
n, sy/x 4, 0.0932 4, 0.0733 3, 0.040
Para el procedimiento en estático, se requirió la neutralización de la muestra. Los
mejores resultados se obtuvieron neutralizando con Na2CO3 0.2272M para una dilución
7/10 de las muestras. Las señales QL para Cr y Co en estas condiciones, se muestran en
la Figura 46. Las curvas de calibrado para Cr y Co fueron diferentes a las obtenidas en
las condiciones anteriores:
Cr (III): y = (-0.4 ± 0.2) + (0.38 ± 0.01)⋅CCr (r2
=0.99, syx=1.5)
Co (II): y = (-0.2 ± 0.2) + (0.54 ± 0.01)⋅CCo (r2
=0.99, syx=0.1)
Figura 46. Señales quimioluminiscentes para Cr, Co y Material Estándar de Referencia
(SRM © 1640). Procedimiento en estático.
0
10
20
30
40
50
Cr (III) (ng/ml)
Co(II) (ng/ml)
SRM
0
15
27
45
65
85
20
60
80
0

127
Aplicabilidad
La señal quimioluminiscente variaba en función del protocolo de
acondicionamiento de la muestra y de la presencia de agente enmascarante, aunque esta
influencia era mínima para el Cr(III). Añadiendo EDTA se obtuvo especificidad para la
determinación de Cromo, sin que se requiriera neutralización al utilizar el procedimiento
en flujo. Según las condiciones experimentales seleccionadas, la reacción resultó
selectiva para la determinación de Cr(III), o bien se puede evaluar la contribución total de
Cr, Co y Cu. En la Figura 47, se muestran las pendientes obtenidas para cada uno de los
metales estudiados en las diferentes condiciones ensayadas utilizando el procedimiento en
flujo. El método en estático requirió la adición de Na2CO3 al acondicionar las muestras en
condiciones ácidas drásticas (HNO3 0.5M).
Figura 47. Pendiente de la curva de calibrado en el intervalo lineal en las diferentes
condiciones experimentales. 1: Sin acondicionar; 2: HCl 5· 10-3
; 3: HNO3 0.5; 4: EDTA 10-2
; 5:
EDTA 1· 10-2
, HCl 5· 10-3
; 6: EDTA 5· 10-3
; 7: EDTA 5· 10-3
, HCl 5· 10-3
; 8: EDTA 10-2
(portador
KOH); 9: EDTA 10-2
(portador tampón); 10: EDTA 5· 10-3
(portador KOH); 11: EDTA 5· 10-3
(portador tampón); 12: EDTA 10-2
(portador tampón), HCl 5· 10-3
; 13: EDTA 5· 10-3
(portador
KOH), HCl 5· 10-3
; 14: EDTA 5· 10-3
(portador tampón), HCl 5· 10-3
. Concentración: mol/L.
Para estudiar la señal quimioluminiscente total, se llevaron a cabo varias
experiencias, con la intención de evaluar la aditividad de las señales en las diferentes
condiciones estudiadas. Se estudiaron mezclas binarias y terciarias de los tres metales
almacenados en condiciones ácidas y no ácidas (ver parte experimental en el Apéndice 8,
[78]). Las mezclas dieron porcentajes de recuperación de señal próximos al 100%
(Figura 48), demostrándose así la aditividad entre las señales de los tres metales tanto en
estático (mezclas s1, s2, s3, s4) como en flujo (mezclas s5, s6, s7, s8, s9, s10, s11, s12,
s13, s14, s15, s16).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Acondicionamiento de la muestra
b(L/mg)
Cr
Co
Cu

128
Figura 48. Porcentajes de recuperación de señal para diferentes mezclas de metales.
Además, para el procedimiento en estático, se realizó un diseño experimental 52
de mezclas de patrones. El test t demostró que las pendientes de las curvas de calibrado
de Cr(III) obtenidas en presencia de diferentes concentraciones de Co(II) eran similares
con un nivel de confianza del 95%. Los mismos resultados se obtuvieron al aplicar el test
t para la comparación de curvas de calibrado de Co(II) en presencia de Cr(III). Algunas
de estas ecuaciones de calibración se muestran en la Tabla 55. Los valores de pendiente
para las mezclas son similares a los del elemento traza solo. Por tanto, la señal total puede
considerarse como la suma de las señales individuales de Cr y Co.
Para las mezclas de calibración utilizando el procedimiento en flujo, se hizo un
estudio similar, y en todos los casos, el test t demostró que no había diferencias
significativas entre las pendientes de calibración a un nivel de confianza del 95%.
Se estudió el material de referencia certificado (SRM © 1640) de agua dulce
conservado en condiciones de HNO3 0.5M. Los contenidos en metales se han dado
previamente en la Tabla 53. En la Figura 46, aparece la señal analítica obtenida para el
material de referencia certificado utilizando el procedimiento en estático. Al igual que en
los patrones, se le añadió Na2CO3. El porcentaje de recuperación respecto a una mezcla
de Cr y Co preparada en las mismas condiciones que el material de referencia certificado
fue cercano al 100% (Figura 49), por lo que únicamente estos dos elementos contribuían
a la señal analítica total. Principalmente, la señal se debía al Cromo, porque la
concentración del Co considerando una dilución 7/10 era cercana al límite de detección.
Utilizando el procedimiento en flujo, se podía cuantificar Cr añadiendo EDTA
0.01 M, o bien la contribución total de Cr, Co y Co en ausencia del complejante. Para
determinar Cr, se podía utilizar patrones en condiciones ácidas o no ácidas para procesar
muestras acondicionadas en diferentes condiciones. Esto puede observarse a partir de los
0
20
40
60
80
100
120
140
s-1
s-2
s-3
s-4
s-5
s-6
s-7
s-8
s-9
s-10
s-11
s-12
s-13
s-14
s-15
s-16
Mezclas
Porcentajederecuperación
Cu
Co
Cr

129
valores de sensibilidad y de los resultados obtenidos para el SRM © 1640 mostrados en la
Figura 49. Sin EDTA, los patrones y muestras han de estar en las mismas condiciones
para obtener resultados exactos. En la Figura 49 se demuestra que se obtuvieron los
mismos resultados para el SRM © 1640 y para una mezcla de Cr, Co y Cu preparada en
HNO3.
Figura 49. Porcentajes de recuperación del SRM © 1640 respecto a mezcla de patrones en
diferentes condiciones experimentales.
Conclusiones
Se estudió la señal quimioluminiscente para diferentes protocolos de
acondicionamiento de muestras. Además se hizo un estudio paralelo de la selectividad. Se
calcularon los modelos de calibración para cada uno de los protocolos de
acondicionamiento. Los estudios de recuperación mostraron la aditividad de las señales
para diferentes condiciones. La selectividad, exactitud y precisión se evaluaron utilizando
un material de referencia certificado.
Se propuso una guía para la determinación de metales basada en la señal
quimioluminiscente. El procedimiento de acondicionamiento de muestras y patrones se
elegiría de acuerdo con la estrategia de muestreo, los objetivos de análisis (uni- o
multielemental) y las necesidades de acondicionamiento. Por tanto, los métodos
quimioluminiscente en estático o en flujo, pudieron aplicarse satisfactoriamente al
análisis de aguas naturales acondicionadas en diferentes condiciones.
En presencia de EDTA, fue posible la determinación selectiva de Cr(III) en aguas
naturales. La determinación de Cr(III) no dependió del protocolo de acondicionamiento
cuando se trabajó en flujo. Por tanto, se pueden utilizar patrones preparados en agua para
procesar muestras preparadas en diferentes condiciones si se utiliza como portador EDTA
0.01 M. Al utilizar el método en estático, el pH de la muestra debe controlarse añadiendo
Na2CO3.
0
20
40
60
80
100
120
140
SinEDTA
EDTA
EDTA
EDTA
SinEDTA
Porcentajederecuperación(%)
FI
no acidif.
FI
adic.-HCl
FI
adic.-HNO3
FI
adic.-HNO3
estático
adic.-HNO3

130
2.2.1.3. CALIBRACIÓN MULTIVARIADA APLICADA A LA DETERMINACIÓN
QUIMIOLUMINISCENTE SIMULTÁNEA DE COBALTO Y CROMO.
En la bibliografía se encuentran numerosos métodos analíticos propuestos para la
determinación de cromo y/o cobalto, como la electroforesis capilar [110], NAA [111],
XRF [112-113], AAS[114-115], ICP-AES [116], o ICP-MS [112,117].
Se han propuesto diferentes estrategias para la determinación selectiva o
simultánea de iones metálicos utilizando la reacción quimioluminiscente del luminol. En
los sistemas de inyección en flujo, se han utilizado pre-tratamientos o procedimientos de
separación. Se ha publicado el uso de agentes enmascarantes [104], separadores de
membrana [118] o resinas de intercambio iónico [119]. Para la determinación simultánea
de varios metales se ha propuesto la cromatografía iónica con detección
quimioluminiscente [120,81]. Sin embargo, en este caso, la limitación es la
incompatibilidad de la fase móvil con las condiciones de reacción requeridas para la
reacción postcolumna [93].
Se han resuelto mezclas de compuestos orgánicos [121-122] y de iones metálicos
[123-124] por calibración multivariada y/o la técnica de eliminación de interferentes. El
método de mínimos cuadrados parciales (PLS) se ha aplicado a la determinación
simultánea de mezclas de compuestos en muestras de agua.
En este apartado, se estudia un modelo de mínimos cuadrados parciales (PLS)
para la determinación simultánea de Cr(III) y Co(II) en muestras de agua, registrando en
estático la curva cinética, y construyendo diferentes modelos a partir del conjunto de
medidas señal-tiempo. La capacidad de predicción se ha evaluado utilizando disoluciones
patrón, y el modelo ha sido validado en la determinación de concentraciones de Cr(III) y
Co(II) en un material de referencia certificado de agua natural.
Más información acerca de las condiciones experimentales, se refleja en el
Apéndice 9 [125].
Estudio de la señal quimioluminiscente
Cuando se trabaja en estático, la emisión quimioluminiscente del sistema
luminol/H2O2 describe una curva de respuesta Intensidad frente al Tiempo de primer
orden [126]: formación y destrucción del emisor de luz (3-aminoftalato en este caso). La
velocidad de reacción aumenta con la concentración de diferentes iones metálicos.
La curva de respuesta depende de factores experimentales como el pH o la
velocidad de mezclado [127], pero su influencia se evitó manteniéndolos constantes.
También depende del metal presente en la disolución, siendo Cr y Co los metales que
contribuyen principalmente a la señal quimioluminiscente en las condiciones estudiadas,
tal como se demuestra en el capítulo anterior. La contribución de otras especies se
consideró despreciable.

131
En la Figura 50, se muestran los perfiles Intensidad-Tiempo para patrones de 20,
40, 60 y 80 ìg/l de Cromo y las mismas concentraciones de Cobalto. Son perfiles
normalizados, en los que se da el valor de 1 al máximo de emisión. Se observó que para
ambos metales el perfil de formación del emisor quimioluminiscente (aumento de la señal
QL) fue similar, por lo que en los modelos descritos posteriormente, se estudió la
posibilidad de eliminar del conjunto de calibración las 15 primeras variables,
correspondientes a esta región de formación del emisor quimioluminiscente. Por otra
parte, el perfil de destrucción del emisor (disminución de la señal QL) fue diferente en
función del metal estudiado: para el Cr la destrucción era más rápida que para el Co. Los
perfiles obtenidos fueron robustos, siendo el comportamiento descrito independiente de la
concentración del metal en la disolución.
Figura 50. Perfiles normalizados Intensidad-Tiempo para Cr y Co.
Evaluación de los modelos de calibración
Se estudiaron 2 opciones como variables predictoras: el registro completo (62
variables) o la región de destrucción (46 variables). Se ensayaron los modelos PLS-1 y
PLS-2.
Además, los modelos se obtuvieron trabajando en dos condiciones de calibración
diferentes: utilizando el intervalo lineal de concentraciones (0-20 ìg/l Cr, 0-80 ìg/l Co)
para el cual se evaluó la aditividad de las señales producidas por ambos metales; o
utilizando intervalos de concentraciones en que la respuesta no era lineal (0-80 ìg/l Cr, 0-
80 ìg/l Co).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (s)
SeñalQLnormalizada
Cr
Co
15 variables 46 variables
Región de
formación
Región de
destrucción

132
S Respuesta lineal
Se utilizaron dos aproximaciones para evaluar la aditividad de la señal:
Aproximación empírica-teórica:
El conjunto de calibración se compone de registros bicomponentes teóricos, que
se obtuvieron a partir de los registros unicomponentes experimentales. Se representó la
señal frente a la concentración del metal para cada tiempo, deduciéndose valores de
pendientes en función del tiempo para los dos metales estudiados. Los registros
bicomponentes teóricos (pendiente de la mezcla-tiempo), se dedujeron de la suma de las
pendientes de los dos metales en cada tiempo. A la suma de las pendientes se añadió un
error heterocedástico aleatorio simulado, de la misma magnitud que la reproducibilidad
de la señal. En la Figura 51, se muestran los perfiles descritos.
Figura 51. Perfiles experimentales Pendiente-Tiempo para Cr y Co, y perfil teórico de la
mezcla incluyendo el error heterocedástico.
Aproximación empírica:
El conjunto de calibración se compone de registros unicomponentes
experimentales.
En ambas aproximaciones, se obtuvieron modelos de PLS-1 y PLS-2 con 61 y 46
variables, obteniéndose porcentajes de varianza explicada cercanos al 99% en la mayoría
de los casos, utilizando modelos de 2 componentes principales, y con errores de
predicción bajos. Los datos obtenidos en cada caso se muestran en la Tabla 58.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 2 4 6
Tiempo (s)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Pendiente Co
Pendiente Cr
Mezcla + Ruido
Pendiente
Señalmezcla

133
Tabla 58. Modelos PLS en el intervalo lineal.
% Varianza Explicada
RMSEP
calibración
RMSEP
validación
Variables VL*
Bloque X
Bloque Y
Cr
Bloque Y
Co
Cr Co Cr Co
1-61 2 98.70 99.88 99.90 0.8 2.7 1.7 4.9
PLS-1
16-61 2 99.92 94.22 99.71 5.9 7.6 6.4 11.4
1-61 2 98.70 99.89 0.8 2.7 1.7 4.9
Aprox.
Empírica-
Teórica PLS-2
16-61 2 99.92 99.36 6.0 7.5 6.7 11.2
1-61 2 99.98 99.98 99.99 1.5 4.3 2.7 7.7
PLS-1
16-61 2 99.99 95.65 99.58 6.2 9.3 7.7 12.5
1-61 2 99.98 99.99 1.5 4.3 2.7 7.7
Aprox.
Empírica
PLS-2
16-61 2 99.99 99.35 6.2 9.3 7.7 12.4
*VL: Variables latentes.
En ambas aproximaciones, se confirmó la aditividad de las señales
quimioluminiscentes de Cr y Co, libre de efectos sinérgicos. La robustez de los modelos
obtenidos se demostró por la similitud entre los errores de predicción utilizando el
conjunto de calibración o el de validación. Los errores de predicción fueron menores al
utilizar las 61 variables.
Con estos resultados, se concluyó que la predicción de mezclas de Cr y Co es
posible cuando se trabaja en el intervalo lineal de concentraciones, utilizando como
conjunto de calibración los registros de disoluciones unicomponentes o los registros
bicomponentes simulados.
S Respuesta no lineal
Se partió de registros unicomponentes y bicomponentes de Cr y Co en el
intervalo de concentraciones de 0-80 ìg/l. Se aplicó PLS-1 y PLS-2 a este conjunto de
calibración, tomando como Bloque X la señal QL a cada tiempo (61 o 46 variables), y
como Bloque Y las concentraciones de Cr y Co.
El gráfico de las puntuaciones para las dos primeras componentes principales del
modelo (Figura 52 B), presenta una distribución similar al diseño experimental (Figura
52 A), pero la forma cuadrada se pierde un poco debido a que el primer factor también
describe la contribución no lineal. Como puede observarse, el primer factor está
relacionado con la concentración de Cromo, y el segundo factor está relacionado con la
concentración de Cobalto.

134
Figura 52. A) Diseño experimental 52
. B) Gráfico de puntuaciones con las dos primeras
CPs.
El hecho de tener una relación señal-concentración no lineal, llevó a la obtención
de modelos de 4 componentes principales cuando se trabajó con las 61 variables, y
modelos de 3 componentes principales cuando se trabajó con 46 variables, tal como
puede observarse en la Tabla 59.
Tabla 59. Modelos de PLS en el intervalo no lineal.
PLS-1 PLS-2
Variables 1-61 16-61 1-61 16-61
Variables latentes (VL) 4 3 4 3
Bloque X 99.93 99.94 99.93 99.92
Bloque Y Cr 92.81 95.97
% Varianza
Explicada
Bloque Y Co 78.62 96.24
85.14 95.46
Cr 7.6 5.7 7.5 6.5RMSEP
Calibración Co 13.1 5.5 13.5 5.5
Cr 10.6 7.4 10.5 7.4RMSEP
Validación Co 18.0 7.5 17.8 8.4
Los porcentajes de varianza explicada fueron mejores al utilizar el modelo de 46
variables, proporcionando asimismo menores errores de predicción. La selección previa
de variables con información selectiva proporciona modelos de PLS con menor número
de factores y una capacidad de predicción similar.
Los errores de predicción para los conjuntos de calibración y validación fueron
similares, remarcando la robustez del modelo. Con esto, se concluyó que la determinación
simultánea de Cromo y Cobalto era posible en el intervalo de concentraciones estudiado.
0
20
40
60
80
0 20 40 60 80
Concentración Cr (µ g/l)
ConcentraciónCo(g/l)
A)
00 40
04 44
-3
-2
-1
0
1
2
3
-100 -50 0 50 100
CP1
CP2
Cr
Co
B)
00
04
44
40

135
Validación
Para validar el modelo, se utilizó un material de referencia certificado de agua
dulce SRM © 1640, que contenía además de Cromo y Cobalto, otras especies que se
encuentran habitualmente en muestras de agua (ver Tabla 53, Pág. 121).
El modelo de calibración se construyó a partir de los registros
quimioluminiscentes de disoluciones unicomponentes, preparadas en las mismas
condiciones que el material de referencia certificado (en ácido nítrico). Las características
para los diferentes modelos obtenidos, se muestran en la Tabla 60.
Tabla 60. Modelos de PLS en condiciones ácidas.
% Varianza Explicada
RMSEP
Calibración
RMSEP
Validación
Modelo Variables VL
Bloque
X
Bloque
Y-Cr
Bloque
Y-Co
Cr Co Cr Co
1-61 4 99.94 99.94 99.80 0.7 1.2 2.6 4.6
PLS-1
16-61 3 99.93 99.94 96.63 0.7 5.1 4.1 10.3
1-61 4 99.94 99.47 1.7 2.3 3.4 5.6
PLS-2
16-61 3 99.94 99.47 0.9 5.6 4.4 10.1
Los porcentajes de varianza explicada fueron cercanos al 100%, tanto utilizando
modelos de PLS-1 como de PLS-2, y para los modelos con 46 variables, el número de
variables latentes del modelo fue menor que utilizando las 61 variables, pero los errores
de predicción tanto de calibración como de validación fueron mayores. Para el Co, es
preferible utilizar elmodelo de 61 variables.
El estudio de mezclas de Cr/Co en estas condiciones, dio las rectas de valor
predicho frente a valor real que se muestran en la Tabla 61. En cualquier caso, la
pendiente resultó estadísticamente igual a 1 y la ordenada estadísticamente igual a 0, lo
que indicaba que los modelos propuestos eran buenos para la determinación simultánea
de Cr y Co en condiciones ácidas.
Tabla 61. Rectas de regresión lineal Valor Predicho frente a Valor Real.
Predicho frente a medido
Modelo Analito
a b R2
sy/x
PLS-1 Cr 0 ± 2 0.98 ± 0.07 1.0 3.3
Co -2 ± 6 0.9 ± 0.2 0.9 8.8
PLS-2 Cr 0 ± 2 0.98 ± 0.07 1.0 3.4
Co 0 ± 4 0.94 ± 0.15 0.9 6.5
La concentración predicha para Cr y Co en el material de referencia certificado
utilizando los modelos propuestos (Tabla 62), fue comparada con los valores certificados
mediante un test t con un nivel de probabilidad del 95%, obteniéndose resultados

136
similares al utilizar el registro completo (61 variables), quedando la exactitud del método
validada.
Tabla 62. Predicción para el material de referencia certificado (µg/L, n=5).
Concentración (µµg/L) t calculado*
Variables VL
Cr Co Cr Co
Referencia - - 38.6 ± 1.6 20.28 ± 0.31 - -
PLS-1 1-61 4 32 ± 7 21 ± 7 -2.4 0.3
16-61 4 (35 ± 2) (11 ± 6) (5.7) (-3.1)
PLS-2 1-61 3 31 ± 7 25 ± 9 -2.1 1.0
16-61 3 (36 ± 2) (12 ± 5) 2.5 (-3.8)
*t tabulado (95%, 4) = 2.776.
Este material de referencia certificado sirvió además para demostrar que la
contribución a la señal QL viene dada principalmente por los dos metales estudiados,
siendo despreciable la interferencia de los demás metales presentes, como ha sido
demostrado en el capítulo anterior.
Con este estudio, se demostró la robustez de las señales quimioluminiscentes y se
propuso y validó un método capaz de predecir concentraciones de Cromo y Cobalto en
muestras de agua evitando la interferencia de otros elementos.
Conclusiones
En este capítulo, se utilizó el PLS para modelizar la respuesta quimioluminiscente
en función del tiempo. Con ello, se hizo posible la determinación simultánea y selectiva
de dos metales (cromo y cobalto) en muestras de agua.
Se ensayaron diferentes diseños experimentales para evaluar la aditividad entre
las señales y la relación no-lineal entre la respuesta y la concentración. El conjunto de
calibración se seleccionó en base a dos criterios: disoluciones de patrones
unicomponentes y/o bicomponentes y pendiente calculada a partir de los diferentes
calibrados lineales univariados. También se estudió la selección de las variables
predictoras. En todos los casos se obtuvieron buenos resultados, aunque los mejores
resultados correspondieron a la utilización del registro completo (aumento y disminución
de la señal quimioluminiscente).
El método se validó utilizando mezclas de patrones y un material de referencia
certificado. Este método presentó las ventajas de su bajo coste, respuesta rápida y no
requiere personal cualificado. Estas características son muy útiles para la monitorización
de Cr y Co en análisis de aguas.

137
Las novedades que aporta esta publicación frente a otras publicaciones existentes
consisten en que:
§ Se ha demostrado la robustez de los perfiles intensidad-tiempo.
§ Es la primera aplicación de estos perfiles intensidad-tiempo en calibración
multivariada para el análisis quimioluminiscente simultáneo de dos especies. Otras
publicaciones utilizan registros intensidad-longitud de onda obtenidos a partir de
dispositivos especiales (DDC) para determinar un analito [128-129].
§ Se han validado los resultados con un material de referencia certificado.

138
1.2. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO ORGÁNICO AMINO Y
AMONIACAL.
El Nitrógeno es un nutriente clave en aguas naturales, pero los vertidos de
nitrógeno en exceso puede causar procesos de eutrofización de las aguas. Las especies
dominantes de nitrógeno en las aguas son: el nitrógeno inorgánico disuelto (amonio,
nitrito y nitrato), el nitrógeno orgánico disuelto (la fracción más importante está
constituida por aminoácidos y péptidos, y se le denomina habitualmente N-amino), el
Nitrógeno particulado orgánico (debido a pequeños organismos: algas, bacterias) y el
particulado inorgánico [130]. La presencia de Nitrógeno Orgánico Disuelto (DON) en
aguas naturales es en gran medida debido a procesos biológicos autóctonos.
Adicionalmente, las fuentes externas de DON provienen de aguas residuales industriales,
migraciones terrestres o deposición atmosférica [131]. La concentración de DON en
aguas se ha ignorado durante mucho tiempo. Su medida resulta dificultosa y su carácter
químico se ha descrito escasamente. Esto, unido a que se supone biológicamente inerte,
pueden ser las causas [131].
Existen buenos procedimientos analíticos para cuantificar el nitrógeno inorgánico
disuelto (DIN) y el nitrógeno disuelto total (TDN), pero no para el Nitrógeno orgánico
disuelto, tal como se ha mencionado anteriormente. El más utilizado es el método
Kjeldahl [132-135], debido a que es el de referencia establecido por la Directiva Europea
[40] relativa a los métodos de medida en el análisis de aguas superficiales. El método
Kjeldahl se desarrolló específicamente para el nitrógeno proteico, y algunos autores han
indicado la recuperación incompleta del nitrógeno para algunos compuestos [136-137].
Este método proporciona el contenido de Nitrógeno orgánico disuelto y amonio.
En otros protocolos el DON se calcula como la diferencia entre las medidas
independientes del TDN y el DIN, pero estos métodos son incluso más largos en tiempo
que el método de Kjeldahl. Los principales métodos para la determinación del TDN son:
la oxidación alcalina con persulfato o la fotooxidación-UV a nitrato y los métodos de
combustión oxidativa a NO [131,136].
Se han publicado algunos trabajos comparando varios de estos métodos [131,138-
139], pero se necesita todavía mucho más trabajo para mejorar la exactitud de los
resultados de los métodos para el DON y reducir el tiempo y/o la dificultad de la técnica.
En esta parte de la Tesis, se ha profundizado en el estudio del Nitrógeno Orgánico
en dos direcciones:
§ En una primera parte, se han demostrado las ventajas del método fluorimétrico de
OPA/NAC frente al Nessler para la determinación de amonio después de la digestión
Kjeldahl, además de demostrar que puede estimar directamente amonio y aminas
primarias.
§ En la segunda parte, se propone un método quimioluminiscente que puede evaluar el
nitrógeno orgánico mayoritario total de forma rápida y automática.

139
2.2.2.1. MÉTODO FLUORIMÉTRICO DE ROTH MODIFICADO PARA
MUESTRAS DE AGUA: DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE AMONIO Y
GRUPOS AMINO PRIMARIO Y SU UTILIDAD EN LA DETERMINACIÓN DEL
NITRÓGENO KJELDAHL TOTAL.
El amonio es un micronutriente en los sistemas acuosos, y tiene un papel
fundamental en el ciclo del nitrógeno de los ecosistemas acuáticos. Sin embargo, su
determinación todavía es una tarea delicada, debido a su susceptibilidad a la
contaminación, y a que los métodos clásicos no parecen estar bien controlados en la
mayoría de los laboratorios [140]. Habitualmente, el amonio se encuentra junto a aminas
alifáticas de cadena corta (principalmente metilamina), debido a que estas se hallan
ampliamente distribuidas en el medioambiente. Los límites tolerables para aminas se
regulan como el Nitrógeno Kjeldahl Total (que incluye amonio y Nitrógeno Orgánico),
siendo los valores habituales entre 15 y 85 mg/L para aguas residuales, y 1 mg/L para
agua de grifo.
La cromatografía líquida combinada [10] o no con derivatización [141], se utiliza
generalmente para el análisis de amonio y aminas alifáticas en medio acuoso. En la
bibliografía no se encuentran métodos UV-VIS o fluorimétricos libres de errores
sistemáticos que puedan utilizarse como métodos de screening de muestras para reducir
costes y tiempo de análisis en el laboratorio medioambiental, o para determinaciones in
situ. El método fluorimétrico de Roth [142-144] para la determinación de aminas
primarias utilizando como reactivos derivatizantes un tiol y el o-ftaldialdehido (OPA),
podría adaptarse a la determinación de amonio y grupos amino primario totales.
Aprovechando la respuesta selectiva de amonio con el reactivo OPA-NAC a 415 nm, que
se ha demostrado en el Punto 2.1.2.1 del Capítulo 2-Resultados de esta Tesis (Apéndice
4, [55]), y que nuestro grupo de investigación ha publicado recientemente la
determinación de grupos amino primario en muestras de agua llevando a cabo la
derivatización de las aminas en cartuchos C18 y utilizando el reactivo OPA-NAC
[145,37] y 333 nm como longitud de onda de excitación, se estudió en este trabajo la
determinación simultánea de amonio y metilamina, como compuesto modelo de los
grupos amino primario, utilizando el reactivo OPA-NAC como agente derivatizante,
excitando a dos longitudes de onda 415 nm y 333 nm, y empleando una metodología de
calibración tanto bivariada como multivarida (regresión en componentes principales).
El método se aplicó a patrones antes y después del tratamiento Kjeldahl, siendo
un buen indicador del nitrógeno amino primario presente en la muestra o un buen método
para amonio después del tratamiento Kjeldahl, y también un buen indicador de fallos en
el tratamiento de digestión Kjeldahl utilizado para la conversión a amonio de los grupos
amino primario. El método se aplicó al análisis de muestras de agua reales, y los
resultados se compararon con los obtenidos al aplicar el método de referencia de Nessler.
Más información acerca de las condiciones experimentales, se refleja en el
Apéndice 10.

140
Etapa de calibración
De acuerdo con el trabajo previo del grupo de investigación [145], los patrones de
MA, EA, N-PrA, IPA, BA, PeA, HA y β-FEA, proporcionaron respuestas similares entre
ellos al expresar la concentración en mg/L de Nitrógeno, con porcentajes de recuperación
respecto a la señal de la MA de 100, 93.5, 101.1, 93.4, 89, 100.4, 108.2 y 99 %
respectivamente. La aditividad entre la señal de diferentes aminas se evaluó analizando
mezclas de estas. Los porcentajes de recuperación fueron entre el 81-88 %. Con estos
resultados se demostró que la respuesta de las aminas en la reacción con OPA-NAC, no
dependía de la amina primaria, y se podía utilizar la MA como compuesto modelo.
Para estudiar la determinación simultánea de amonio y aminas primarias (MA),
se empleó el diseño experimental 52
que se muestra en la Tabla 63. Tanto el amonio
como la amina primaria proporcionaban una señal fluorescente a ëexc = 333 nm / ëem =
450 nm, aunque el máximo de emisión para el amonio se situaba a 462 nm (Figura 53).
Tabla 63. Código y concentración del conjunto de patrones de calibración (diseño 5
2
).
NH4
+
MA
(mg/L)
0 0.25 0.375 0.5 0.625
0 00 01 02 03 04
0.25 10 11 12 13 14
0.75 20 21 22 23 24
1.25 30 31 32 33 34
1.75 40 41 42 43 44
No hubo diferencias significativas a un nivel de confianza del 95% (varianza
homogénea, Fcalc < Ftab, α=0.05 , y pendientes comparables, tcalc < ttab, α=0.05 ) entre las curvas
de calibrado de amina obtenidas en presencia de diferentes concentraciones de amonio
constante variado de 0 a 1.75 mg/L (Tabla 64). Las pendientes medias obtenidas a 450
nm para amina y amonio fueron 6532 (s= 472, n= 5) y 1038 (s= 127, n= 5), y expresando
la concentración en mg/L de N, 2950 (s= 213, n= 5) y 855 (s= 104, n=5),
respectivamente. Estos valores indican que el isoindol de amina es 3.5 veces más sensible
que el isoindol de amonio cuando se trabaja excitando a 333 nm y midiendo la emisión a
450 nm.

141
Figura 53. Espectros de emisión de fluorescencia para patrón de NH4
+
de 1.75 mg/L (a λexc
=333 nm y a λexc=415 nm) y patrón de MA de 0.375 mg/L (a λexc=333 nm y a λexc=415 nm).
En la Figura 53, se muestran los registros obtenidos para amonio y metilamina
excitando a 415 nm. Para la amina se obtuvo una señal similar al blanco (de acuerdo con
el Punto 2.1.2.1 del Capítulo 2-Resultados de esta Tesis) , mientras que para el amonio se
obtuvo un máximo de emisión de fluorescencia a 485 nm. Como puede verse en la Tabla
64, a la longitud de onda selectiva para amonio, λexc = 415 nm (λem= 485 nm), se obtuvo la
misma curva de calibrado en presencia o ausencia de amina. Para las diferentes
cantidades de amina ensayadas, las ordenadas fueron similares a la obtenida con la curva
de calibrado de patrones de amonio, debiéndose su contribución al blanco de reactivos.
La curva de calibrado de amonio a 485 nm, así como las ecuaciones de calibración de
amonio y de amina a 450 nm, excitando a 415 y a 333 nm respectivamente, se necesitan
para la estimación de ambos analitos.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
380 430 480 530 580
λλ (nm)
Fluorescencia
MA
λexc = 333 nm
NH4
+
λexc = 333 nm
NH4
+
λexc = 415 nm
MA
λexc = 415 nm

142
Conclusión2
-
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
-
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
-
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
Pendientes
Similares
ttab
αα=0.05
-
2.36
2.31
2.31
2.36
-
2.57
3.18
2.78
4.30
-
2.57
2.78
2.78
2.78
tcalc
-
0.18
0.63
0.63
2.02
-
0.74
1.40
1.06
0.48
-
0.37
0.94
0.79
1.04
Conclusión1
-
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
-
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
-
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Varianzas
Homogéneas
Ftab
αα=0.05
-
8.43
14.89
14.89
39.30
-
12.22
38.51
17.44
647.79
-
39.17
39
39
39
Fcalc
-
3.33
2.03
7.49
13.65
-
3.34
1.84
3.89
2.04
-
1.59
1.18
1.49
2.04
Curvadecalibrado
Y=(a±sa)+(b±sb)·C(n,r2
,sy/x)
Y=(900±300)+(7000±600)·C
(7,0.9663,300)
Y=(1400±500)+(6800±1100)·C
(4,0.9528,300)
Y=(1810±170)+(6500±500)·C
(5,0.9883,200)
Y=(2100±90)+(6600±200)·C
(5,0.9969,100)
Y=(2840±50)+(5760±160)·C
(4,0.9985,60)
Y=(900±300)+(1200±200)·C
(3,0.9698,150)
Y=(2500±110)+(1050±120)·C
(6,0.9511,190)
Y=(3570±180)+(860±160)·C
(4,0.9342,200)
Y=(4000±110)+(980±110)·C
(5,0.9630,170)
Y=(4200±400)+(1100±300)·C
(3,0.9196,400)
Y=(110±50)+(680±40)·C
(4,0.9942,50)
Y=(110±50)+(660±50)·C
(5,0.9853,70)
Y=(90±40)+(640±30)·C
(4,0.9943,50)
Y=(110±30)+(640±30)·C
(4,0.9956,40)
Y=(110±30)+(640±30)·C
(4,0.9967,40)
Analitos
MA
MA+
0.25mg/lNH4
+
MA+
0.75mg/lNH4
+
MA+
1.25mg/lNH4
+
MA+
1.75mg/lNH4
+
NH4
+
NH4
+
+
0.25mg/lMA
NH4
+
+
0.375mg/lMA
NH4
+
+
0.5mg/lMA
NH4
+
+
0.625mg/lMA
NH4
+
NH4
+
+
0.25mg/lMA
NH4
+
+
0.375mg/lMA
NH4
+
+
0.5mg/lMA
NH4
+
+
0.625mg/lMA
λλexc(nm)
333
333
333
333
333
333
333
333
333
333
415
415
415
415
415
Tabla64.Parámetrosanalíticosyresultadosestadísticosdemetilaminaenpresenciadecantidadesvariablesdeamonio,yamonioenpresencia
decantidadesvariablesdemetilamina.

143
Los espectros de emisión obtenidos excitando a 415 y 333 nm para los patrones
(Tabla 63), se procesaron utilizando regresión en componentes principales (PCR) para
desarrollar un modelo multivariado para amonio y amina respectivamente. Para llevar a
cabo la etapa de calibración, se emplearon la Selección Top Down (TDS) y la selección
del mejor Sub-Conjunto (BSS) [146]. Los modelos de PCR se obtuvieron utilizando los
datos (centrados) como bloque-X. El número de variables, el porcentaje de varianza
explicada, el número de componentes y la media cuadrática de los errores de predicción
(RMSECV) por validación cruzada, se muestran en la Tabla 65. Los valores de
RMSECV se calcularon para evaluar la capacidad de predicción de los modelos. Para la
metilamina no había diferencias entre las dos opciones de selección, y se obtuvo un
modelo de complejidad 3. Para el amonio, la componente principal 2, no se incluyó en el
modelo con selección BSS, utilizándose solamente las componentes principales 1 y 3
(complejidad 2). En un segundo paso, se llevó a cabo una selección de las variables sobre
el modelo optimizado utilizando la aproximación de Eliminación de Variables No
informativas (UVE) [147]. Se utilizaron solamente 32 y 29 de las variables originales
para metilamina y amonio respectivamente. En ambos casos, se seleccionó un modelo
final de complejidad dos. Los valores de RMSECV fueron buenos para todos los
modelos, como puede verse en la Tabla 65, pero se seleccionaron los modelos de UVE-
BSS.
Tabla 65. Características de los modelos de Regresión en Componentes Principales
obtenidos para amonio y metilamina utilizando Selección Top Down (TDS), Selección del
mejor Subconjunto (BSS) o Eliminación de las Variables no informativas-Selección del mejor
Subconjunto.
Amonio (ëexc 415 nm) Amina (ëexc 333 nm)
TDS BSS UVE-BSS TDS BSS UVE-BSS
Número de
variables
231 231 32 180 180 29
CPs 1,2 1,3 1,2 1,2,3 1,2,3 1,2
Varianza
Explicada,
bloque-X
99.999 99.999 99.999 99.999 99.999 99.999
RMSECV 0.089 0.051 0.052 0.034 0.037 0.040
Precisión y exactitud
Teniendo en cuenta los resultados previos, se analizaron mezclas de patrones de
amonio y metilamina. Las medidas se llevaron a cabo excitando a 415 nm y a 333 nm, y
utilizando las curvas de calibrado de amonio a 485 nm y las curvas de calibrado de
amonio y de metilamina a 440 nm. En la Tabla 66 se muestran las concentraciones de
amonio y metilamina calculados en las diferentes mezclas ensayadas para cada uno de los
modelos de calibración utilizados. Los resultados obtenidos utilizando calibración
bivariada fueron satisfactorios en todos los casos, siendo los errores relativos entre 4-24%

144
para el amonio y entre 7-8% para la metilamina. La desviaciones estándar relativas fueron
entre 1-9% y 6-13% para amonio y metilamina respectivamente.
Al utilizar la calibración multivariada (PCR), las exactitud fue algo mejor para el
amonio siendo los porcentajes de error relativo entre 1-16%, y similar para la metilamina,
con porcentajes de error relativo entre 0-7.2%.
Tabla 66. Concentración de amina y amonio hallada en mezclas de patrones aplicando
calibración bivariada o multivariada (PCR).
NH4
+
encontrado (mg/L) MA encontrada (mg/L)NH4
+
adicionado
(mg/L)
Calibración
bivariada
PCR
MA
adicionada
(mg/L)
Calibración
bivariada
PCR
0.25 0.31 ± 0.03 0.29 ± 0.02 0.25 0.23 ± 0.03 0.26 ± 0.02
0.75 0.89 ± 0.04 0.76 ± 0.06 0.375 0.35 ± 0.02 0.40 ± 0.06
1.25 1.14 ± 0.03 1.23 ± 0.07 0.5 0.46 ± 0.06 0.50 ± 0.04
1.75 1.68 ± 0.02 1.74 ± 0.06 0.625 0.58 ± 0.04 0.58 ± 0.09
Método Kjeldahl
La determinación del Nitrógeno orgánico es un parámetro importante en la
calidad del agua. Este parámetro se estima según la legislación de la diferencia entre el
Nitrógeno Kjeldahl Total y el Amonio libre.
Se ensayaron diferentes condiciones de digestión-destilación Kjeldahl para
seleccionar aquellas que garantizaran la conversión total de las aminas (Tabla 67). Las
variables ensayadas fueron: cantidad de HgO (g) (0.0332-0.525 g), volumen de H2SO4
concentrado (3.39-12 mL), cantidad de K2SO4 (2.22-10.5g), tiempo de digestión (90-120
minutos) y volumen del reactivo utilizado en el paso de destilación NaOH/Na2S2O3 (25-
50 mL).
Se utilizan los modelos previamente establecidos para la determinación de
amonio y amina no transformada. Mientras que el amonio extraído fue prácticamente
independiente de las condiciones experimentales (Figura 54), la trasformación de amina
en amonio, varió en función de las condiciones de digestión-destilación empleadas, como
puede verse en la Figura 55. La condición 6 proporcionó la transformación total de MA a
amonio, siendo el porcentaje de conversión del 109%. El porcentaje de conversión
obtenido con el método de Nessler en la condición 6, también fue del orden del 100%.

145
Figura 54. %Recuperación de NH4
+
calculado respecto a la señal(o pendiente) obtenida sin
Kjeldahl, a diferentes condiciones Kjeldahl (Tabla 67). Condición 2: n=7 : 5 patrones de 0.5
mg/L de NH4
+
y 2curvas de calibrado (0, 0.5, 1.25, 2, 2.75 mg/L NH4
+
y 0, 0.2, 0.5, 0.9, 1.3
mg/L NH4
+
respectivamente). Condición 3: n=4: 2 patrones de 0.5 mg/L de NH4
+
y 2 curvas
de calibrado (0, 0.05, 0.25, 0.78 mg/L NH4
+
, y 0, 0.75, 0.75 mg/L NH4
+
). Condición 5: n=1:
Curva de calibrado (0, 0.28, 0.56 mg/L NH4
+
). Condición 6: n=3: Patrones de 0.375 y 0.75
(2 réplicas) mg/L NH4
+
.
Figura 55. %Recuperación de MA transformada a amonio y %Recuperación de MA no
transformada, calculados respecto a la señal obtenida sin Kjeldahl, a diferentes condiciones
Kjeldahl (Tabla 67). Condición 1: n=4 : 2 patrones de 0.5 mg/L y 2 patrones de 0.125 mg/L
de MA. Condición 2: n=4: Patrones de MA de 0.086, 0.3875, 0.5 y 0.56 mg/L. Condición 4:
n=2: Patrón de 0.5 mg/L de MA (2 réplicas). Condición 5: n=5: Patrón de 0.775 mg/L de MA
(5 réplicas). Condición 6: n=2: Patrón de 1.3 mg/L de MA (2 réplicas).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
2 3 5 6
Condición
%Recuperación
440 nm
485 nm
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 4 5 6
Condición
%Recuperación
MA 440 nm
NH 485 nm

146
Tabla 67. Diferentes condiciones Kjeldahl ensayadas.
Condición m(K2SO4)
(g)
m(HgO)
(g)
V(H2SO4)
(mL)
Tiempo de
Digestión (min)
V(NaOH/Na2S2O3)
(mL)
1 2.224 0.0332 3.39 90 25
2 2.224 0.0332 3.39 120 25
3 10.5 0.525 12 120 50
4 6.7 0.1 10.2 120 30
5 6.7 0.1 10 120 40
6 6.7 0.525 10 120 30
Además se estudió la conversión de otras aminas primarias y secundarias
(etilamina, n-propilamina, isopropilamina, butilamina, pentilamina, hexilamina,
dimetilamina, dietilamina y β-feniletilamina) a amonio en las condiciones óptimas de
digestión-destilación Kjeldahl (Condición 6). En la Figura 56 se muestran los espectros
de emisión de fluorescencia a ëexc = 415 nm (selectiva para amonio) de los derivados
OPA-NAC-amonio y OPA-NAC-amina a diferentes niveles de concentración antes del
tratamiento Kjeldahl, y a concentración de amonio de 0.75 mg/L después del tratamiento
Kjeldahl y la derivatización con OPA-NAC. Como puede verse en la Figura 56-A, la
señal analítica de los derivados de amina antes de la digestión Kjeldahl, fue similar a la
del blanco. Sin embargo, después del tratamiento Kjeldahl, las aminas se transformaron
en amonio (Figura 56-B). Las medidas del amonio se llevaron a cabo por el
procedimiento OPA-NAC (λexc 415 nm - λem 485 nm) y se contrastaron con el método de
Nessler. Los porcentajes de recuperación de amonio obtenidos con ambos métodos se
muestran en la Tabla 68. Como puede observarse, con ambos métodos fueron
comparables, y los porcentajes de recuperación fueron cercanos al 100%, tanto en
disoluciones de una única amina como en mezclas.
Tabla 68. Porcentajes de recuperación de amonio para las diferentes aminas y mezclas de
aminas después del Kjeldahl, con el Método OPA-NAC a 485 nm o con el Método Nessler.
Amina
(Concentración antes Kjeldahl)
Método OPA-NAC
(%RECNH4+ )
Método Nessler
(%RECNH4+ )
EA (3.75 mg/L) 101 110
N-PrA (4.93 mg/L) 122.5 121.5
IPA (4.93 mg/L) 107.2 103.13
BA (6.10 mg/L) 88.2 81.8
PeA (7.25 mg/L) 99.8 96
HA (8.43 mg/L) 124.7 121
DMA(3.76mg/L) 71.5 68.6
DEA(6.10 mg/L) 112 101.2
β-FEA(10.10 mg/L) 104.4 100.7
EA (1.878 mg/L) + DEA (3.047 mg/L) 84.4 79
DMA (1.253 mg/L) + N-PrA (1.642 mg/L) +
IPA (1.642 mg/L)
82 81
BA (3.05 mg/L) + β−FEA (5.05 mg/L) 99.9 85
PeA (3.622 mg/L) +HA (4.21 mg/L) 85.3 92

147
Figura 56. Espectro de emisión de fluorescencia de los derivados OPA-NAC a 485 nm (ëexc =
415 nm) para blanco, patrón de 0.75 mg/L de NH4
+
, 1.3 mg/L MA, 1.875 mg/L EA y DMA,
2.465 mg/L N-PrA e IPA, 3.05 mg/L BA y DEA, 3.625 mg/L PeA, 4.215 mg/L HA, y 5.05 mg/L
β-FEA. (56-A)-medidos antes del Kjeldahl. (56-B) medidos después del Kjeldahl.
450 500 550 600
0
200
400
600
800
1000
DMA
BA
HA, NPrA
Patrón 0.75 mg/l NH4+, MA,
EA, IPA, PeA, DEA, B-FEA
B)
Fluorescencia
λem (nm)
Blanco
450 500 550 600
0
200
400
600
800
1000
FluorescenceSignal
λem (nm)
Patrón 0.75 mg/l NH4+
Blanco, MA, EA, NPrA, IPA, BA,
PeA, HA, DMA, DEA, B-FEA
A)

148
El procedimiento se aplicó a la determinación de amonio y aminas primarias
(expresadas como metilamina) en tres muestras de agua reales de diferente naturaleza:
agua de riego, residual y de fuente. En la Tabla 69 se muestran las concentraciones de
amonio y amina halladas aplicando cada uno de los modelos de calibración. Para
comparar los resultados obtenidos, se aplicó un test t de muestras relacionadas, que dio á
> 0.05, tanto para el amonio como para la metilamina, lo que indicaba que los resultados
eran similares en ambos métodos, y que se podía optar por cualquiera de los dos modelos
de calibración, para el análisis de muestras reales.
La muestra de agua de fuente se analizó además por el método de referencia de
Nessler obteniéndose resultados comparables para la concentración de amonio: (0.32 ±
0.02) mg/L (n=3).
Tabla 69. Concentración de amina y amonio hallada en muestras reales aplicando
calibración bivariada o multivariada (PCR).
NH4
+
(mg/L)
Amina (expresado como MA)
(mg/L)
Muestras
Calibración
Bivariada
PCR
Calibración
Bivariada
PCR
Agua de riego - - 0.051 ± 0.007 0.086 ± 0.009
Agua residual 24.92 ± 0.10 32.2 ± 0.4 8.8 ± 0.4 10.25 ± 0.14
Agua de fuente 0.36 ± 0.03 0.29 ± 0.05 0.058 ± 0.013 0.082 ± 0.004
El procedimiento OPA-NAC se aplicó a estas tres muestras de agua después del
tratamiento de digestión Kjeldahl. La señal analítica medida correspondió al contenido de
amonio más el nitrógeno orgánico. Los resultados obtenidos se compararon con los que
proporcionó el método de Nessler. Al aplicar el método OPA-NAC los resultados fueron
(0.19 ± 0.07, n=3), (213 ± 3, n=3) y (2.103 ± 0.018, n=3) mg/L de amonio para las
muestras de agua de riego, residual y de fuente respectivamente. Estos resultados fueron
estadísticamente similares (test t de muestras relacionadas, á > 0.05) a los obtenidos al
aplicar el método de referencia de Nessler: (0.223 ± 0.018, n=3), (232 ± 3, n=3) y (2.14 ±
0.02, n=3) mg/L de amonio.
Las concentraciones de amonio halladas en las muestras, están de acuerdo con la
diferente naturaleza de las aguas analizadas. Para aguas superficiales de baja
contaminación el N-Kjeldahl no debe exceder las 2 mg/L. Para aguas residuales
industriales, este parámetro puede ser incluso superior a 200 mg/L. Teniendo en cuenta
los resultados mostrados en la Tabla 69 (concentraciones antes del Kjeldahl) y los
resultados después del tratamiento Kjeldahl, se dedujo que estas muestras de agua,
presentaban otros compuestos de nitrógeno además de amonio y aminas alifáticas
primarias.

149
Conclusiones
En este capítulo, se propone la utilización del reactivo OPA-NAC para la
determinación simultánea de amonio y aminas alifáticas primarias. Puede utilizarse
calibración bivariada a dos longitudes de onda de excitación, o calibración multivariada
(PCR), obteniéndose resultados similares. La metilamina se utilizó como compuesto
modelo debido a que la respuesta de diferentes aminas fue la misma cuando se expresaba
en mg/L de Nitrógeno, y se demostró la aditividad entre sus señales cuando se procesaron
mezclas de aminas.
Las curvas de calibrado de amonio en el intervalo 0.25-1.75 mg/L en presencia de
una concentración fija de amina (variada de 0.25 a 0.625 mg/L) dieron pendientes
estadísticamente similares excitando a 415 nm. A esta longitud de onda, no había
respuesta por parte de las aminas. Las curvas de calibrado de metilamina en el intervalo
0.25-0.625 mg/L en presencia de una cantidad fija de amonio (variada de 0.25 a 1.75
mg/L), también dieron pendientes estadísticamente similares excitando a 333 nm. La
señal del amonio afectaba a los valores de la ordenada.
Las pendientes de las curvas de calibrado de amonio fueron similares antes y
después de aplicar el tratamiento Kjeldahl. La conversión de aminas a amonio fue
aproximadamente del 100% en las condiciones óptimas establecidas para todas las aminas
individualmente y en mezclas. La aplicación del tratamiento Kjeldahl a las muestras de
agua reales, dio resultados de acuerdo con la naturaleza de las aguas. La aplicación del
método de referencia de Nessler sirvió para validar el método, obteniéndose resultados
similares a los obtenidos con el método OPA-NAC.

150
2.2.2.2. MÉTODO QUIMIOLUMINISCENTE AUTOMÁTICO PARA LA
ESTIMACIÓN TOTAL DEL NITRÓGENO ORGÁNICO (-CH2-NH-) Y AMONIO.
Basándonos en la bibliografía reciente para amonio [148] y en la conocida
reactividad entre los grupos amino y el hipoclorito, en este capítulo se propone un sistema
de flujo continuo para la determinación conjunta del nitrógeno orgánico amino (-CH2-
NH-) y el nitrógeno amoniacal en muestras de agua no tratadas. En este sistema, el grupo
amino reacciona con el Hipoclorito formando la cloramina, y posteriormente, la mezcla
reacciona con el Luminol generando una señal quimioluminiscente. La señal de emisión,
registrada a 425 nm en función del tiempo, disminuye al aumentar la concentración de
Nitrógeno en la muestra, debido a la disminución en la concentración de Hipoclorito, que
depende de la concentración de grupos amino presentes en la muestra.
Se han ensayado un gran número de compuestos de Nitrógeno, y sus
sensibilidades se han comparado en (mg/L)-1
de Nitrógeno. Una misma curva de
calibrado puede utilizarse para un gran número de compuestos, con lo que el método
puede emplearse para deducir de forma rápida el Nitrógeno orgánico disuelto y el
amonio. Se han evaluado las características del método como la selectividad, tiempo de
análisis y reproducibilidad.
El método quimioluminiscente se ha aplicado al análisis de una amplia variedad
de muestras de agua (agua natural, de lago, de riego, de fuente, residual y marina). La
exactitud del método se ha evaluado aplicando el método de adición estándar y
procedimientos de referencia. Para algunas de estas muestras, se ha realizado un estudio
comparativo del contenido de Nitrógeno amoniacal antes y después del tratamiento
Kjeldahl, para evaluar si el método aplicado a muestras no tratadas podía dar una
estimación del N Kjeldahl Total.
El sistema de inyección en flujo utilizado es el que se muestra en la Figura 18 del
Capítulo 1-Introducción (Pág. 41). Más información acerca de las condiciones
experimentales, se refleja en el Apéndice 11.
Parámetros analíticos
En la Tabla 70, se muestran las curvas de calibrado Señal QL frente a
Concentración de Nitrógeno (mg/L) obtenidas con patrones de amonio en diferentes
condiciones experimentales. Las variables evaluadas fueron: el tipo de celda de medida
(celda de nudos o espiral), la concentración de tampón, la concentración de hipoclorito, y
la presencia de tampón o de NaCl en los patrones.
Las condiciones óptimas, de máxima sensibilidad (marcadas en negrita en la
Tabla 70), se obtuvieron utilizando la celda de nudos e Hipoclorito 0.9 mM en tampón
carbonato 0.144 mM de pH 11.2. El rango lineal fue de 0.23-4 mg/L N, y el límite de
detección alcanzado fue de 0.070 mg/L N. Al acondicionar los patrones con tampón, la
sensibilidad disminuyó un 33%, y al prepararlos en NaCl, disminuyó un 13%.

151
Tabla 70. Curvas de calibrado de amonio (Señal QL frente a Concentración de Nitrógeno
(mg/L)) y otros parámetros analíticos en diferentes condiciones experimentales estudiadas.
Condiciones estudiadas
Celda de
detección
Conc.
Hipoclorito
Conc.
Tampón
Curva de calibrado
Y = (a ±± sa) + (b ±± sb)· C
(n, r2
, sy/x)
LD
(mg/l)
IL
(mg/l)
Espiral 0.9 mM 0.144 mM
Y = (9170 ± 30) + (-1844 ± 14)· C
(12, 0.9994, 70)
0.091 0.3-4
Nudos 0.9 mM 0.144 mM
Y = (9680 ±± 140) +(-2370 ±± 70)· C
(10, 0.9938, 300)
0.070 0.24-4
Nudos 0.5 mM 0.144 mM
Y = (4300 ± 50) + (-1960 ± 40)· C
(9, 0.9968, 100)
0.086 0.3-2
Nudos 0.9 mM 0 mM
Y = (9690 ± 100) +(-2290 ± 40)· C
(12, 0.9962, 200)
0.073 0.24-4
Nudos 0.9 mM 10 mM
Y = (9400 ± 90) + (-1730 ± 40)· C
(12, 0.9940, 200)
0.097 0.3-4
Nudos* 0.9 mM 0.144 mM
Y = (7960 ± 160) + (-1570 ±70)· C
(12, 0.9806, 400)
0.107 0.4-4
Nudos** 0.9 mM 0.144 mM
Y = (8290 ± 100) + (-2050 ±40)· C
(15, 0.9942, 200)
0.082 0.27-4
* Tampón en patrones
**NaCl en patrones
Los registros de inyección en flujo obtenidos para los patrones del calibrado de
amonio, se muestran en la Figura 57.
Figura 57. Registros de inyección en flujo obtenidos en las condiciones experimentales
óptimas a diferentes niveles de concentración de amonio (expresado en mg/L de Nitrógeno).
0 100 200 300 400
0
2000
4000
6000
8000
10000
Tiempo (s)
0.75 mg/l N
Blanco
2 mg/l N
3 mg/l N
4 mg/l N

152
La reproducibilidad del método se evaluó en dos vertientes. En la Figura 58 se
muestra el solapamiento a todos los niveles de concentración entre las curvas de calibrado
de amonio obtenidas en cinco días diferentes. El porcentaje de desviación estándar
relativa (%DER) para la pendiente del calibrado fue de 1.86 %.
Figura 58. Curvas de calibrado de amonio (Señal QL frente a mg/L N) obtenidas en cinco
días diferentes.
Por otra parte, los estudios de repetibilidad dieron %DER(n=3) de 0.81%, 0.31%
y 3.7% para concentraciones de Nitrógeno de 0.75, 2 y 4 mg/L respectivamente.
Estos valores indicaron que la precisión del método era muy buena.
La velocidad de muestreo de hasta 60 muestras por hora sin tratamiento previo,
permite que el procedimiento pueda adaptarse como analizador para monitorización in
situ.
Respuesta de compuestos de Nitrógeno
Para evaluar la validez de la metodología propuesta para la determinación de los
grupos amino (Nitrógeno Orgánico más Nitrógeno amoniacal), se estudió la respuesta de
otras familias de compuestos de Nitrógeno, comparando los resultados con los obtenidos
para el amonio, refiriendo las concentraciones a contenido en Nitrógeno.
La primera familia de compuestos estudiada fueron las aminas alifáticas:
primarias, secundarias y terciarias.
y = -2293.3x + 9365.4
y = -2255.9x + 9570.4
y = -2332.4x + 9456
y = -2339.4x + 9677.6
y = -2366.3x + 9676
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4 5
Concentración de Nitrógeno (mg/L)
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
Curvas de calibrado de Amonio

153
El estudio de siete aminas alifáticas primarias (MA, EA, N-PrA, IPA, BA, PeA y
HA), dio porcentajes de recuperación (calculados como pendiente de la curva de
calibrado de la amina*100/pendiente de la curva de calibrado de amonio) cercanos al
100% como puede verse en la Tabla 71. El porcentaje de recuperación medio (91 ± 11)%
demostró que la respuesta de las aminas primarias era similar a la del amonio, por lo que
su contenido de nitrógeno quedaría medido utilizando esta metodología.
Para las aminas alifáticas secundarias, DMA y DEA, los porcentajes de
recuperación fueron algo menores (Tabla 71) aunque cercanos al 100%, siendo el
porcentaje de recuperación medio (81 ± 4) %.
Tabla 71. Porcentajes de recuperación (bamina*100/bNH4+) para aminas alifáticas primarias y
secundarias individualmente y %Recuperación medio.
Amina
%Recuperación
bamina*100/bNH4+
(%REC ± s)
MA 104
EA 83
N-PrA 79
IPA 82
BA 82
PeA 102
HA 103
(91 ± 11)%
DMA 78
DEA 84
(81 ± 4)%
Sin embargo, los resultados para las dos aminas alifáticas terciarias estudiadas
(TEA y TMA), mostraron que este tipo de compuestos no se podían detectar mediante
esta metodología. Esto se debe a que en estas condiciones experimentales, la cloramina
no se formaba y por tanto el hipoclorito no se consumía, permaneciendo la señal
quimioluminiscente constante, igual al blanco.
La segunda familia de compuestos estudiados fueron las poliaminas. Estos
compuestos presentan varios grupos amino y la respuesta para cada analito debería
disminuir en función del número de grupos amino presentes. Al realizar la calibración
frente al contenido de nitrógeno para cada una de las poliaminas estudiadas (putrescina,
cadaverina, espermina, espermidina y 1,7-diaminoheptano), se obtuvieron porcentajes de
recuperación excelentes (Tabla 72). El porcentaje de recuperación medio (96.6 ± 1.8) %,
indicó que el contenido de nitrógeno de este tipo de compuestos quedaría medido
utilizando esta metodología.
La tercera familia de compuestos de nitrógeno estudiada fueron las
arilaquilaminas. Se tomó la β-Feniletilamina como compuesto modelo, obteniéndose
también un porcentaje de recuperación del 100.1%.

154
Tabla 72. Porcentajes de recuperación (bpoliamina*100/bNH4+) para poliaminas
individualmente y %Recuperación medio.
Poliamina
% Recuperación
bpoliamina*100/bNH4+
(% REC ± s)
Putrescina 98
Cadaverina 95
Espermina 98
Espermidina 94
1,7-Diaminoheptano 97
(96.6 ± 1.8)%
Por otra parte, se estudiaron compuestos de Nitrógeno que contenían Nitrógenos
aromáticos (como la triazina) o Nitrógenos resonantes (como la urea). Estos Nitrógenos
no respondían a la reacción con el Hipoclorito para dar cloramina, de modo que la señal
quimioluminiscente permanecía estable (similar al blanco). Además los Nitrógenos
aromáticos, exaltaban la señal quimioluminiscente del blanco. Estos resultados mostraron
que Nitrógenos resonantes y aromáticos no podrían ser detectados mediante este método.
Además se estudiaron 14 aminoácidos que solo poseían un grupo amino. Los
porcentajes de recuperación obtenidos (Tabla 73), fueron cercanos al 100% en todos los
casos, siendo el porcentaje de recuperación medio de (96 ± 4) %.
Tabla 73. Porcentajes de recuperación (baminoacido*100/bNH4+) para aminoácidos
individualmente y %Recuperación medio.
Aminoácido
% Recuperación
baminoácido*100/bNH4+
(% REC ± s)
Ácido aspártico 93.5
Triptófano 87.1
Ácido glutámico 101.9
Glicocola 97.6
Prolina 96.6
Serina 99.9
Tirosina 95.4
Almandina 98.1
Fenilalanina 97.1
Valina 100.6
Leucina 94.3
Isoleucina 96.0
Treonina 97.1
Lisina 93.8
(96 ± 4)%

155
El aminoácido Histidina presenta una estructura con dos nitrógenos aromáticos
además del grupo amino alifático, y al igual que para la triazina, la señal
quimioluminiscente del blanco aumentó y no se observó disminución de señal en el
intervalo de trabajo del Nitrógeno. Por su parte, el aminoácido Arginina que presenta
Nitrógenos resonantes además del grupo amino alifático, los resultados obtenidos
considerando solamente el nitrógeno alifático (baminoácido*100/bamonio=96.8%), confirmaron
que solo este grupo (–CH2-NH2) de la arginina contribuyó a la disminución de la señal
quimioluminiscente. Los aminoácidos Cisteína y Metionina dieron porcentajes de
recuperación (baminoácido*100/bamonio) de 287 y 147 %. Estos porcentajes indicaron que otro
átomo de su estructura contribuía a disminuir la señal quimioluminiscente. Como se
demuestra más abajo, este átomo fue el S.
Selectividad del método: Estudio de interferencias
El tipo de compuestos interferentes estudiados fueron aquellos que contenían
átomos de sulfuro, ya que estos átomos podían dar lugar a interferencias en la
determinación de nitrógeno como se había visto en la sección anterior al estudiar los
aminoácidos que contenían azufre en su estructura. Se estudió la respuesta de dos
compuestos, el sulfuro sódico (S2-
) y del ácido mercaptoacético (R-SH) que no contenían
grupos nitrógeno en su estructura. Ambos compuestos respondieron a la reacción
disminuyendo la señal QL. La interferencia del sulfuro fue el doble que la del
mercaptoacético, siendo las pendientes de las curvas de calibrado 3058 y 1850 L/mg S.
La respuesta de aminoácidos como la Cisteína (aminoácido con grupo R-SH en
su estructura) y su derivado la N-Acetil-L-Cisteína, era debida a la contribución de ambos
átomos, N y S. Las señales experimentales fueron próximas al 100% de las señales
teóricas obtenidas teniendo en cuenta las pendientes de calibración de amonio y
mercaptoacético. La interferencia causada por el grupo R-S-R, es pequeña, como puede
deducirse del porcentaje de recuperación dado en la sección anterior para la metionina.
Cuando se trabajó a la concentración habitual de tioles en aguas (0.25 µg/L) [149], y a la
concentración máxima permitida para H2S en aguas de bebida (50 µg/L) [40], los
compuestos de azufre no interfirieron en la reacción, obteniéndose una señal
quimioluminiscente igual a la del blanco.
El segundo grupo de posibles interferentes ensayado fueron los iones metálicos.
Cr(III) y Co(II) no interfirieron en la reacción incluso a niveles de 0.5 mg/L. Cu(II)
solamente disminuyó la señal QL en un 10% cuando se utilizó a una concentración de 50
µg/L (límite máximo permitido para aguas naturales). Otros cationes como Fe(III), Cd(II)
y Hg(II), no interfirieron a su máxima concentración permitida (0.5 mg/L, 5 µg/L y 1µg/L
respectivamente).

156
Tratamiento Kjeldahl
Se aplicó el tratamiento Kjeldahl a los compuestos de Nitrógeno que no
respondían a la reacción con el Hipoclorito, para estudiar su reactividad después de la
digestión de la muestra. Se digirieron patrones de trietilamina, urea, Histidina y Arginina
con una concentración de Nitrógeno final de 1.5 mg/L. Los porcentajes de recuperación
obtenidos se muestran en la Tabla 74. Todos los porcentajes son cercanos al 100%, por
lo que después del tratamiento Kjeldahl, el contenido de Nitrógeno de estos compuestos
quedaría medido al utilizar este método de detección.
Además, se aplicó el tratamiento Kjeldahl a dos mezclas de aminas (que
contenían o no TMA) para estudiar la recuperación del Nitrógeno Total. Los porcentajes
de recuperación obtenidos para las dos mezclas con un contenido de nitrógeno total de 1.5
y 1.8 mg/L N, se muestran en la Tabla 74, siendo ambos valores cercanos al 100%.
Tabla 74. %Recuperación individual y %Recuperación medio hallado en patrones de TEA,
urea, Histidina y arginina de concentración final de Nitrógeno de 1.5 mg/L, y para mezclas
de MA/PeA/DMA (Conc final Nitrógeno 1.5 mg/L) y MA/PeA/DMA/TMA (Conc final
Nitrógeno 1.8 mg/L), después del tratamiento Kjeldahl.
Analito % Rec (% REC ± s)
TEA 94.1
Urea 103.5
Histidina 114.9
Arginina 109.6
MA + PeA + DMA 96.3
MA + PeA + DMA + TMA 99.7
(103 ± 8)%
El tratamiento Kjeldahl se aplicó también a una proteína, la albúmina bovina. Los
resultados antes y después del Kjeldahl fueron diferentes, de modo que casi la mitad del
nitrógeno presente, no se detecta si no se lleva a cabo la digestión ácida.
Se analizaron varias muestras de agua. Para validar la exactitud del método, se
fortificaron todas las muestras a tres niveles de concentración diferentes para aplicar el
método de adición estándar, siendo los porcentajes de recuperación del nitrógeno
adicionado muy cercanos al 100% (Tabla 75). Esta tabla demuestra que no había efecto
matriz en estas muestras, y que el contenido de Nitrógeno en las muestras podía deducirse
directamente a partir de la curva de calibrado de patrones.
En tres de las muestras ensayadas, agua natural (S1), agua de grifo (S2) y agua de
riego 2 (S3), la concentración de Nitrógeno estuvo por debajo del límite de detección del
método. El agua de mar (S5) presentó un aumento de la señal del blanco por lo que no
pudo ser analizada por el método por medida directa. En las otras cuatro muestras, agua

157
de lago (S4), agua residual (S6), agua de riego 1 (S7) y agua de fuente (S8), se encontró
una concentración de Nitrógeno detectable al realizar la medida directa de las muestras.
En la Tabla 76, se muestra la concentración de Nitrógeno Total hallada en la medida
directa de estas muestras calculada a partir de la curva de calibrado de patrones.
Tabla 75. Concentración de Nitrógeno hallado en muestras de agua reales fortificadas y
porcentajes de recuperación a diferentes niveles de concentración.
Muestra
Concentración
adicionada (mg/L N)
Concentración
hallada (mg/L N)
% Recuperación
(Rec ± s) %
0.75 0.69 ± 0.04 92 ± 6
1.5 1.52 ± 0.05 101 ± 4S1-Agua natural
3 2.91 ± 0.08 97 ± 3
0.75 0.64 ± 0.07 86 ± 10
1.5 1.46 ± 0.02 97.4 ± 1.3S2-Agua de grifo
3 2.75 ± 0.08 92 ± 3
0.75 0.71 ± 0.03 95 ± 4
1.5 1.58 ± 0.03 105.2 ± 1.7S3-Agua de riego2
3 3.004 ± 0.018 100.1 ± 0.6
0.75 0.724 ± 0.018 97 ± 2
1.5 1.69 ± 0.04 112 ± 3S4-Agua de lago
3 2.62 ± 0.04 87.4 ± 1.3
0.75 0.76 ± 0.04 101 ± 6
1.5 1.58 ± 0.05 105 ± 3S5-Agua de mar
3 2.85 ± 0.03 95.0 ± 1.1
0.75 0.692 ± 0.017 92 ± 2
1.5 1.43 ± 0.08 96 ± 6S6-Agua residual
3 2.696 ± 0.004 89.86 ± 0.12
0.75 0.79 ± 0.03 105 ± 4
1.5 1.581 ± 0.013 105.4 ± 0.9S7-Agua de riego1
3 3.034 ± 0.007 101.1 ± 0.2
1.5 1.49 ± 0.10 99 ± 7
S8-Agua de fuente
3 2.91 ± 0.10 97 ± 3
Tabla 76. Concentración de Nitrógeno Total (Orgánico más amoniacal) (mg/L N) encontrada
en las diferentes muestras de agua estudiadas, antes y después del tratamiento Kjeldahl.
Concentración de Nitrógeno Total (mg/L)
Muestra
Antes del Kjeldahl Después del Kjeldahl
S4 (0.92 ± 0.15) (1.59 ± 0.06)
S5 N.D. (1.66 ± 0.10)
S6 (140 ± 8) (149 ± 11)
S7 (0.52 ± 0.04) (0.57 ± 0.03)
S8 (0.35 ± 0.05) (1.99 ± 0.07)
N.D.: No detectable.

158
Además, se determinó el contenido de Nitrógeno de algunas de estas muestras de
agua después de aplicar el tratamiento Kjeldahl. Los resultados de la Tabla 76 muestran
la presencia de dos grupos de muestras:
- Por una parte, las muestras cuyo contenido de Nitrógeno es el mismo antes y después
del tratamiento Kjeldahl (como es el caso de las muestras S6 y S7). La muestra S6 se
analizó además por los métodos de Nessler y o-ftaldialdehido/N-Acetil-L-Cisteína
(OPA/NAC) para amonio que se desarrolla en el Punto 2.1.2.1 del Capítulo 2-
Resultados de esta Tesis (Apéndice 4, [55]), y después del tratamiento Kjeldahl, las
concentraciones halladas fueron: (180 ± 3, n=3) y (166 ± 3, n=3) mg/L N para los
métodos de Nessler y OPA/NAC respectivamente. En este tipo de muestras, el
tratamiento de Kjeldahl podría haberse sustituido por la aplicación sencilla y directa
delsistema FIA presentado en este trabajo.
- Por otra parte, las muestras que presentaban concentración de Nitrógeno diferente
antes y después del Kjeldahl (como es el caso de las muestras S4, S5 y S8). La
muestra S4 presentó de forma directa el 60% de la señal del N-Kjeldahl; la muestra
S5 no podía analizarse de forma directa porque presentaba un aumento de señal
respecto al blanco como se ha expuesto previamente; y en cuanto a los resultados
para la muestra S8, las diferencias podrían explicarse debido a la presencia de
compuestos de Nitrógeno que no reaccionaban con el hipoclorito pero que se
transformaban en amonio después del tratamiento Kjeldahl, o más probablemente
debido a la presencia de matrices orgánicas complejas que se descomponían en la
digestión ácida (de forma similar a los resultados de la albúmina). Esta muestra, S8,
se analizó además por los métodos de Nessler y OPA-NAC para amonio (Apéndice 4,
[55]), siendo los resultados (0.25±0.02, n=3) y (0.29±0.02, n=3) mg/L N,
respectivamente antes del tratamiento Kjeldahl, y (1.66 ± 0.02, n=3) y (1.635 ± 0.18,
n=3) mg/L N, respectivamente después del tratamiento Kjeldahl. Estos resultados son
bastante similares a los obtenidos con el procedimiento propuesto (Tabla 76).
Conclusiones
La respuesta de los compuestos de Nitrógeno tipo amino (-CH2-NH-) incluido el
amonio, al aplicar la metodología propuesta dio porcentajes de recuperación cercanos al
100% para aminas alifáticas primarias y secundarias, poliaminas, arilaquilaminas, y para
14 de los aminoácidos ensayados. Las aminas terciarias y los Nitrógenos resonantes o los
aromáticos no dieron la reacción, y las proteínas nitrogenadas dieron recuperaciones
incompletas. Los principales interferentes de la reacción fueron los grupos tiol, pero se
demostró que no interferían a la concentración máxima permitida por la legislación. De
los iones metálicos estudiados, ninguno de ellos presentó interferencia a los máximos
niveles permitidos. El método permite hacer una estimación del N-amino Total disuelto
en la muestras de forma muy rápida.

159
Al fortificar las muestras de agua reales, no se observó efecto matriz y los
resultados obtenidos fueron exactos, con recuperaciones cercanas al 100%. Los resultados
mostrados permiten establecer que para algunos tipos de muestras el tratamiento Kjeldahl
se puede sustituir por el sistema de inyección en flujo presentado en este trabajo. Esta
opción es muy ventajosa dado que el método no requiere tratamiento de la muestra, y se
pueden procesar tres réplicas de la muestra en 1 minuto, la toxicidad de los reactivos es
baja y el método se puede utilizar para monitorización in situ.
La metodología propuesta también puede utilizarse como alternativa para la
detección final del amonio después del tratamiento de digestión Kjeldahl de las muestras.
La precisión del método para la determinación de amonio fue muy buena, con valores de
%DER del 0.3-3.7% para la repetibilidad, y del 1.9% para la reproducibilidad de las
pendientes de las curvas de calibración. Estos valores fueron similares a los valores de
precisión obtenidos mediante la aplicación del método de Nessler (%DER=0.4%), y
mejores que los obtenidos aplicando el método de OPA-NAC (%DER<12.5%). El
intervalo dinámico lineal del método fue de 0.23-4 mg/L N. Para el método de Nessler,
fue de 0.66-3.88 mg/L N, y para el método de OPA-NAC fue de 0.155-1.088 mg/L N. El
límite de detección alcanzado con el método propuesto (0.07 mg/L N) fue similar al
obtenido con el método de OPA-NAC (0.054 mg/L N), y mejor que el alcanzado con el
método de referencia de Nessler (0.46 mg/L N). La rapidez del método resultó excelente
(60 muestras/hora) comparada con los métodos de OPA/NAC (10 muestra/hora) o
Nessler (6 muestras/hora).

161
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166

Capítulo 3. CONCLUSIONES FINALES
169
3. CONCLUSIONES FINALES
Los trabajos expuestos pretenden aportar soluciones a algunos problemas
planteados en el análisis de aguas. Se proponen técnicas con diferentes grados de
automatización, utilizando diferentes fuentes de señal y aplicadas a diferentes analitos y a
una amplia variedad de muestras de agua. Estas características, así como los métodos de
validación empleados, y los pasos analíticos cuyo estudio se ha resaltado en mayor
medida, se reflejan en la Tabla 77.
Tabla 77. Principales características de los métodos propuestos en esta Tesis.
Aminas–DnsCl-off
Aminas–DnsCl-on
Aminas–DnsCl-CL
NH4
+
-OPA/NAC
NH4
+
-DnsCl-CL
Cu(II)-CL
Cr(III)/Cr(VI)
Cr(III)/Co(II)/Cu(II)
Acondicionamiento
Cr(III)/Co(II)-PLS
NH4
+
-aminas/
OPA-NAC
Norgánicoamino+
NH4
+
-Luminol(CL)
Estático X X X X
Flujo X X X X
HPLC-on X
Grado de
automatización
HPLC-off X X X
Derivatización X X X X X X X
Efecto catalítico X X XFuente de señal
Quenching X
Cinética X X X XSeñal frente al
tiempo Flujo X X X X
Orgánico X X X X X
Analito
Inorgánico X X X X X X X X
Agua de Riego 1 X X X X X
Agua de Fuente X X X X X
Agua Residual X X X X X X X
Agua de Grifo X X X X X
Agua de Riego 2 X X X
Agua de Lago 1 X
Agua de Lago 2 X X X
Agua Natural 1 X X X
Agua Natural 2 X X X
Agua Natural 3 X
Agua Marina 1 X
Agua Marina 2 X
Muestras de
agua
Agua Marina 3 X X X
Preconcentración X X X
Selección Modelo
Calibración
X X X
Interferencias X X X X X X X
Derivatización X X X X X X
Proced. Kjeldahl X X X
Separación HPLC X X X X
R. post-columna X X
Estudio
específico de
un paso
analítico
Posible Screening X X X X X

170
%Recuperación X X X X X X X
Estudio de fuentes
de error
X
X
Mét. Referencia X X X
MRC X X X X
Validación del
método
Muestra sintética X
En cuanto al grado de automatización, se han desarrollado métodos en estático
con detección QL para la determinación de iones metálicos, o fluorescentes para la
determinación simultánea de amonio y grupos amino primario; métodos en flujo con
detección QL para la detección de iones metálicos o del Nitrógeno orgánico amino +
amoniacal; y métodos cromatográficos fuera de línea (off-line) con detección
fluorescente, UV o QL para la detección de aminas o amonio, y en línea (on-line) con
detección fluorescente para la detección de aminas.
La fuente de señal normalmente la proporcionó un derivado del analito, como el
derivado dansilado o el isoindol derivado de OPA/NAC. En la reacción la determinación
del Nitrógeno orgánico amino más amoniacal, el derivado formado es la cloramina, y el
efecto en la señal es la disminución por eliminación del hipoclorito. En otros casos, la
señal la proporcionó el intermedio de reacción (3-aminoftalato en estado excitado)
formado gracias a la presencia del analito que actuaba como catalizador. Este es el caso
de los iones metálicos Cr(III), Co(II) y Cu(II) en la reacción del luminol. Otro tipo de
señal medida ha sido el efecto quenching causado por el analito sobre la reacción
quimioluminiscente (el analito absorbe la luz emitida), como en el capítulo de la
determinación QL del Cu(II).
Ha habido dos tipos de variación de señal frente al tiempo: al medir la cinética de
la reacción, o al hacer las medidas de inyección en flujo. Por otra parte, las medidas
cromatográficas también se registraron en función del tiempo de retención.
Se han analizado varios tipos de analitos: orgánicos (aminas alifáticas y
poliaminas, Nitrógeno Orgánico amino) e inorgánicos (Cr(III), Co(II), Cu(II), NH4
+
).
Además se han analizado un amplio rango de muestras de agua, abarcando una pequeña
parte de la gran variedad que podemos encontrar: Agua de riego (1 y 2 corresponden a
dos tomas de muestra en dos puntos de muestreo y dos temporadas diferentes), agua de
fuente, agua residual (procedente de una industria de pesticidas), agua de grifo, agua de
lago (procedente del Lago de La Albufera de Valencia, 1 y 2 corresponden a dos tomas de
muestra en dos puntos de muestreo y dos estaciones diferentes), agua natural (son aguas
de consumo humano: 1, 2 y 3 corresponden a diferentes marcas comerciales) y agua
marina (procedente de la costa de Valencia: 1, 2 y 3 corresponden a tres tomas de muestra
en tres puntos de muestreo y dos estaciones diferentes).
Los principales pasos analíticos cuyo estudio se ha resaltado específicamente han
sido: la preconcentración de los analitos en el caso de la determinación de aminas
alifáticas; la selección del modelo de calibración en el estudio de la determinación
quimioluminiscente de Cromo o en el estudio de la determinación simultánea de amonio
y grupos amino primario utilizando el método de OPA/NAC; el estudio de los posibles

171
interferentes en la mayoría de los métodos propuestos; el estudio de las reacciones de
derivatización con Cloruro de dansilo o con OPA/NAC según el caso; el estudio de la
reacción QL post-columna en los capítulos de separación cromatográfica de los derivados
dansilados de aminas y de amonio; el tratamiento Kjeldahl de digestión de las muestras
en el caso de la medida de concentraciones totales de Nitrógeno orgánico amino y
amonio; y la posibilidad de adaptar el método para el screening de muestras como en el
capítulo de la determinación QL de Cu(II).
Por último, los métodos propuestos se han validado utilizando diferentes
procedimientos: mediante estudios de recuperación sobre muestras reales, utilizando
métodos de referencia, materiales de referencia certificados, muestras sintéticas o
mediante el estudio de las fuentes de error, obteniéndose resultados exactos.
Las principales ventajas analíticas que presentan los métodos propuestos se
reflejan en la Tabla 78.
Tabla 78. Ventajas de los métodos propuestos (a mayor número de asteriscos *, mejor
condición).
Aminas -
DnsCl - off
Aminas -
DnsCl - on
Aminas
-
DnsCl - CL
NH4
+
-
OPA/NAC
NH4
+
-
DnsCl - CL
Cu (II) -
CL
Tratamiento de
la muestra
Preconc en
C18
Preconc en
C18
Preconc en
C18
Ajustar pH Ajustar pH
Ajustar
pH
Bajo consumo
de reactivos
** ** ** *** ** **
Instrumentac.
simple
** ** ** *** ** **
Selectividad Si Si Si
Si, a
λexc = 415 nm
Si Si
Precisión
DER < 4 %
(EA)
DER < 11.7%
(EA)
DER < 10%
(EA)
DER < 12.5% DER < 8.6%
DER <
16%
Exactitud Er = 7 % Er = 11% Er = 10.7% Er < 11% Er < 9.8%
%Rec =
109%
Límite de
detección
2 µg/L (EA) 15 µg/L (EA) 0.2 µg/L (EA) 70 µg/L NH4
+
8 µg/L NH4
+
9 µg/L
Intervalo
Lineal
0.01-0.5 mg/L
(EA)
0.5-2.25 mg/L
(EA)
0.7-64 µg/L
(EA)
0.25 – 1.4
mg/L NH4
+
0.027 – 0.645
mg/L NH4
+
9-100
µg/L Cu
Velocidad de
muestreo
* * * ** * **

172
Tabla 78 (continuación). Ventajas de los métodos propuestos (a mayor número de asteriscos
*, mejor condición).
Cr(III)/
Cr(VI)
Cr(III)-
Co(II)-Cu(II)
Acondicionam.
Cr(III)/Co(II)
- PLS
NH4
+
-aminas/
OPA-NAC
N amino +
NH4
+
/
Luminol
Tratamiento de
la muestra
Reducción Acondic. ácidos No Ajustar pH Ajustar pH
Bajo consumo
de reactivos
** ** *** *** **
Instrumentac.
simple
** ** *** *** **
Selectividad
Si, después
reducción
Si, acondic. Si Si Si
Precisión DER < 12% - - - DER < 3.7 %
Exactitud Er < 7% - -
Er
NH4+
< 24%
Er
MA
< 8%
%Rec ≈100%
Límite de
detección 2 µg/L
2.2 µg/L Cr
0.5 µg/L Co
2.1 µg/L Cu
-
70 µg/L NH4
+
38 µg/L MA
70 µg/L N
Intervalo
Lineal 3-10 µg/L
3-15 µg/L Cr
2-8 µg/L Co
10-50 µg/L Cu
0-80 µg/L Cr
0-80 µg/L Co
0.25-1.75 mg/L
NH4
+
; 0.25-0.625
mg/L MA
0.25-4 mg/L N
Velocidad de
muestreo
*** *** *** ** ***
En la esta tabla, se observa que el tratamiento realizado sobre las muestras para la
aplicación de los métodos propuestos ha sido mínimo, tanto en métodos
quimioluminiscentes como en métodos fluorescentes o UV. El tratamiento realizado ha
incluido etapas sencillas como la reducción de Cr(VI) a Cr(III) en el punto 2.2.1.1 o la
preconcentración en cartuchos de extracción en fase sólida en los puntos 2.1.1.1 y 2.1.1.3
de derivatización de aminas, requiriendo los demás métodos únicamente el ajuste del pH
de las muestras.
El consumo de reactivos fue menor y la instrumentación más sencilla en los
métodos estáticos respecto a los métodos en flujo o cromatográficos, pero a cambio en los
métodos estáticos se pierde el grado de automatización. Por su sencillez, hemos de
destacar el detector quimioluminiscente utilizado en el capítulo de determinación y
screening de muestras para Cu(II). Además cabe resaltar la ventaja en la sencillez de la
instrumentación en los métodos quimioluminiscentes, puesto que los sistemas de
detección utilizados no requirieron fuente de excitación.
En cuanto a la selectividad, los métodos propuestos resultaron selectivos para la
medida de los analitos en estudio, tanto las técnicas fluorescentes y UV, como las
quimioluminiscentes. En cuanto a las medidas de exactitud y precisión, la desviación
estándar relativa así como los errores relativos fueron adecuados, y similares en todas las
técnicas estudiadas.

173
Los métodos quimioluminiscentes utilizados destacan sobre los fluorescentes o
UV, en los límites de detección e intervalos lineales alcanzados. En la determinación del
N Total, los límites de detección obtenidos fueron similares utilizando la reacción
fluorescente del OPA/NAC o la reacción QL del Luminol. Sin embargo, si se comparan
los límites de detección para los estudios de aminas alifáticas, se observa que la detección
quimioluminiscente proporcionó límites de detección del orden de 10 veces inferior. Lo
mismo ocurre al comparar los límites de detección obtenidos utilizando el método
fluorescente OPA/NAC o del método QL de los derivados dansilados-TCPO-H2O2 para la
determinación de amonio. El límite de detección alcanzado mediante la detección QL es
del orden de 10 veces inferior respecto a la detección fluorescente. Esta sería pues una de
las principales ventajas de la quimioluminiscencia.
La velocidad de muestreo fue mayor al utilizar métodos en flujo que no requerían
tiempo de reacción, seguida de los métodos estáticos de tiempo de reacción corto, y por
último los métodos cromatográficos que incluían una etapa de derivatización además de
la separación cromatográfica.
Los métodos propuestos para la determinación de aminas alifáticas presentan
ventajas respecto a los existentes en la bibliografía. En primer lugar, el uso de cartuchos
C18 de extracción en fase sólida para la preconcentración y derivatización de los analitos,
proporcionó buena sensibilidad en unas condiciones de reacción sencillas y rápidas. Al
automatizar el proceso, solamente para algunas de las aminas en estudio, se mejoró la
sensibilidad, disminuyendo para otras, pero se ganó en grado de automatización de la
técnica. Por último, al acoplar el módulo de reacción post-columna (sistema off-line,
detección quimioluminiscente), se mejoró la sensibilidad en todos los casos, y si se
comparan los límites de detección alcanzados mediante esta técnica, con los publicados
en la bibliografía reciente para otros métodos fluorimétricos o UV (Tabla 5, Apéndice 3),
se observa que los límites de detección alcanzados son mejores.
El método fluorimétrico de OPA/NAC propuesto para la determinación de
amonio presentó ventajas frente al método de referencia de Nessler y el método del
electrodo selectivo (Tabla 8, Apéndice 4). El intervalo dinámico de concentraciones fue
más corto, pero el límite de detección alcanzado fue menor, del orden de 0.07 mg/L. La
reproducibilidad fue similar para los tres métodos, el método del electrodo selectivo
presentó interferencia de aminas con señal no aditiva, mientras que el método de Nessler
y el de OPA/NAC a λexc = 415 nm, fueron selectivos para amonio. En cuanto a los costes,
el método del electrodo selectivo era el más barato, y en cuanto a la rapidez, la velocidad
de muestreo fue mayor para los métodos del electrodo selectivo y de OPA/NAC. El
método quimioluminiscente propuesto posteriormente, además de mejorar la sensibilidad
y selectividad en la determinación de amonio, es novedoso, pues aunque la reacción entre
los compuestos de nitrógeno y el cloruro de dansilo es bien conocida, esta reacción no se
había aplicado todavía a la determinación de amonio.
La marcada tendencia de la Química Analítica hacia el desarrollo de sistemas de
screening, cuyas características de sencillez en la instrumentación, y rapidez en la
respuesta los hacen óptimos para seleccionar entre un conjunto de muestras, aquellas

174
cuyo contenido en un determinado analito sea superior a un nivel determinado (el
marcado por la legislación, el cliente, etc.), se refleja en el trabajo desarrollado en el
Apéndice 6, en el que se desarrolló un sistema de screening de muestras para Cu(II). En
este trabajo, no se pretende alcanzar la máxima sensibilidad posible mejorando los
trabajos presentados en la bibliografía, sino presentar un sistema de screening con las
características adecuadas para discriminar entre un conjunto de muestras cuyo contenido
de Cu(II) esté por encima o por debajo del límite legislado (50 µg/L) en buenas
condiciones de reproducibilidad y fiabilidad.
Al aplicar la reacción quimioluminiscente del luminol en la especiación de
Cromo, se alcanzó la misma sensibilidad que con otros métodos (espectrofotometría,
fluorimetría, fluorescencia de rayos X, espectrometría de absorción atómica,
espectrometría de emisión atómica, cromatografía y métodos electroquímicos entre otros)
utilizando esta técnica de menor coste. Se puede utilizar el valor de la pendiente del
MOSA para garantizar la ausencia de errores del método dada su robustez. Por otra parte,
en la bibliografía no existen referencias que estudien la influencia de las condiciones de
acondicionamiento de las muestras en la señal quimioluminiscente. El estudio de la señal
quimioluminiscente directa producida por la reacción del luminol-peróxido de hidrógeno
catalizada por iones metálicos como Cr(III), Co(II), Fe(II), Fe(III), Ni(II) y Mn(II) en
función del protocolo de acondicionamiento de la muestra (sin acidificar o acidificadas
con HCl o HNO3, en presencia y ausencia de EDTA, en estático y en flujo), permitió
seleccionar las condiciones para la determinación selectiva de Cr(III) o para la
determinación total de Cr(III), Co(II) y Cu(II). Además por primera vez se han aplicado
los perfiles intensidad-tiempo descritos por la reacción del luminol/H2O2 catalizada por
Cromo o Cobalto en estático, en calibración multivariada para el análisis
quimioluminiscente simultáneo de dos especies.
El método OPA/NAC permitió la determinación simultánea de amonio y grupos
amino primario por calibración bivariada o multivariada libre de errores sistemáticos con
resultados similares, siendo un buen indicador de cuándo el tratamiento Kjeldahl falla. El
método quimioluminiscente para la determinación del nitrógeno orgánico amino y
amoniacal, permitió utilizar una misma curva de calibrado para un gran número de
compuestos de nitrógeno. El Nitrógeno orgánico disuelto y el amonio pueden deducirse
de forma muy rápida, y para algunos tipos de muestras, el tratamiento Kjeldahl se puede
sustituir por el sistema de inyección en flujo presentado. Esta opción es muy ventajosa,
puesto que la toxicidad de los reactivos es baja y el método se puede utilizar para
monitorización in situ. La metodología propuesta también puede utilizarse como
alternativa para la detección final del amonio después del tratamiento de digestión
Kjeldahl.
Resumiendo, y de acuerdo con los objetivos específicos marcados en la Pág. 4,
esta Tesis contribuye a:
1. Mejorar el análisis de screening de aminas alifáticas en muestras de agua de
diferente naturaleza y disminuir sus límites de detección.

175
2. Disminuir los límites de detección de amonio en aguas e incrementar la exactitud
de su determinación.
3. Contribuir al conocimiento de los métodos de screening de muestras.
4. Mejorar la exactitud de la determinación de algunos iones metálicos controlando
los errores sistemáticos y la especiación de Cr(VI) y Cr(III).
5. Contribuir al estudio del Nitrógeno Orgánico disuelto.
Y todo ello teniendo como marco el profundizar en el desarrollo de los métodos
quimioluminiscentes.

176
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS
Sin duda la continuidad del trabajo realizado en esta Tesis, seguiría las tendencias
actuales de la Química Analítica. En el caso de la derivatización de aminas o de amonio
con separación cromatográfica y reacción quimioluminiscente postcolumna, la siguiente
fase sería la automatización completa del sistema, minimizando así los errores
experimentales debidos al operador.
También existe una marcada tendencia en Química Analítica hacia la
miniaturización de sistemas, que aportaría las ventajas del mínimo consumo tanto de
reactivos como de muestra. Esta sería otra de las propuestas tanto para la detección de
Cr/Co utilizando las reacción del Luminol/H2O2, como para la detección del Cu(II)
utilizando la reacción del TCPO/H2O2/Coproporfirina I. También cabría la posibilidad de
la miniaturización de los sistemas cromatográficos para la detección de aminas alifáticas
o amonio, tema prioritario en el grupo para el que se ha conseguido financiación
(BQU2003-6138).
Por último, el diseño de sensores es otro campo de interés en crecimiento. Existe
una ausencia de sensores adecuados para la monitorización en tiempo real y en línea. En
este sentido el desarrollo de sensores quimioluminiscentes sería otra alternativa para
trabajos futuros, tendiendo a una mejora en cuanto a las propiedades de emplazamiento,
principio de muestreo, tratamiento de la muestra, número de medidas, necesidad de
suministros o intervalo de servicio.

Capítulo4. APÉNDICES
179
APÉNDICES
Apéndice 1.
S. Meseguer-Lloret, C.Molins-Legua, P. Campíns-Falcó.
Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Valencia.
Preconcentration and dansylation of aliphatic amines using C18 solid-packings.
Application to the screening analysis in environmental water samples.
J. of Chromatography A, 978 (2002) 59-69.
Apéndice 2.
C.Molins-Legua, P. Campíns-Falcó, S. Meseguer-Lloret.
Derivatization on solid supports: An alternative method for solution derivatization of
amines in several matrices.
Chromatographia, 58 (2003) 15-27.
Apéndice 3.
S. Meseguer-Lloret, C.Molins-Legua, J.Verdú-Andrés, P. Campíns-Falcó.
Sensitive determination of aliphatic amines in water by High-Performance Liquid
Chromatography with chemiluminescence detection.
J. of Chromatography A, en prensa. Available on line at www.sciencedirect.com.
Apéndice 4.
Ammonium determination in water samples by using OPA-NAC reagent: A comparative
study with Nessler and Ammonium Selective Electrode methods.
Intern. J. of Environ. Anal. Chem. 82 (7) (2002) 475-489.
Apéndice 5.
Selective chemiluminescence determination of ammonium in water by HPLC.
Enviado a J. of Chromatography A.
Apéndice 6.
S. Meseguer-Lloreta
, P. Campíns-Falcóa
, S. Cárdenasb
, M. Gallegob
, M. Valcárcelb
.
a
b
Departamento de Química Analítica, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba.
FI automatic method for the determination of copper(II) based on coproporphyrin I -
Cu(II) / TCPO / H2O2 chemiluminescence reaction for the screening of waters.
Talanta, revised paper (minor revision).

Capítulo4. APÉNDICES
180
Apéndice 7.
S. Meseguer-Lloret, P. Campíns-Falcó, L. A. Tortajada-Genaro, F. Blasco Gómez.
Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Valencia
A guide to avoid method bias of Chromium (III, VI) chemiluminescence determination by
luminol-hydrogen peroxide reaction. Application to water samples.
Intern. J. Environ. Anal. Chem. 83 (5) (2002) 405-416.
Apéndice 8.
Y. Moliner-Martínez, S. Meseguer-Lloret, L. A. Tortajada-Genaro, P. Campíns-Falcó.
Influence of water sample storage protocols in chemiluminescence detection of trace
elements.
Talanta 60 (2003) 257-258.
Apéndice 9.
P. Campíns-Falcó, L. A. Tortajada-Genaro, S. Meseguer-Lloret, F. Bosh-Reig.
Multivariate calibration applied to simultaneous determination of cobalt and chromium.
Anal. Bioanal. Chem. 374 (2002) 1223-1229.
Apéndice 10.
S. Meseguer-Lloret, J.Verdú-Andrés, C.Molins-Legua, P. Campíns-Falcó.
Modified Roth’s fluorimetric method for water samples: ammonium and primary amine
groups determination and utility in total nitrogen Kjeldahl.
Enviado a Talanta.
Apéndice 11.
Chemiluminescence authomatic method for total estimation of organic nitrogen (-CH2-
NH-) and ammonium.
Enviado a Analytica Chimica Acta.

181
Apéndice 1.
Preconcentration and dansylation of aliphatic amines using C18 solid-packings.
Application to the screening analysis in environmental water samples.
J. of Chromatography A, 978 (2002) 59-69.
Enlace URL: http://www.sciencedirect.com

183
Apéndice 2.
C.Molins-Legua, P. Campíns-Falcó, S. Meseguer-Lloret.
Derivatization on solid supports: An alternative method for solution derivatization of
amines in several matrices.
Chromatographia, 58 (2003) 15-27.
Enlace URL: http://www.springerlink.com

185
Apéndice 3.
Sensitive determination of aliphatic amines in water by High-Performance Liquid
Chromatography with chemiluminescence detection.
J. of Chromatography A, en prensa.

187
Apéndice 4.
Ammonium determination in water samples by using OPA-NAC reagent: A comparative
study with Nessler and Ammonium Selective Electrode methods.
Intern. J. of Environ. Anal. Chem. 82 (7) (2002) 475-489.

189
Apéndice 5.
UNPUBLISHED PAPER
SELECTIVE CHEMILUMINESCENCE DETERMINATION OF AMMONIUM
IN WATER BY HPLC
S. Meseguer Lloret, C. Molins Legua and P.Campíns Falcó*
Departament de Química Analítica, Facultad de Química, Universitat de Valencia
C/ Dr. Moliner 50, E46100- Burjassot, Valencia. SPAIN
ABSTRACT
A selective and sensitive method has been developed for liquid chromatographic
determination of ammonium in water samples. Analyte is solution pre-column derivatized
with Dansyl Chloride. Optimal solution derivatization conditions have been established.
The dansyl derivative is chromatographied and post column mixed with peroxyoxalate
(TCPO) and H2O2 in order to perform chemiluminescence detection. Detection limit
achieved is 8 µg/L and linear response from 0.027 to 0.750 mg/L of ammonium. Under
optimum chromatographic conditions, ammonium ion was determined within 2.4 min.
The method is fast, and near 10 derivatized samples can be measured per hour. No
interference of amines has been obtained. Accuracy studies gave % relative error below
9.8%, and precision studies gave %RSD between 2-8%. The method has resulted reliable
for amine and ammonium screening and quantification of ammonium in different kind of
water samples: bottled, tap, lake, fountain, irrigation, residual and sea. Only matrix effect
was found in sea water samples. The method was also applied to several samples after
applying Kjeldahl treatment in order to obtain values of Total Kjeldahl Nitrogen.
Keywords: ammonium, water samples, dansylation, post-column chemiluminescence,
HPLC, Total Kjeldahl Nitrogen.
* Correspondence author. E-mail address: pilar.campins@uv.es (P.Campins).

190
INTRODUCTION
Ammonium is one of the most widely used industrial chemicals. The principal
uses of ammonia are direct-application fertiliser, conversion to other chemical fertilizers,
fibres, explosives, plastics, and animal feeds. It is also used as food additive, in
insecticides, in the manufacture of household detergents and cleaners, and as a major
commercial refrigerant [1]. It is the most serious pollutant causing eutrophication of
aqueous environments. Although ammonium is an important link in the nitrogen cycle of
aquatic systems, its determination is still a delicate task. Its concentration in water
systems is regulated by legislation to guarantee the quality of the water supplied for
human consumption, being the limit (parametric value) established in 0.5 mg/L , and 2
mg/L when we are talking about Total Kjeldahl Nitrogen [2]. The performance
characteristic of the method of analysis is also specified in the legislation, it has to be
capable of measuring concentrations equal to the parametric value with trueness,
precision and limit of detection of 10 % of the parametric value [2].
The reference methods for ammonium determination include wet technique such
as trimetry, colorimetry (Nesslerization, Phenate or automated phenate) or ammonia-
selective electrode [3]. These methods suffer from several chemical interferences, can
require distillation step and often offer lack of sensitivity [4-7].
In order to improve selectivity some procedures have been described in the
literature in which a ion chromatography was applied. In these papers a weakly basic
anion-exchange resin column [8] or high capacity cation exchange column [9], have been
used to separate ammonium to the other inorganic cations or/and aliphatic amines which
can be present in water samples.
A number of methods exist for measuring ammonium with
Orthophthaldialdehyde (OPA)-derivatization reactions, such as OPA-sulphite reagent [5]
or more recently OPA- tioglycolate [10] and OPA-NAC [4] by forming fluorescent
derivates. Background fluorescence from naturally occurring organic compounds may not
be negligible in some fresh waters and then the results obtained by the methods could be
biased [5].
Chemiluminescence procedures have also been developed for ammonium
determination [11-12], due to its high sensitivity, rapidity, simplicity and feasibility. The
reagent mainly used is luminol combined with hypochlorite and the procedures are
systems of flow injection analysis (FIA), not being described its application by HPLC in
order to improve selectivity.
Despite the known reaction between nitrogen compounds and dansyl chloride
reagent (Dns-Cl), the reaction has not been applied to the quantitative determination of
ammonium ions with fluorimetric nor postcolumn chemiluminescence generation ( with
reagents such Bis-(2,4,6-trichlorophenyl)oxalate, TCPO) detection systems. However,
dansylation has been widely used for the determination of analytes such as biogenic
amines in plants [13] as low-molecular-mass amines applied to water samples [14-16],

191
phenols in surface waters [17], phenoxyl-type N-methylcarbamate pesticide residues in
fruit juices [18] and amphetamines in urine [19-20].
Based on our experience in the derivatization of amine compound with Dns-Cl
and TCPO post-column chemiluminescence generation [16, 19-20], in this work, a fast,
sensitive and selective method, has been developed for the screening and quantification of
ammonium in water samples at low concentration level. The solution derivatization of
ammonium in the sample with dansyl chloride reagent was studied, followed by HPLC in
order to separate ammonium signal from other nitrogen-compounds response.
Optimization of the separation on a C18 analytical column and postcolumn mixing with
TCPO/H2O2 was carried out. A screening procedure for aliphatic amines and ammonium
in water samples of different nature has been developed. Ammonium determination was
carried out in different kind of samples. Moreover, the method was applied to several
samples after applying Kjeldahl treatment in order to obtain values of Total Kjeldahl
Nitrogen.
EXPERIMENTAL
Apparatus
The chromatographic system used consisted of a quaternary pump (Hewlett
Packard Series 1050) equipped with a high-pressure six-port valve (Rheodyne model
7000). The volume of sample loop was 20 µl.
The post column instrument (PCX 5100), from Pickering Laboratories (Mountain
View, CA, USA), consisted of two isocratic pumps. The chemiluminescence detector was
a Jasco CL-1525 (Ishika-cho, Hachioji-shi, Tokio, Japan) which was coupled in series
and linked to a data system Borwin-chromatography software and the interface Hercule
lite (JMBS, France) used for data acquisition and storage. The model CL-1525 detector is
equipped with JASCO´s uniquely designed coiled PTFE tube flow cell placed
inmediatelly next to a highly sensitive end-on photomultiplier. All the assays were carried
out at room temperature.
For sample Kjeldahl treatment, the Digestion Unit was a Tecator Digestion
system 6, 1007 Digestor (Höganäs, Sweden), and the Distillation Unit was a Büchi 323
Distillation Unit (Switzerland).
Reagents
All the reagents were of analytical grade. Stock standard solutions of ammonium
were prepared by dissolving ammonium chloride (Probus, Barcelona, Spain) in nanopure
water (1000 mg/L). Acetonitrile (J.T.Baker, Deventer, Holland), Tetrahydrofuran (Fluka,
Steinheim, Switzerland), Methanol and Acetone (Scharlau, Barcelona, Spain) were of
HPLC grade. Methylamine (MA), Ethylamine (EA), N-Propylamine (N-Pra), Butylamine
(BA), Dimehylamine (DMA), Diethylamine (DEA), Pentylamine (PeA), Hexylamine
(HA) and Dansyl Chloride (Dns-Cl) were obtained from Sigma (St.Louis, MO). TCPO,
bis (2, 4, 6-trichlorophenyl oxalate), tetrahydrofuran and Imidazole (99%) from Fluka

192
(Steinheim, Switzerland), and H2O2 (30%), sodium carbonate and sodium hydroxide from
Merck (Darmstadt, Germany) were also used.
Sodium thiosulphite and potassium sulphate from Prolabo (Fontenay, France),
sodium hydroxide, sulphuric acid and sodium carbonate from Merck (Darmstadt,
Germany), and red mercury oxide from Panreac (Barcelona, Spain) were used for sample
Kjeldahl treatment.
Columns and Mobile -Phases
A LichroCART RP 18 (125x4 mm i.d., 5 µm particle φ) (Merck, Darmstadt,
Germany) column was used for separation of ammonium derivative from reagent excess
and from other nitrogen-compound derivatives. An acetonitrile:imidazole solution (1
mM, pH=7.0) (50:50 v/v) mixture in gradient elution mode was used as eluent at flow
rate of 1 ml/min.
The mobile phase gradient used was the following: gradient elution mode 1:
acetonitrile:imidazole 50:50 at zero time, 70:30 at 6 min, and 50:50 at 7 min. When
amine standards were studied, the gradient elution mode was extended in order to assure
the elution of all amine derivatives following the gradient elution 2, established in our
previous studies [15]: acetonitrile:imidazole 50:50 at zero time, 90:10 at 9 min, and 50:50
at 10 min.
All the solvents were filtered with a 0.45 µm nylon membrane (Teknokroma,
Barcelona, Spain) and degassed with Helium before use.
Preparation of solutions
Standard solutions of ammonium were prepared by dissolving the pure
compounds in water (1000 µg/ml). Working ammonium solutions were prepared by
diluting the standard solutions in water. Dns-Cl 5 mM solution was prepared by
dissolving the pure compound in acetonitrile. All solutions were stored in the dark at 4
ºC.
Solution derivatization of ammonium
Ammonium was derivatized according to the method described by Marce et al.
[13] with some modifications. To 1.55 ml of ammonium standard, 0.05 ml of 200 mM
carbonate buffer (pH 9), 0.28 ml of acetonitrile and 0.12 ml of 5 mM dansyl chloride (in
acetonitrile) were added successively, and the mixture was incubated at 70 ºC for 10 min.
An aliquot (20 µl) of the solution was injected into the HPLC system.

193
Post-column generation of chemiluminescence
H2O2 (11 mM, prepared in acetonitrile) and TCPO (2.5 mM, prepared in
acetonitrile:tetrahydrofuran (75:25)) were used as post column reagents.
The post column system was running continuously during all runs at a flow rate
of 0.35 ml/min, with TCPO (pump 2) and H2O2 (pump 3) (see the assembly on Figure 1).
The dansyl derivatives, previously separated in the analytical column, were transferred to
the post column system, where the intermediate generated from the TCPO and H2O2,
served to excite the derivative so that it could undergo chemiluminescence emission. The
distance between the reagents confluence and the detector was a tube of 5 cm (i.d. 0.508
mm). This was the minimum possible distance in the assembly.
FIGURE 1. Assembly used for separation of dansylated ammonium and on-line post-column
chemiluminescence detection.
Selectivity
Several aliphatic amines were derivatized following the same solution
derivatization conditions as for ammonium determination but using gradient elution mode
2. Standards of 0.1 and 0.3 mg/l of MA and DMA, 0.2 and 0.6 mg/l of EA, 0.3 and 0.9
mg/l of N-PrA, BA, PeA and HA, and 0.5 and 1.5 of DEA were analysed.
Analysis of real water samples
The method was tested in real water samples of different origin and with
unknown ammonium concentration. The environmental water samples were named as
Post-column system
Analytical column
Acetonitrile : Imidazol
buffer pH 7
Gradient elution mode
1 ml/min
Pump 1
Hydrogen
peroxide 0.011
M, 0.35 ml/min
Pump 3
TCPO 2.5 mM
0.35 ml/min
Pump 2
Chemiluminometer
WW
Sample

194
bottled water (S1), tap water (S2), fountain water (S3), irrigation ditch water (S4)(S5)
lake water (S6), sea water (S7) (S8) (S9), residual water from a factory (S10). Water
samples were collected, filtered through 0.45 µm and acidified to pH 2 with HCl.
Previously to the analysis, the samples were alkalised with NaOH to pH 6-7.
Depending on the ammonium concentration in the sample, sample volumes
ranged between 0.15 to 1.5 ml were taken. For bottled, tap, irrigation ditch and sea water
1.5 ml samples were processed. Lower volumes were taken for fountain (0.643 ml) and
lake water samples (0.188 ml). For residual water sample 0.12 ml of 1:10 sample dilution
was employed. The samples were also spiked with known amounts of the stock standard
solutions of ammonium to give added concentrations of 0.15 and 0.3 mg/L. In all cases
the volume of sample or sample plus spike was completed if necessary to 1.55 mL with
deionized water.
These volumes were processed according to the procedure described above for
standard solutions.
Kjeldahl treatment
Kjeldahl treatment was applied to 100 ml of fountain water (S3), irrigation ditch
water (S4), lake water (S6) and sea water (S9). For the application of Kjeldahl treatment
[21], 6.7 g of potassium sulphate, 0.52 g of red mercury oxide and 10 ml of concentrated
sulphuric acid, were added to 100 ml of sample in a digestion tube. Then, the tubes were
placed on Kjeldahl digestor, which was previously heated at 370ºC. Heating was running
until white fumes appeared and then, digestion continued for 30 minutes more. After that,
digestion residue was cooled and diluted up to 100 mL with nanopure water. Distillation
was performed by adding 35 ml of distillation reagent (25 g of sodium thiosulphate and
500 g of sodium hydroxide diluted up to 1L with nanopure water). Distilled ammonia was
picked up on 25 ml of 0.04 N sulphuric acid until 80 mL. This solution was adjusted to
pH 6-7 and diluted up to 100 mL. 1.55 mL of the resulted solution were processed
according to the procedure described above for standard solutions.
RESULTS AND DISCUSSION
Optimization of precolumn ammonium dansylation
Ammonium was derivatized according to the conditions established by Marcé et
al.[13] for polyamines, with some modifications. For establishing the optimal conditions
the dansylated derivatives were injected in the HPLC systems and the post column
chemiluminescence generation with TCPO was performed according to the procedure
described by our research group for aliphatic amines [16] (see experimental sectionand
Figure 1) in order to register the chromatograms. The dansylated ammonium eluted at
2.4 min (Figure 2).

195
FIGURE 2. Chromatograms corresponding to a blank reagent and standard solutions of
ammonium of 0.19 mg/L.
The chromatogram corresponding to the blank solution presented a peak at the
same retention time than ammonium peak which was dependent on the amount of solvent
(acetonitrile 1, Scharlau) used in the reagent solution. Different gradient elution modes
were assayed in order to separate the two peaks, and also a precolumn filled with CN,
C18, SCX or SAX packing, was inserted by means of a switching valve, but no
separation was obtained, so it was deduced that the blank peak was due to pollution of
organic solvent with ammonium.
Therefore, other solvents were tested: acetone, acetonitrile 2 (J.T.Baker),
tetrahydrofuran (THF), and methanol. The reagent mixture contained 0.9 mL of solvent
(0.72 mL plus 0.18 mL of the reagent solution of Dns-Cl 5 mM), 0.2 mL of 100 mM
carbonate buffer (pH 9) and 1 mL of nanopure water or ammonium standard.
Although with solvents like methanol or THF no significant peak appeared for
the blank at ammonium retention time, they were not appropriated due to in methanol the
post-column reaction efficiency decreased and in THF the dansylation reaction did not
take place. Acetone presented similar efficiency to acetonitrile 1, but the blank peak was
also significative. In acetonitrile 2 (J.T.Baker), no significative peak appeared for blank
register, and the signal for ammonium was good. According to these results, acetonitrile
from J.T Baker solvent was selected for further experiments. Then, several volumes of
the selected solvent were assayed. Figure 3 shows the influence of solvent volume on the
blank signal. The presence of 0.4 mL of acetonitrile in the reaction mixture was selected
as optimum due to provided the lowest blank signal without losing in ammonium
response.
0 1 2 3 4
Time (min)
ChemiluminescenceSignal
NH4+
Blank
Standard

196
FIGURE 3. Influence of solvent volume, employed in the reaction derivatization with dansyl
chloride (Conditions: DnsCl 0.45 mM), and reagent concentration (Dns-Cl) (Conditions:
Acetonitrile Volume 0.4 mL) on the blank signal.
The reagent concentration (Dns-Cl) in the mixture reaction was also studied in
the range 0.15-0.75 mM maintaining constant the acetonitrile volume at 0.4 mL. 0.3 mM
was chosen as optimum reagent concentration because provided a low blank signal
(Figure 3) without losing in ammonium response.
According to these results the optimal conditions were those shown in Table 1. In
this table are compared the conditions established by Marcé et al.[13] and those
optimized in this paper, as can be seen the original procedure has been simplified in order
to make it quicker.
TABLE 1. Comparison of the derivatization procedure for solution derivatization according
to Marcé et al and for that proposed in this paper.
Marcé et al. Procedure[13] Procedure optimized in this work
200 ì L sample/standard + 40 ìL internal
standard + 200 ìL saturated sodium carbonate
+ 400 ì L DnsCl 5 mg/ml in acetone
1.55 mL sample/standard + 50 ìL carbonate
buffer 0.2 M pH 9 + 400 ìL DnsCl 1.5 mM in
acetonitrile
Incubate in the dark overnight at room
temperature or for 10 min at 70ºC
Incubate 10 minutes at 70ºC
Add 100 ìL of proline solution (100 mg/ml)
and incubate in the dark for 30 minutes
Inject 20 ì L onto the HPLC system
Extract dansylated polyamines in 500 ìL of
toluene and mix for 30 seconds
Remove 400 ìL of organic phase, dry, and
redissolve with 800 ìL of acetonitrile
Pass the sample through a 0.45 ìm pore size
syringe filter
Inject 20 ì L onto the HPLC system
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Acetonitrile Volume (mL) or DnsCl
Concentration (mM)
BlankPeakHeigh(V)
Variable Acetonitrile Volume
Variable DnsCl concentration
Optimum conditions

197
Analytical performance characteristics
Table 2 shows the calibration graph obtained in the best conditions. Good
linearity was obtained between 0.027-0.75 mg/L of ammonium and the detection limit
established as the concentration required to generate a signal-to-noise ratio of 3, was 8
µg/L. The chromatogram corresponding to detection limit appears in Figure 4. The
achieved detection limit is far away from legislation limit established (0.5 mg/L for non
digested samples, and 2 mg/l for samples treated by Kjeldahl method).
TABLE 2. Equations of the calibration graphs obtained in several conditions. The analytical
signal used was peak height, except (*) where area instead of height was employed.
Condition
Dns-Cl
(mM)
NaCl
Calibration curve
Y = (a ±± sa) + (b ±± sb)· C
(n, r2
,sy/x)
Detection
Limit
(µg/L)
Linear
Interval
(mg/L)
[1] 0.15
Y = (12 ± 6) + (130 ± 10)· C
(5, 0.9814,9)
60 0.28-1
[2] 0.3
Y = (2 ± 7) + (960 ± 30)· C
(10, 0.9935, 16)
Y* = (3 ± 90) + (12300 ± 400)· C
(10, 0.9929, 205)
8 0.027-0.75
[3] 0.3 3.5 g/l
Y = (14± 5) + (930 ± 30)· C
(3, 0.9998, 3)
8 0.027-0.75
[4] 0.3 35 g/l
Y =(19 ± 14) + (980 ± 70)· C
(3, 0.9942, 16)
8 0.027-0.75
0 2 4 6 8 10
Time (min)
NH4+
R
MA
EA
N-PRA + DMA
BA
DEA PEA
HA
R
1
2
3
LD NH4+
FIGURE 4. Chromatograms
corresponding to 1: blank, 2:
ammonium standard of 8 µg/L
and 3: mixture of amines:
Methylamine (MA) 0.1 mg/L,
Ethylamine (EA) 0.2 mg/L, N-
Propylamine (N-PrA) 0.3 mg/L,
Dimethylamine (DMA) 0.3 mg/L,
Butylamine (BA) 0.3 mg/L,
Diethylamine (DEA) 0.5 mg/L,
Hexylamine (HA) 0.3 mg/L and
ammonium (NH4+) 1.5 mg/L.

198
Table 2 also reports the calibration graphs obtained by using a smaller reagent
concentration and the optimized reagent concentration in presence of different salinities.
The smaller concentration gave only 13 % of the sensibility provided by the optimized
reagent concentration. The slope values obtained for the salinities assayed were
statistically similar to that obtained in absence of NaCl at 95 % confidence level. Then,
the method is not influenced by the salinity.
The study of interday and intraday precision at different concentrations levels can
be seen in Table 3. The method provided good precision for interday and intraday
measures independently of the concentration, with relative standard desviation (%RSD)
between 2.6-7.2 % and 4-8.6 % respectively. So, repeatibility and reproducibility of the
method resulted satisfactory. The accuracy of the method was also tested analysing
several standards of known concentration, and as can be seen in Table 3, the results were
suitable with relative errors (%Er) between 5-9.8%.
TABLE 3. Interday and intraday precision (%RSD), and Accuracy (%Relative error, %Er),
provided by the method for different concentrations of ammonium. n, number of standards.
Interday precision Intraday precision Accuracy
NH4
+
(mg/l) %RSD (n) NH4
+
(mg/l) %RSD (n) NH4
+
(mg/l) %Er (n)
0.11 6.2 (5) 0.028 5.8 (4)
0.15
7.2 (4)
0.165 8.6 (5) 0.055 5 (4)
0.2 4.0 (3) 0.165 5.9 (3)
0.3
2.6 (4)
0.5 8.4 (3) 0.193 9.8 (3)
In order to study the selectivity of the method, and knowing the reactivity of
amino-compounds towards Dns-Cl reagent, amine interference was studied. Several
aliphatic amines, such as MA, EA DMA, N-PrA, BA, DEA, PeA and HA were tested.
Indeed, all these amine reacted with Dns-Cl, but their derivatives showed retention times
different of the ammonium dansylated derivative (see Figure 4). It was studied the
possibility of reagent consumption in presence of the different amines and ammonium at
concentration level of 0.1 mg/L. The ammonium recovery in a solution containing the
amines was 89.3%. Then, no significant differences were observed when the reaction
took place in presence of all the amines tested.
The proposed method was applied to the analysis of several real water samples
(see experimental section). As an illustrative example, in Figure 5, are shown the
chromatograms in triplicate obtained for residual (A) and lake (B) water.
Spiked samples with known amounts of analytes were used to validate the
method accuracy. When Standard Additions Method (MOSA) was applied, Natural (S1),
tap (S2), fountain (S3), irrigation ditch 2(S5), lake (S6) and residual (S10) waters

199
presented similar slopes to that obtained by the calibration graph with standards (see
Table 2) at 95 % confidence level as t tests [22] given in Table 4 show, therefore no
matrix effect was found. For sample S5 (irrigation ditch 1) both slopes, MOSA and
ammonium standard equation, were similar at 98 % confidence level. For the sea waters
only S7 provided similar slopes at 99 % confidence level, while S8 and S9 gave matrix
effect as can be seen in Table 4. When matrix effect is present, ammonium concentration
must be calculated by applying MOSA. The MOSA equations (ordinate: a(sa), slope:b(sb),
r2
, n, sy x) for S8 and S9 samples were : 57(5), 490(30), 0.9976, 4, 8.8 and 55(5), 320(30),
0.9707, 5, 8.6, respectively. The MOSA slopes were smaller than that corresponding to
the ammonium standard calibration graph (Table 2).
TABLE 4. t test for the comparison of the slopes of the ammonium standard calibration
graph and of the MOSA equations for all samples tested. The tabulated values correspond to
95 % confidence level except * (98 %) and **(99 %).
Sample Calculated
F
Tabulated
F
Conclusión 1 Calculated
t
Tabulated
t
Conclusión
2
S1-Bottled 3.988 17.443 Homogenous
variances
1.086 2.7767 Similar
slopes
S2-Tap 6.150 799.5 Homogenous
variances
2.940 3.1824 Similar
slopes
S3-Fountain 3.205 864.16 Homogenous
variances
0.614 2.7764 Similar
slopes
S4-Irrigation
ditch 1
1.606 864.16 Homogenous
variances
3.540 2.7764
3.7469*
Similar
slopes
S5-Irrigation
ditch 2
92.003 17.443 Non
homogenous
variances
2.024 12.603 Similar
slopes
S6-Lake 44.31 17.443 Non
homogenous
variances
1.264 12.496 Similar
slopes
S7-Marine 1 2.23 799.5 Homogenous
variances
3.894 3.1824
5.84**
Similar
slopes
variances
5.960 2.7764
4.6041**
Matriz
effect
variances
8.137 2.7764
4.6041**
Matriz
effect
S3- Kjeldahl 1.659 647.79 Homogenous
variances
0.071 4.3027 Similar
slopes
variances
0.057 2.5707 Similar
slopes
variances
2.311 4.3027 Similar
slopes
variances
0.619 2.7764 Similar
slopes
S10-
Kjeldahl
1.571 799.5 Homogenous
variances
1.179 3.1824 Similar
slopes

200
FIGURE 5. Chromatograms corresponding to water samples (in triplicate): A) Residual
water (0.12 mL of 1:10 diluted sample to 1.55 mL). B) Lake water (0.188 mL of sample to
1.55 mL).
The found spiked concentrations calculated employing the ammonium standard
calibration graph are shown in Table 5. Relative errors in concentration were below 10.7
% in all cases except sample S7, which presented MOSA slope similar to that provided
by ammonium standards at 99 % confidence level. Chromatograms for the fountain water
fortified with 0, 0.15 and 0.3 mg/L of ammonium are shown in Figure 6.
TABLE 5. Found ammonium concentration (mg/l) in the real samples spiked at different
concentration levels, assayed directly or after Kjeldahl treatment. In brackets, %Error
relative found for every sample at every concentration level.
Free ammonium After Kjeldahl treatment
Added NH4
+
0.15 mg/l
Added NH4
+
0.3 mg/l
Added NH4
+
0.15 mg/l
Added NH4
+
0.3 mg/l
Water Sample Found concentration (%Error) Found concentration (%Error)
S1-Natural 0.155 (3.3%) 0.268 (10.7%)
S2-Tap 0.141 (6%)
S3-Fountain 0.135 (9.3%) 0.299 (0.3%) 0.138 (8%) 0.299 (0.3%)
S4-Irrigation ditch1 0.145 (3.3%) 0.268 (10.7%) 0.141 (6%) 0.278 (7.3%)
S5-Irrigation ditch2 0.135 (10%) 0.271 (9.7%)
S6-Lake 0.145 (3.3%) 0.283 (5.7%) 0.169 (12.7%) 0.327 (9%)
S7-Marine1 0.189 (26 %) 0.354 (18%)
S9-Marine3 0.147 (2%) 0.291 (3%)
S10-Residual 0.149 (0.3%) 0.304 (1.3%) 0.148 (1.3%) 0.320 (6.7%)
0 1 2 3 4
Time (min)
NH4+
NH4+
A)
B)

201
FIGURE 6. Typical chromatograms for the fountain water (0.643 mL of sample to 1.55 mL)
fortified with 0, 0.15 and 0.3 mg/L of ammonium. n in the last column is the number of
solutions used for applying MOSA.
In Table 6 is described the screening response of the proposed method to all
samples assayed taking as reference the concentration limit established by legislation. As
can be seen, ammonium was found in S3, S6, S7, S8, S9 and S10, but only residual water
(S10) and Marine water (S7) exceed the limit established by legislation (0.5 mg/L). Table
6 also shows the ammonium content found by using the calibration graph of ammonium
(see Table 2) and MOSA method providing similar results. Fountain and residual waters
were also analysed by using OPA-NAC method [4]. The results were: 0.37(s=0.02, n=3)
and 32(s=0.4, n=3), respectively. Both values can be considered statistically equal (at a
confidence level of 95 % ) to those obtained by the proposed method. The quantified
ammonium in residual water should be observed with reserve due to the high dilution
carried out in the sample for both chemiluminescence and fluorescence methods.
A representative group of these samples were treated to evaluate Total Kjeldahl
Nitrogen (TKN). As t tests given in Table 4 indicate the slope of the MOSA method is
similar to that corresponding to the standard calibration graph of ammonium. Therefore
neither of the samples presented matrix effect even sea water and the ammonium
concentration in the samples was obtained directly from the calibration graph with
standards of ammonium (Table 5). The samples were also spiked with known amounts of
ammonium in order to validate the accuracy and the found ammonium concentrations are
shown in Table 4. As can be seen, low relative errors between 0.3 and 10.7% were
achieved.
0 2 4 6
Time (min)
S3
S3 + 0.15 mg/l NH4+
S3 + 0.3 mg/l NH4+
NH4+
NH4+
NH4+

202
Ammonium concentration was higher after Kjeldahl treatment in all samples
assayed. These results are shown in Table 6. As can be seen in this Table, fountain,
residual and lake water, gave a positive screening response, being its ammonium
concentration higher than limit established by legislation (2 mg/L).
TABLE 6. Screening response and ammonium concentration deduced on different samples
assayed.* Estimative values due to the high dilution of the sample carried out.
Sample
Legislation
limit (mg/l)
Screening
response
Ammonium Conc
(C ±± s) (mg/l) (n=3)
Standard Calibration
Ammonium Conc
(C ±± s) (mg/l) (n)
MOSA
S1-Natural 0.5 No - -
S2-Tap 0.5 No - -
S3-Fountain 0.5 No (0.367 ± 0.012) 0.347 (n=5)
S4-Irrigation
ditch1
0.5 No
- -
S5-Irrigation
ditch2
0.5 No
- -
S6-Lake 0.5 No (0.352 ± 0.014) 0.378 (n=5)
S7-Marine1 0.5 Yes (3.8 ± 0.1) 3.108 (n=5)
S8-Marine2 0.5 No Matrix effect 0.098 (n=5)
S9-Marine3 0.5 No Matrix effect 0.147 (n=5)
S10-Residual 0.5 Yes (30 ± 4) 30.69 (n=4)
S3 Kjeldahl 2 Yes (2.28 ± 0.12) 2.34 (n=3)
S4 Kjeldahl 2 No (0.56 ± 0.10) 0.595 (n=4)
S6 Kjeldahl 2 Yes (3.05 ± 0.13) 2.71 (n=3)
S9 Kjeldahl 2 No (0.81 ± 0.08) 0.885 (n=5)
S10 Kjeldahl 2 Yes (169 ± 18) 152.6 (n=4)
CONCLUSIONS
This paper studied the chemiluminescence detection of ammonium in order to
improve selectivity and sensitivity. The procedure used solution dansylation. The
dansylated derivative was chromatographed and mixed with TCPO/H2O2 in order to
generate chemiluminescence.
The quantification of ammonium at low levels (0.027-0.75 mg/l) is possible with
satisfactory accuracy (errors below 9.8%) and precision (%RSD between 2-8.6%). The
proposed method is selective in front of amine presence in the sample and it can be
applied for the screening and quantification of ammonium in water samples, being
detectable even concentrations of 8 µg/L, which are far away from limit established by
legislation (0.5 mg/l for non-digested water samples, and 2 mg/l for samples treated by
Kjeldahl procedure).
Ammonium can be quantified from standard calibration curve for almost all kind
of waters tested: bottled, tap, lake, fountain, irrigation and residual. However, two of the

203
three assayed marine water samples required the application of standard additions
method for the quantification of ammonium due to the presence of matrix effect but not
when the Kjeldahl treatment is applied.
Acknowledgements
The authors are grateful to the Ministerio de Ciencia y Tecnología of Spain for
financial support received for the realization of Project BQU2003-06138 . Susana
Meseguer Lloret expresses her gratitude to Ministerio de Educación y Cultura (Spain) for
the predoctoral grant.
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Smeyers-Verbeke. Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A, Elsevier,
Amsterdam 1997.

205
Apéndice 6.
TALANTA, REVISED PAPER
FI AUTOMATIC METHOD FOR THE DETERMINATION OF COPPER(II)
BASED ON COPROPORPHYRIN I - Cu(II) / TCPO / H2O2
CHEMILUMINESCENCE REACTION FOR THE SCREENING OF WATERS
S. Meseguer-Lloreta
, P. Campíns-Falcóa
, S. Cardenasb
, M. Gallegob
and M. Valcárcelb
*
a
Departamento de Química Analítica, Universidad de Valencia, Spain
b
Departamento de Química Analítica, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba,
Spain
Abstract
In this paper, an automatic method for the screening of water samples containing
Cu(II) was proposed based on peryoxalate chemiluminescence reaction, using
Coproporphirin I as fluorophor compound to provide selectivity, and a simple FI
chemiluminescence detector. FI system conditions were chosen in order to distinguish
samples over or under legislation limit established (50 µg/l), with high reliability. The
detection limit found was 9 µg/l and the linear dynamic range was from 15-125 µg/l of
Cu(II). Repeatibility and reproducibility studies gave good precision and accuracy with
%recovery near 100%. In that conditions, the method resulted selective and only Fe(II),
Fe(III) and Pb(II) could interfere, but at concentration level higher than their normal
concentration in waters. The proposed method was found to be reliable for screening
purposes and it was successfully applied to a variety of real water samples.
* Correspondence author. Tel./fax: + 34 957 218 616. E-mail address: qa1meobj@uco.es

206
1. Introduction
The chemiluminescence technique provides methods for trace analysis that are
attractive because of their high sensitivity and fast kinetics. This technique, combined
with FI systems provides good accuracy and precision.
Peryoxalate chemiluminescence reaction (TCPO/H2O2 system), has been
extensively used in recent years for liquid chromatography of fatty acids [1], synthesis,
characterisation and analytical evaluation of oxamide reagents [2], determination of
amphetamines in urine samples [3], inmunoassays [4], detection of proteins separated by
capillary zone electrophoresis [5], resolution of carboxylic acids by HPLC [6],
determination of cholesterol [7], detection of retinoids using normal-phase
chromatography [8] and the study of emission of spectroscopic properties of water
soluble porphyrins with d- and f- electron metals [9, 10]. The use of porphyrins can be
remarked by their high selectivity to metal ions [10].
Metal ions are usually introduced into water cycle by industrial dumping and
many of them present toxic effects for human life; therefore, their maximum tolerated
concentration have been fixed by legislation, being for copper(II) 50 µg/l [11]. In order to
control these values in real water samples, fast automatic systems are required; these type
of systems are called screening systems [12, 13], and provide a binary yes/no response
that let to distinguish samples containing Cu(II) over or under legislation level with good
reliability, fast speed, versatility and low cost.
Igarashi et al. [10] proposed an static method for Copper (II) determination based
on coproporphyrin I-Cu(II)/TCPO/H2O2 chemiluminescence reaction. Based on their
studies, we are proposing in this paper an automatic FI method for the screening of Cu(II)
in water samples.
2. Experimental
2.1 Apparatus
Flow injection chemiluminescence measures were carried out with a FireFly
Chemiluminescence Detector (Global FIA Inc. P.O. Box 480, Fox Island, WA 98333)
designed specially for use in flow through systems. Light generated in a liquid core
waveguide is internally reflected and transmitted to a small but powerful photo multiplier.
FI registers were monitored by an Hercule Lite-Chromatography interface connected on
line to a personal computer.
The flow system consisted of two Gilson Minipuls 3 peristaltic pump furnished
with poly(vinyl chloride) pumping tubes, two Rheodyne (Cotati, CA) 5041 injection
valves, PTFE tubing of 0.5 mm i.d., and a water bath provided by a heater magnetic
stirrer (Raypa, Spain).

207
Static chemiluminescence measures were registered with a Jasco FP-750 (Tokio,
Japan) fluorescence spectrophotometer. For the kinetics measure, the light emission was
monitored at 622 nm. The chemiluminescence was measured with a 1 cm path length
quartz cell and the last reagent (H2O2) was injected using a Hamilton Digital syringe
(Nevada, USA).
2.2. Reagents and standard solutions
All chemical reagents were of analytical grade or better. Copper (II) sulphate
pentahydrated, hydrogen peroxide 30%, nitric acid (Trace pur) 69% and sodium
carbonate were purchased from Merck (Germany); coproporphyrin I dihydrochloride was
from Aldrich Chemistry (Germany); Bis(2,4,6.trichlorophenyl) oxalate (TCPO) (Fluka
Chemika, Switzerland) was prepared in tetrahydrofuran (Scharlau, Barcelona, Spain) :
acetonitrile (J.T.Baker, Holland). Hexadecyltrimethylammonium chloride 25% (CTAC)
(Fluka Chemika, Switzerland) was prepared in 0.1 M pH 7.4 sodium tetraborate
decahydrated (Panreac, Barcelona, Spain); ammonium acetate was also from Panreac
(Barcelona, Spain). Metal interference solutions were prepared from nitrate or chloride
salt (Probus, Spain).
2.3. Sample preparation
5 ml (for Sample 1, 2, 3, 4), 9 ml (for Sample 5) or 3.65 ml (for Sample 6) of
water samples were added to 0.25 mL of borax buffer 0.2 M pH 7.4 and 0.1 ml of 10-4
M
coproporphyrin I and diluted up to 10 ml. Sample 1 was a synthetic natural water sample,
prepared carrying 26.7 mg/l of Ca(II), 106.5 mg/l of bicarbonate, 4.3 mg/l of Mg(II), 5
mg/l of Chloride, 12 mg/l of sulphate and 1 mg/l of fluoride.
For Standard Reference Material SRM®
1640, 3.72 mL of SRM®
containing 85.2
µg/l of Cu(II) (Reference value), were added to 0.1 ml of 10-4
M coproporphyrin I and 1.9
ml of ammonium acetate 1 M. The pH was adjusted to 5.35 and the mixture was diluted
up to 10 ml.
Water samples were measured directly and fortifying sample with 31.77 µg/l of
Cu(II) for S1, S2, S3, S4 and SRM; and with 50 µg/l for S5 and S6.
2.4. Screening procedure
In order to analyse copper (II) in waters, a FI automatic system was employed. It
can be seen in Figure 1. Two peristaltic pumps were used. Pump 1 consisted of two
carrier streams; in one of them, standards from 15 to 125 µg/l of copper (II), 10-6
M in
coproporphyrin I at 2.2 ml/min, pass through a 400 µl reactor on a water bath at 100 ºC
where flow was stopped for 5 min. After that, flow was started for 25 seconds in which
sample was cooled passing through one reactor of 200 µl and mixed with the other

208
CTAC/H2O2 stream (at 0.7 ml/min) in the second 200 µl coil to fill the 50 µl sample loop.
Pump 2 consisted of two water carrier streams. One of them at 5 ml/min passes through
sample loop(IV1), and the other at 2.9 ml/min passes through TCPO loop(IV2), previously
filled by means of a syringe. Injection valve positions were activated manually. When
injection valves were in position 1 (loading), only nanopure water was reaching the
chemiluminescence detector. Both injection valves must be switched to position 2
(injection) at the same time, in order to allow both sample and reagents plugs reaching
detector simultaneously. The height of the FI signal obtained must provide the binary
(yes/no) response.
FIGURE 1: FI system designed for the screening of water samples for copper (II) using a
quenching chemiluminiscence determination. IV, injection valve; CLD, chemiluminiscence
detector.
3. Results and discussion
3.1. Checking the FireFly Chemiluminescence Detector
The detector was checked following the FI procedure described by L.A. Tortajada
et al. [14] for Cr(III)/luminol/H2O2 reaction. Table 1 shows log-log calibration curves and
detection limits obtained by this investigation group in recent publications [14, 15, 16]
using a Hitachi F-4500 spectrofluorimeter and the same obtained with this new detector.
IV1
IV2
CLD
PUMP 1
(ml/min)
PUMP 2
(ml/min)
Standard/Sample
(10
-6
M Porphyrin)
CTAC 10
-2
M
H2O2 0.7 M
H2O
H2O
Water bath
100ºC
400 µl 200 µl
200 µl
50 µl
50 µl
TCPO
0.7
2.2
5
2.9 L = 7.5 cm
L = 12 cm

209
TABLE 1: Comparison of sensitivity of detectors for Cr(III)/luminol/H2O2
chemiluminescence reaction.
Reference (loga ±± sloga) (b ±± sb)
Detection
limit (µµg/l)
Detector
[14] (1.91 ± 0.03) (1.19 ± 0.03) 1.3 Hitachi F4500
[15] (1.97 ± 0.07) (1.25 ± 0.07) 1.2 Hitachi F4500
[16] (1.84 ± 0.03) (1.16 ± 0.03) 1.6 Hitachi F4500
This work (1.04 ± 0.06) (1.25 ± 0.06) 1.4 FireFly CLD
3.2. Optimization of the flow system
Emission chemiluminescence spectrum was obtained for a blank solution
following static conditions (1.12 µM coproporphyrin I, 0.0096 M CTAC, 1.795 mM
TCPO and 0.743 M H2O2). In Figure 2a) it can be seen that there is an emission
maximum at 622 nm. Reaction kinetics curve at 622 nm was also obtained. Figure 2b)
shows that the kinetics of this reaction was very fast, it took place in about 10 seconds.
FIGURE 2: a) Emission chemiluminescence spectrum for a blank. b) Reaction Kinetic curve.
Conditions: 1.12· 10
-6
M coproporphyrin I, 0.0096M CTAC, 0.743 M H2O2, 1.795 mM TCPO.
Optimization of the flow system was carried out with a blank solution using only
pump 2 and injecting both coproporphyrin I 10-5
M/H2O2 variable/CTAC variable/borax
0.1M pH 7.4 (IV1, loop 160 µl) and variable TCPO (variable ratio MeCN:THF) (IV2,
loop 200 µl) with a syringe (see Figure 1).
Table 2 shows the variables optimized, the range studied on each case and the
optimum variable selected. Firstly, the addition of CTAC was studied based on previous
0
20
40
60
80
100
0 50 100
Time (seconds)
b)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
400 500 600 700
λλ (nm)
a) Maximum 622 nm

210
studies [10]. Hydrogen peroxide and TCPO concentrations were varied according to
recent studies of the chemiluminescence reaction [2, 10]. These two reagents must reach
the detector separately in order to achieve the maximum sensitivity.
TABLE 2: Optimization of the chemical and physical variables of the FI system.
Variable Range studied Optimum
condition
CTAC conc
2· 10-5
– 9· 10-2
M 1· 10-2
M
H2O2 conc 0.1 – 1 M 0.7 M
TCPO conc 1 – 10 mM 5 mM
MeCN:THF ratio 0%:100% – 100%:0% 75%:25%
pH 4.7-10.3 7.4
Flow rate Pump 2 10 - 48 rpm 40 rpm
Loop Volume 50 – 500 µl 50 µl
Length from injection
valve (IV) to CLD
LIV1-CLD= 12 - 24 cm
LIV2-CLD=7.5 - 15 cm
LIV1-CLD= 12 cm
LIV2-CLD=7.5 cm
Length liquid core
waveguide
17 – 50 cm 17 cm
Coproporphyrin-Cu(II)
Reaction time
1 – 10 min 5 min
TCPO reagent was prepared in acetonitrile:tetrahydrofuran at different ratios
from 0:100 to 100:0. Best results were obtained for 75% acetonitrile:25% tetrahydrofuran
avoiding TCPO destruction and obtaining the best sensitivity.
CTAC/H2O2 reagent pH was studied using different buffer solutions at 0.1 M
concentration: pH 4.7 was studied in acetic/acetate buffer, pH 6.5 and 10.3 were studied
with carbonate/bicarbonate buffer and pH 7.4 was studied with borax buffer. Best results
were obtained at pH 7.4 with borax buffer.
Concerning the flow conditions, flow rate in pump 2 was varied from 10 to 48
rpm, and 40 rpm was selected as optimum, providing 5 ml/min for coproporphyrin I
stream and 2.9 ml/min for TCPO stream. Loop volume was also studied, and 50 µl were
selected because signal was more reproducible and pressure problems were avoided.
Due to the fast speed of the chemiluminescence reaction, another parameters
were optimised: distance from injection valves to chemiluminescence detector and length
of the liquid core waveguide. The length from injection valves (IV1 and IV2) to
chemiluminescence detector (CLD) (see Figure 1) was selected as the minimum possible.
This condition avoided reagent dispersion and improved sensitivity 10 times. The length
of the liquid core waveguide was also selected as the minimum possible for the detector,
and it improved the sensitivity about 2.5 times.

211
With those changes, coproporphyrin I concentration could be reduced to 1· 10-6
M
(lower coproporphyrin concentrations did not give reaction with Cu(II) with the
established conditions). Then, Pump 1 was added to the FI system and copper (II) was
introduced using the best conditions established for the optimisation of the Cu(II)-
coproporphyrin reaction time in the water bath; it was studied from 1 to 10 min, and it
was observed that quenching effect was better when reaction time increased, and 5 min
were selected.
3.3. Sensitivity and selectivity of the method
Calibration curves for Cu(II) were obtained in different conditions of Pump 1
flow rate and reaction time. Analytical figures of merit for the conditions assayed can be
seen on Table 3. When Pump 1 flow rate was 0.7 ml/min for coproporphyrin carrier and
0.5 ml/min for CTAC/H2O2 carrier, calibration curves were obtained stopping flow for 5
min in the heating bath (t1) and 2 or 5 min in the second reactor of the flow system (t2) in
order to cool the reaction mixture. Good reproducibility for the same conditions can be
observed comparing the first and second calibration curve, being %Recoveryb of 97%.
Increasing t2 from 2 min to 5 min, increased the sensitivity 1.65 times.
TABLE 3: Cu(II) calibration curves and figures of merit in different conditions. (LI: linear
interval; DL: detection limit).
vpump1 (ml/min)
(porph.carrier/
CTAC-H2O2
carrier)
t1
(min)
t2
(min) a ±± sa b ±± sb
LI
(µµg/l)
DL
(µµg/l)
n, r2
, sy/x /b
0.7/0.5 5 2 4300 ± 40 -18.3 ± 0.7 0-125 17 12, 0.984, 5.38
0.7/0.5 5 2 4370 ± 110 -18.9 ± 1.3 0-125 17 8, 0.972, 8.96
0.7/0.5 5 5 6770 ± 30 -30.7 ± 0.4 0-125 10 5, 0.999, 1.32
2.2/0.7 4 0 3840 ± 20 -19.0 ± 1.0 0-32 17 4, 0.994, 1.22
2.2/0.7 5 0 4255 ± 18 -36.6 ± 1.0 0-32 8.7 4, 0.999, 0.58
2.2/0.7 5 0 5010 ± 50 -30.7 ± 0.8 0-100 10 10, 0.994, 2.83
When Pump 1 flow rate was fixed at 2.2 ml/min for coproporphyrin carrier and
0.7 ml/min for CTAC/H2O2 carrier, the flow was not halted in the second coil in order to
eliminate a dispersion phase. Calibration curves were obtained for t1 = 4 or 5 min in the
interval 0-32 µg/l. Results showed that sensitivity was increased near 2 times for t1= 5
min, obtaining the best detection limit at the level of 8.7 µg/l, level that was 5.8 times
lower than limit established by legislation for Cu(II) in waters (50 µg/l). Calibration curve
was also obtained with that conditions in the range from 0 to 100 µg/l which was the
linear dynamic range because signal remained constant at higher Cu(II) concentrations. FI
registers obtained can be seen on Figure 3. Limits of detection, which are shown in
Table 3, were calculated as 3· sblank/b, being sblank = 105.96 (n=9).

212
FIGURA 3: Cu(II) calibration curve FI registers.
Repeatability and reproducibility studies were carried out for standards analysed
in triplicate. Repeatability studies were obtained for a standard of 15.9 µg/l with a %RSD
of 16%. Results for reproducibility studies were obtained for a standard of 17.3 µg/l of
Cu(II), and %RSD was 12%. The recoveries obtained for repeatibility and reproducibility
studies were 93 % and 109 %. These values are in accordance with the required accuracy
in trace analysis.
Results obtained with the Standard Reference Material SRM®
1640 analysed,
demonstrated the accuracy of the method, giving a Copper (II) concentration found of (96
± 14) µg/l (Reference value of SRM 1640: 85.2 µg/l). The percentage of recovery was
(113 ± 17) % (n=3).
In order to study the selectivity of the method, several metal ions were studied
with this FI system. Na+
, Mg2+
, K+
, Ca2+
, Ag+
, Mn2+
, Ni2+
and Zn2+
only interfere at high
0.00 4.00 8.00
Time (min)
0.00
2000.00
4000.00
6000.00
0 µg/l
31.8 µg/l
47.7 µg/l
79.4 µg/l
95.3 µg/l

213
levels, between 5 and 500 mg/l, which are not usual in water samples. Al(III), Sn(II),
Pb(II), Hg(II), Fe(II), Fe(III), Cd(II), Cr(III) and Co(II) were also studied. Their limit of
tolerance (concentration at which signal was modified more than 10%) was lower, but
this was over limit established by legislation. Only Pb(II), Fe(II) and Fe(III) had their
limit of tolerance under limit established by legislation, but it was over its usual
concentration in waters. Therefore, we concluded that the method was selective to Cu(II).
These results can be observed on Table 4.
Table 4: Interference study.
Interference
ion
Legislation
limit (µµg/l)
Concentration in
natural waters (µµg/l)
Limit of tolerance
(µµg/l)
Al(III) 10 3000
Fe(III) 2000 500 2000
Fe(III) 2000 500 2000
Sn(II) 300
Pb(II) 50 1 30
Hg(II) 1 0.07 300
Cd(II) 5 0.03 30
Co(II) 0.05 30
Cr(III) 50 1 3000
3.4. Reliability of the screening method for Cu(II) determination
The confidence level of the proposed sample screening system can be established
on the basis of the percentage of false positives and false negatives through a simple
chemometric study. The cut-off level was set at a concentration corresponding to two
times the detection limit (2DL). A false positive corresponded to a water sample
containing a Cu(II) concentration lower than the cut-off level but giving a positive
response. A false negative is obtained when a water sample with an analyte concentration
higher than that of the cut-off, provides a negative response in the detector. About 65
standards were measured at concentrations near detection limit: 0.5LD, 1LD, 1.5LD,
2LD, 3LD, 3.5LD µg/l. In Figure 4 can be seen that the percentage of false positive was
0% at 0.5DL, increasing at 9% for 1DL and 25% for 1.5DL. The percentage of false
negatives was 6% for 3DL and 0% at 3.5DL. Considering that his value was far away
from legislated value (50 µg/l), the proposed procedure can be used for the screening of
Cu(II) in water samples.

214
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
4,3 8,7 13 17,3 26 30,3
%FP%FN
µg/l
Detection
Limit
Cut-off
level
0.5DL
1DL
1.5DL
2DL 3DL 3.5DL
FIGURE 4: Reliability of the screening method. Standard solutions (n=65) of Cu(II) at
concentration near detection limit(DL). %FP=Percentage of false positives;
%FN=Percentage of false negatives.
3.5. Application to real water samples
The method was applied to the determination of Cu(II) in real water samples (see
Table 5). A synthetic water sample (S1), three natural water samples (S2, S3, S4), tap
water sample (S5) and a fountain water sample (S6) were analysed and only fountain
water sample gave a positive response. The recoveries obtained for all samples
demonstrated the accuracy of the method being between 83 and 119% of recovery.
TABLE 5: Results obtained in the Cu(II) determination in real water samples.
Sample Screening
response
Conc. Found
(C ±± s) (µµg/l)
Concentration
added (µµg/l)
%Rec ±± s
S1, Synthetic
sample
No - 31.77 92 ± 16 (n=6)
S2, natural water No - 31.77 102 ± 19 (n=3)
S5, tap water No - 50 83 ± 11 (n=3)
S6, fountain water Yes (61 ± 5) (n=8) 50 119 ± 12 (n=3)

215
4. Conclusions
The proposed method can be used as an automatic system for screening of Cu(II)
in water samples providing good results in terms of sensitivity, repeatability,
reproducibility, precision, accuracy and selectivity. It allows filtering sample set of study
with good reliability, low cost, versatility, speed and minimization of operator errors,
providing the analytical information of client interest.
Acknowlegements
The authors are grateful to the Ministerio de Ciencia y Tecnología for financial
support. S.M.Ll. expresses her gratitude to Ministerio de Educación y Cultura (Spain) for
the predoctoral grant. Financial support from the Spanish DGICyT (Grant BQU2001-
1815) is gratefully acknowledged.
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Talanta 60 (2003) 257-268.

217
Apéndice 7.
S. Meseguer-Lloret, P. Campíns-Falcó, L. A. Tortajada-Genaro, F. Blasco Gómez.
Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Valencia
A guide to avoid method bias of Chromium (III, VI) chemiluminescence determination by
luminol-hydrogen peroxide reaction. Application to water samples.
Intern. J. Environ. Anal. Chem. 83 (5) (2002) 405-416.
Enlace URL: http://www.tandf.co.uk/journals/titles

219
Apéndice 8.
Y. Moliner-Martínez, S. Meseguer-Lloret, L. A. Tortajada-Genaro, P. Campíns-Falcó.
Influence of water sample storage protocols in chemiluminescence detection of trace
elements.
Talanta 60 (2003) 257-258.

221
Apéndice 9.
P. Campíns-Falcó, L. A. Tortajada-Genaro, S. Meseguer-Lloret, F. Bosh-Reig.
Multivariate calibration applied to simultaneous determination of cobalt and chromium.
Anal. Bioanal. Chem. 374 (2002) 1223-1229.
Enlace URL: http://springerling.metapress.com

223
Apéndice 10.
UNPUBLISHED PAPER
MODIFIED ROTH´S FLUORIMETRIC METHOD FOR WATER SAMPLES:
AMMONIUM AND PRIMARY AMINE GROUPS DETERMINATION AND
UTILITY IN TOTAL NITROGEN KJELDAHL.
S. Meseguer Lloret, J. Verdú Andrés, C. Molins Legua and P. Campíns Falcó*
Department of Analytical Chemistry, University of Valencia, Dr. Moliner 50, 46100-
Burjassot, Valencia, Spain.
e-mail address: pilar.campins @ uv.es. Tel.: +34-96-3983002; Fax: 34-96-3864436.
Abstract
A method for the simultaneous determination of primary amino groups and
ammonium ion was proposed. The method is based in solution derivatization with o-
Phthaldialdehyde / N-acetyl-cisteine (OPA/NAC) and fluorescence measurement of the
formed isoindols. Analytical characteristics and the description of the developed
procedure are provided. Calibration graph was obtained for ammonium (up to 1.44 mg/L
of N) and for methylamine (up to 0.282 mg/L of N) as primary amino group model
compound. Bivariate and multivariate calibration models were tested. The limits of
detection were 0.07 mg/L of N and 0.004 mg/L of N for ammonium and amine,
respectively.
The procedure was first applied directly to standard solutions containing
ammonium and amine and secondly to digested solutions by Kjeldahl. The results
obtained allowed to establish if the best digestion conditions are achieved, in order to
perform the total amine conversion into ammonium.
This procedure has been also applied to real samples (irrigation ditch water,
residual water and fountain water) and the concentration of primary amine groups and
ammonium has been evaluated. The results obtained after Kjeldahl digestion has allowed
to estimate the total Keldahl N contained in the samples. The samples were also analysed
by Nessler method and similar results were obtained.

224
INTRODUCTION
Ammonium is a micronutrient in water systems which is an important link in the
nitrogen cycle of aquatic ecosystems. However, its determination is still a delicate task,
due to it is high susceptibility to contamination, and the classic methods does not appear
to be well controlled in many laboratories [1]. Ammonium can be found in superficial,
subterranean or marine waters at low concentrations, about 10 µg/L. In residual waters it
can be found at high concentrations, about 30 mg/L due to ammonification and nitrate
reduction processes. Often, it can be found together with short-chain aliphatic primary
amines (mainly methylamine) because they are widely distributed in the environment.
Aliphatic amines are used in several chemical and manufacturing industries and are also
common components of biological systems as degradation products of organic material
such as amino acids and proteins. Besides hygienic problems due to the stinging smell,
these compounds may be hazardous to human health. In addition, they can react with
certain nitrogen-containing compounds to form nitrosamines, which are potentially
carcinogenic substances [2]. Consequently, there is an increasing interest in the
determination of aliphatic amines in various aqueous matrices. The tolerable limits for
amines are regulated as Kjeldahl Nitrogen (which include ammonium and organic
nitrogen), being between 15 and 85 mg/L for residual waters and 1 mg/L for tap water.
Liquid Chromatography combined [3] or not with derivatization [4], is generally
used for the analysis of ammonium and aliphatic amines in aqueous media. Unbiased
UV-vis or fluorimetric methods are not found in the literature, which could be used as
screening sample methods in order to reduce costs and saving time in the environmental
laboratory or in situ determinations. The Roth´s fluorimetric method [5-7] for the
determination of primary amino compounds by use of a thiol and o-Phthaldialdehyde
(OPA) as derivatizing reagents could be adapted to the determination of ammonium and
total primary amine groups. In previous studies, we have proposed the use of OPA and
the thiol N-acetyl-cisteine (NAC) reagents for the unbiased fluorescent ammonium
determination in water samples [9] exciting at 415 nm. Some advantages over ammonium
reference methods, such as Nessler reagent method or the ammonium selective electrode
method, are the lower detection limit, the absence of any systematic error and amines
interference and less toxicity of reagents. Other methods exist for measuring ammonium
with (OPA)-derivatization reactions, such as OPA-sulphite reagent [10] or OPA-
tioglycolate [11] by forming fluorescent derivatives.
Recently we have reported the determination of primary amine groups in water
samples, by performing amine derivatization on C18 cartridges and using OPA-NAC
reagents [12] and 333 nm as excitation wavelength. The response of several primary
amino groups in the OPA-NAC reaction was demonstrated similar in [12], so it was
possible to estimate the total primary amine concentration in water employing the
calibration graph of methylamine as model compound. By using this solid phase assisted
derivatization procedure, ammonia concentrations up to 1.5 mg/L was not an interference
species.

225
In this paper, however, we have studied the simultaneous determination of
ammonium and methylamine as model compound of primary amine groups by using
solution derivatization with OPA-NAC reagent, two different excitation wavelengths and
a multivariate calibration methodology. When samples are excited at 333 nm, the
determination of primary amines or ammonium can be performed measuring the signal at
440 nm. On the other hand, when samples are excited at 415 nm, selective determination
of ammonium is performed measuring at 485 nm. Also Principal Component Regression
was tested using the spectra of emission obtained exiting at 333 and 415 nm.
The method has been applied before and after Kjeldahl sample treatment, and it
can be a good indicator of the organic nitrogen present in the sample and if the Kjeldahl
procedure fails in the conversion to ammonium of the primary amine groups. The method
was applied to several real samples, and the results were compared with the Nessler
reference method, obtaining good values.
2.EXPERIMENTAL
Apparatus
All spectrophotometric and spectrofluorimetric measurements were made on a
Hewlet-Packard (Avondale, PA, USA) HP 8452 diode array spectrophotometer furnished
with a 1 cm path length, and Hitachi F-4500 fluorescence spectrophotometer,
respectively. The pH was measured with a Crison micropH 2000 pH-meter.
Digestion Unit for Kjeldahl treatment was a Tecator Digestion system 6, 1007
Digestor (Höganäs, Sweden), and Distillation Unit was a Büchi 323 Distillation Unit
(Switzerland).
Reagents and standard solutions
All solutions were prepared in nanopure water and all reagents were of analytical
grade. Stock standard solutions of ammonium were prepared by dissolving ammonium
chloride (Probus, Spain) in nanopure water (100 or 1000 mg/L). Standards solutions with
variable amounts of ammonium were obtained by dilution. Methylamine (MA) solutions
were prepared in the same way.
OPA-NAC method: OPA (Fluka chemika, Switzerland)/NAC (Fluka chemika,
Switzerland) were prepared with a 1:1 ratio at 8.8mM, dissolving OPA reagent with 5%
of MeOH (Scharlau, Spain). Borate buffer (0.5 M), pH 10.8 was prepared by dissolving
an adequate amount of boric acid (Scharlau, Sapin) in water and then adjusting the pH
with NaOH (Panreac, Spain). Ethylamine (EA), N-Propylamine (N-PrA), Isopropylamine
(IPA), Butylamine (BA), Pentylamine (PeA), Hexylamine (HA), Dimethylamine (DMA),
Diethylamine (DEA), and β-Phenylethylamine (β-FEA) (Sigma, Germany) solutions at
0.75 mg/L level were prepared. Other concentrations assayed appear in the text. Mixtures

226
of amines: 0.75 mg/L EA and 0.75 DEA; 0.5 DMA, 0.5 N-PrA and 0.5 IPA; 0.75 BA and
0.75 PeA; 0.75 β-FEA and 0.75 HA were also used.
Nessler method [13]: Sodium-potassium tartrate solution (Panreac, Spain) was
prepared by dissolving 50g of the compound in 100 ml of nanopure water and Sodium
hydroxide (Panreac, Spain) by dissolving 12g of the compound in 50 ml of nanopure
water. Nessler reagent (NR) was prepared by dissolving 3g of mercury chloride (Merck,
Germany) in the minimum amount of nanopure water; 10 g of potassium iodine
(Guinama, Spain) was diluted up to 50 ml, and then it was added to mercury chloride
solution until a red precipitate appears; then the solution was decanted; 18g of sodium
hydroxide was diluted up to 100 ml and 40 ml of this solution were added to the HgI4
2-
solution; the final solution was diluted up to 100ml.
Kjeldahl treatment: For sample or standard digestion, red mercury oxide
(Panreac, Barcelona, Spain), potassium sulphate (Prolabo, Fontenay, France) and
sulphuric acid (Fluka Chemie, Steinheim, Switzerland) were used. Distillation reagent
was prepared by dissolving 25 g of sodium thiosulphate (Prolabo, Fontenay, France) and
500 g of sodium hydroxide (J.T.Baker, Deventer, Holland) together in 1L of nanopure
water.
Procedures
Standard solutions
OPA/NAC reaction
In a quartz cuvette were placed variable volumes of ammonium and/or amine
(alone or mixed) stock solution and nanopure water if necessary up to a volume of 1 mL
, 0.1 mL of borate buffer 0.5 M (pH= 10.8) and 0.9 mL of OPA/NAC reagent. The
reaction was assumed to start after the addition of the last drop of OPA/NAC reagent.
Each experiment was assayed by recording spectra emission between 430-600 nm (λ exc=
415) and 380-610 nm (λ exc = 333) - over the reaction time ranged 0-300 seconds. Signal
was obtained at 120 seconds for λex = 333 nm λ em = 440 nm, and at 300 s for λex = 415
nm λ em = 485 nm. All measurements were performed at 25ºC. The ammonium and
methylamine concentrations were ranged from 0 to 1.75 mg/L and 0-0.625 mg/L
respectively, following a 52
design (Table 1).
TABLE 1. Code and concentration (mg/L) of standard calibration set (5
2
design).
NH4
+
MA
(mg/L)
0 0.25 0.375 0.5 0.625
0 00 01 02 03 04
0.25 10 11 12 13 14
0.75 20 21 22 23 24
1.25 30 31 32 33 34
1.75 40 41 42 43 44

227
Nessler reaction
In a plastic cuvette were placed volumes varied of ammonium stock solution, 10
µL of sodium-potassium tartrate (0.177 M) and water up to constant volume (2.4 mL), 0.1
mL of NaOH 6M and 0.1 mL of Nessler reagent were added to the mixture. The reaction
was assumed to start after the addition of the last drop of reagent. Each experiment was
assayed by recording spectra between 300-700 nm at 30 s intervals over the reaction time
ranged 0-600 seconds. Signal was obtained at 425 nm and 400 seconds. Absorbance
signal was measured against water blank. All measurements were performed at 25ºC.
Kjeldahl treatment
For the application of Kjeldahl treatment [14], several digestion-distillation
conditions were assayed (see Table 2). In the digestion step, potassium sulphate amount
was varied in the range 2.22-10.5 g, mercury oxide between 0.0332-0.525 g and
concentrated sulphuric acid between 3.39-12 mL. A standard volume of 100 mL was
added to the mixture and then, the tubes were placed on the Kjeldahl digestor which was
previously heated at 370ºC. Heating must be running until white fumes appeared
(digestion time near 90 minutes) or must be continue for 30 minutes more (digestion time
of 120 minutes). After that, digestion residue must be cooled and diluted up to 50 mL
with nanopure water. Distillation must be performed by adding variable volumes (25-50
mL) of distillation reagent (NaOH/Na2S2O3). Distilled ammonia must be picked up on 25
ml of 0.04 N sulphuric acid and the distillation finished when the volume was 80 mL.
Collected solutions were diluted up to 100 mL. Before standard procedure the pH of the
solutions was adjusted to 10.5.
TABLE 2. Different Kjeldahl conditions assayed.
Condition
m(K2SO4)
(g)
m(HgO)
(g)
V(H2SO4)
(mL)
Digestion
Time (min)
V(NaOH/Na2S2O3)
(mL)
1 2.224 0.0332 3.39 90 25
2 2.224 0.0332 3.39 120 25
3 10.5 0.525 12 120 50
4 6.7 0.1 10.2 120 30
5 6.7 0.1 10 120 40
6 6.7 0.525 10 120 30
Water samples
Environmental water samples with unknown ammonium concentration were
analysed. They were named as S1: Irrigation ditch water, S2: Residual water from a
factory and S3: fountain water.

228
Sample treatment
The samples or standards were treated in order to eliminate residual chloride and
cation interference, according to the reference standard method [15]. A 100 mL portion of
water (real or standard) was subjected to sample treatment by adding 1 mL of dechlorant
sodium sulphite 7.14 mM and 1 mL of zinc sulphate heptahydrated 0.348M. The formed
precipitate was filtered and the first 25 mL of the sample were wasted, collecting the rest
of the sample. The pH was adjusted to 2 with concentrated H2SO4 for sample
conservation. Sample pH was adjusted to 10.5 before OPA/NAC or Nessler reactions
were carried out.
OPA/NAC reaction: 1 mL of treated standards or sample for S1 and S3, and 0.1 mL
diluted up to 1 mL for S2, were analysed by adding reagents as explained above for
standards.
Nessler reaction: 2.4 mL of treated standards or sample for S1 and S3, and 0.1 mL
diluted up to 2.4 mL for S2, were analysed by adding reagents as explained above for
standards.
Kjeldahl treatment
100 mL of sample were treated by Kjeldahl method (condition 6, Table 2) for S1 and S3;
for S2, 7 mL of sample was diluted up to 100 mL before applying Kjeldahl method.
Kjeldahl method was applied in triplicate for each sample. When OPA/NAC reaction was
applied, 1 mL of digested sample for S1 and S3, and 0.3 mL of digested sample for S2
diluted up to 1 mL, were used. When Nessler method was applied, the volumes of
digested sample employed were 2.4 mL for S1 and S3, and 0.5mL diluted up to 2.4 mL
for S2.
Calculations
The data were aligned according to the maximum emission signal for Principal
Component Regression (PCR). For all calculations, Unscrambler (CAMO, Norway) and
Matlab for Windows (Math Works, Natick, MA) were used.
Calibration step
According to a previous work [12], standards of Methylamine, Ethylamine, N-
Propylamine, Isopropylamine, Butylamine, Pentylamine, Hexylamine, and β-
phenylethylamine provided similar response between them when concentration was
expressed in mg/L of Nitrogen, with %Recovery respect to methylamine signal of 100,
93.5, 101.1, 93.4, 89, 100.4, 108.2 and 99 % for each amine, respectively. The same
emission maxima located at 440 nm were also obtained for all of them exciting at 333 nm
(Figure 1). The additivity between different amine signals was tested analysing mixtures
of amines (see experimental section). %Recoveries obtained were between 81-88%. With
these results, it was corroborated that the amine response in the OPA-NAC reaction was
not dependent on the primary amine, and methylamine could be used as a representative
compound.

229
FIGURE 1. Fluorescence emission spectra for a standard of 1.75 mg/L of ammonium and a
standard of 0.375 mg/L of methylamine, both at λexc =333 nm and at λexc=415 nm.
In order to study the simultaneous determination of ammonium and primary
amines (c.a. methylamine), a design 52
was assayed (Table 1). Both, Ammonium and
primary amine, provide fluorescent signal measuring at λem 440 nm if λex was 333 nm,
although the emission maximum for ammonium was 462 nm (Figure 1). There were not
significative differences at 95 % confidence level (homogenous variance, Fcal<Ftab-α=0.05,
and comparable slopes, tcal<ttab-α=0.05) between the amine calibration graphs obtained with
different constant amounts of ammonium ranged from 0 to 1.75 mg/L (Table 3). The
contribution of the ammonium to the total signal can be seen in the corresponding
ordinate values. This fact corroborates the additively of ammonium and amine signals.
The same is true for ammonium slopes and ordinates obtained in presence of different
amine amounts (Table 3). The mean slopes obtained at 440 nm for amine and ammonium
were 6532 (s= 472, n= 5) and 1038 (s= 127, n= 5) and expressed considering N 2950 (s=
213, n= 5) and 855 (s= 104, n= 5), respectively. These values indicated that the amine
isoindols are 3.5 times more sensitive than ammonium isoindol exciting at 333 nm and
measuring at 440 nm.
Figure 1 shows the registers obtained for ammonium and methylamine exciting
at 415 nm. Blank signal was obtained for the amine and a maximum at 485 nm for
ammonium. As can be seen in Table 3 at the selective excitation wavelength for
ammonium, that is λex 415 nm (λem 485 nm) the same calibration graph was obtained in
presence or absence of amine. For different amounts of amine present the ordinates were
similar to that provided by the ammonium calibration graph, its contribution being due to
the blank reagent. The ammonium calibration graph at 485 nm and the ammonium and
amine calibration equations at 440 nm, exciting at 415 and 333 nm respectively, were
needed to estimate both analytes as demonstrated in the following.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
380 430 480 530 580
λλ (nm)
FluorescenceSignal
MA
λexc = 333 nm
NH4
+
λexc = 333 nm
NH4
+
λexc = 415 nm
MA
λexc = 415 nm

230
Conclusion2
-
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
-
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
-
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
Similar
Slopes
ttab
αα=0.05
-
2.36
2.31
2.31
2.36
-
2.57
3.18
2.78
4.30
-
2.57
2.78
2.78
2.78
tcalc
-
0.18
0.63
0.63
2.02
-
0.74
1.40
1.06
0.48
-
0.37
0.94
0.79
1.04
Conclusion1
-
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
-
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
-
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Homogenic
variances
Ftab
αα=0.05
-
8.43
14.89
14.89
39.30
-
12.22
38.51
17.44
647.79
-
39.17
39
39
39
Fcalc
-
3.33
2.03
7.49
13.65
-
3.34
1.84
3.89
2.04
-
1.59
1.18
1.49
2.04
Calibrationcurve
Y=(a±sa)+(b±sb)·C(n,r2
,sy/x)
Y=(900±300)+(7000±600)·C
(7,0.9663,300)
Y=(1400±500)+(6800±1100)·C
(4,0.9528,300)
Y=(1810±170)+(6500±500)·C
(5,0.9883,200)
Y=(2100±90)+(6600±200)·C
(5,0.9969,100)
Y=(2840±50)+(5760±160)·C
(4,0.9985,60)
Y=(900±300)+(1200±200)·C
(3,0.9698,150)
Y=(2500±110)+(1050±120)·C
(6,0.9511,190)
Y=(3570±180)+(860±160)·C
(4,0.9342,200)
Y=(4000±110)+(980±110)·C
(5,0.9630,170)
Y=(4200±400)+(1100±300)·C
(3,0.9196,400)
Y=(110±50)+(680±40)·C
(4,0.9942,50)
Y=(110±50)+(660±50)·C
(5,0.9853,70)
Y=(90±40)+(640±30)·C
(4,0.9943,50)
Y=(110±30)+(640±30)·C
(4,0.9956,40)
Y=(110±30)+(640±30)·C
(4,0.9967,40)
Analytes
MA
MA+
0.25mg/lNH4
+
MA+
0.75mg/lNH4
+
MA+
1.25mg/lNH4
+
MA+
1.75mg/lNH4
+
NH4
+
NH4
+
+
0.25mg/lMA
NH4
+
+
0.375mg/lMA
NH4
+
+
0.5mg/lMA
NH4
+
+
0.625mg/lMA
NH4
+
NH4
+
+
0.25mg/lMA
NH4
+
+
0.375mg/lMA
NH4
+
+
0.5mg/lMA
NH4
+
+
0.625mg/lMA
λλexc(nm)
333
333
333
333
333
333
333
333
333
333
415
415
415
415
415
Table3.Analyticalparametersandstatisticalresultsformethylsmineinpresenceofvariableamountsofammoniumandforammoniumin
presenceofvariableamountsofmethylamine.

231
The obtained emission spectra exciting at 415 and 333 nm for the standards
(Table 1) were processed by using principal component regression (PCR) in order to
develop a multivariate model to ammonium and amine, respectively. Top-Down
selection (TDS) and Best-Subset selection (BSS) have been employed to perform the
calibration step [16]. PCR models were obtained using as X-block the data (column
centred). The number of variables, the percentage of explained variance, the number of
factors and root mean squared errors of prediction (RMSECV) by leave-one-out cross-
validation are given in Table 4. RMSECV values were calculated in order to evaluate the
prediction ability of models. For methylamine there are no differences between the two
options of selection, and a model with complexity three has been selected. For
ammonium PC number 2 is not included in the model with BSS selection, and only PCs
number 1 and 3 have been used (complexity two). In a second step, variable selection on
the optimised model by using the Uninformative Variable Elimination (UVE) approach
has been used [17]. Only 32 and 29 original variables have been used for methylamine
and ammonium, respectively. In both cases a final model complexity two has been
selected. The RMSECV values obtained are good as can be seen in Table 4 for all
models, although UVE-BSS models were selected.
TABLE 4. Characteristics of Principal Component Regression Models obtained for
Ammonium and Methylamine by using Top-Down Selection, Best Subset Selection or
Uninformative Variable Elimination-Best Subset Selection.
Ammonium
(ëexcitation 415 nm)
Amine
(ëexcitation 333 nm)
TD BSS UVE-BSS TD BSS UVE-BSS
Number of
variables
231 231 32 180 180 29
Selected PCs 1,2 1,3 1,2 1,2,3 1,2,3 1,2
Explained
variance,
block X
99.999 99.999 99.999 99.999 99.999 99.999
rmsecv 0.089 0.051 0.052 0.034 0.037 0.040
Accuracy and precision
Taking into account previous results, the standards were analysed. The
measurements were performed exciting at 415 and 333 nm and using the ammonium
calibration graph at 485 nm and the ammonium and amine calibration equations at 440
nm, respectively. Table 5 shows the ammonium and amine concentration found in the
different mixtures assayed. Satisfactory results were obtained in all cases with relative
errors for amine and ammonium contents between 7-8 % and 4-24 % and relative
standard deviations between 6-13 % and 1-9 %, respectively.
Te same mixtures were analysed by using the PCR model. Improved results were
obtained for accuracy of ammonium. The relative errors found were between 1-16 %.

232
TABLE 5. Found amine and ammonium concentration in standard solutions (mixtures of
ammonium and Methylamine) and real samples by applying bivariate calibration graphs with
standards or PCR.
Found ammonium (mg/L)
Found amine
(methylamine)
(mg/L)Samples
Added
NH4
+
(mg/L) Bivariate
Calibration
PCR
Added
MA
(mg/L) Bivariate
Calibration
PCR
0.25 0.31 ± 0.03 0.29 ± 0.02 0.25 0.23 ± 0.03 0.26 ± 0.02
0.75 0.89 ± 0.04 0.76 ± 0.06 0.375 0.35 ± 0.02 0.40 ± 0.06
1.25 1.14 ± 0.03 1.23 ± 0.07 0.5 0.46 ± 0.06 0.50 ± 0.04
Standard
1.75 1.68 ± 0.02 1.74 ± 0.06 0.625 0.58 ± 0.04 0.58 ± 0.09
Sample 1 n.d n.d. 0.051 ± 0.007 0.086 ± 0.009
Sample 2 24.92 ± 0.10 32.2 ± 0.4 8.8 ± 0.4 10.25 ± 0.14
Sample 3 0.36 ± 0.03 0.29 ± 0.05 0.058 ± 0.013 0.082 ± 0.004
Kjeldahl method
Different Kjeldahl conditions were assayed in order to select the best, which
guarantee the total amine conversion (Table 2). The variables assayed were: HgO amount
(g) (0.0332 to 0.525 g), concentrated H2SO4 volume (3.39-12 mL), K2SO4 amount (2.22-
10.5g), digestion time (90-120 minutes), distillation reagent volume NaOH/Na2S2O3 (25-
50 ml). The OPA/NAC proposed method was used for testing conversion by use of the
bivariate calibration model. While the ammonium extraction from the sample was almost
independent of the experimental conditions (Figure 2), the amine transformation into
ammonium was dependent as can be seen in Figure 3. Condition 6 provided a total
transformation of MA into ammonium. The methylamine conversion into ammonium was
109 % . A similar value was obtained by the Nessler method applying condition 6.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
2 3 5 6
Condition
%Recovery
440 nm
485 nm
FIGURE 2. %Rec of NH4
+
calculated regarding to signal (or
slope) obtained without Kjeldahl
treatment, at different Kjeldahl
conditions (Table 2). Cond 2: n=7 : 5
st of 0.5 mg/L of NH4
+
and 2
calib.graphs (0, 0.5, 1.25, 2, 2.75
mg/L NH4
+
and 0, 0.2, 0.5, 0.9, 1.3
mg/L NH4
+
respectively). Cond. 3:
n=4: 2 st. of 0.5 mg/L of NH4
+
and 2
calib.graphs (0, 0.05, 0.25, 0.78
mg/L NH4
+
, and 0, 0.75, 0.75 mg/L
NH4
+
). Cond. 5: n=1: Calib.graph
(0, 0.28, 0.56 mg/L NH4
+
). Cond. 6:
n=3: St. of 0.375 and 0.75 (2
replicates) mg/L NH4
+
.

233
FIGURE 3. %Recovery of MA transformed into ammonium and %Recovery of MA not
transformed, calculated regarding to signal obtained without Kjeldahl treatment, at different
Kjeldahl conditions (Table 2). Condition 1: n=4 : 2 standards of MA of 0.5 mg/L and 2
standards of 0.125 mg/L. Condition 2: n=4: Standards of MA of 0.086, 0.3875, 0.5 and 0.56
mg/L. Condition 4: n=2: Standard of MA of 0.5 mg/L (2 replicates). Condition 5: n=5:
Standard of 0.775 mg/L of MA (5 replicates). Condition 6: n=2: Standard of 1.3 mg/L of MA
(2 replicates).
Other primary and secondary amines, such as ethylamine, n-propylamine,
isopropylamine, butylamine, pentylamine, hexylamine, dimetylamine, diethylamine and
β-phenylethylamine, were also assayed in order to study its conversion into ammonium.
In Figure 4 are shown the fluorescence spectrum at λexc 415 of the OPA-NAC-
ammonium and amine derivatives at different concentration levels before Kjeldahl and
ammonium concentration of 0.75 mg/L after Kjeldahl treatment and OPA-NAC
derivatization. As can be seen the analytical signal of the amine derivatives before
Kjeldahl digestion is similar to the blank (Figure 4A). However, after performing the
Kjeldahl digestion the amines are converted into ammonium (Figure 4B). The
ammonium measurement was performed by OPA-NAC procedure (λexc 415 - λem 485
nm) and contrasted by the Nessler method; the results are shown in Table 6. As can be
seen, comparable results were provided by both methods, and recoveries nearly 100%
were obtained in solutions with only one amine, as well as in amine mixture standard
solutions.
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 4 5 6
Condition
%Recovery
MA 440 nm
NH 485 nm

234
FIGURE 4. Fluorescence emission spectra corresponding to different OPA-NAC isoindol
derivates at 485 nm (λexc= 415 nm) for blank, standard of 0.75 mg/L NH4
+
, 1.3 mg/L MA, 1.875
mg/L EA and DMA, 2.465 mg/L N-PrA and IPA, 3.05 mg/L BA and DEA, 3.625 mg/L PeA, 4.215
mg/L HA, and 5.05 mg/L β-FEA. (4A)-measured before Kjeldahl digestion. (4B) measured after
Kjeldahl digestion.
450 500 550 600
0
200
400
600
800
1000
FluorescenceSignal
λem (nm)
Standard 0.75 mg/l NH4+
Blank, M A, EA, N PrA, IPA, BA,
PeA, HA, DMA, DEA, B-FEA
A)
450 500 550 600
0
200
400
600
800
1000
D MA
BA
H A, NPrA
St 0.75 m g/l N H4+, M A, EA,
IPA, PeA, DEA, B-FEA
B)
FluorescenceSignal
λem (nm)
Blank

235
TABLE 6. % Ammonium recovery (n=1) of different amine after Kjeldahl digestion, by
applying Nessler or OPA-NAC method at 485 nm. (EA-ethylamine, N-PrA–N-
propylamine, IPA-iso-propylamine, BA-butylamine, PeA-Pentylamine, HA-Hexylamine,
DMA-Dimethylamine, β-PEA-β-Phenylethylamine).
Amine
(Concentration before
Kjeldahl digestion)
OPA-NAC
Method
(%ammonium
recovery)
Nessler Method
(%ammonium
recovery)
EA (3.75 mg/L) 101 110
N-PrA (4.93 mg/L) 122.5 121.5
IPA (4.93 mg/L) 107.2 103.13
BA (6.10 mg/L) 88.2 81.8
PeA (7.25 mg/L) 99.8 96
HA (8.43 mg/L) 124.7 121
DMA(3.76mg/L) 71.5 68.6
DEA(6.10 mg/L) 112 101.2
β-FEA(10.10 mg/L) 104.4 100.7
EA (1.878 mg/L) + DEA
(3.047 mg/L)
84.4 79
DMA (1.253 mg/L) + N-
PrA (1.642 mg/L) + IPA
(1.642 mg/L)
82 81
BA (3.05 mg/L) + β−FEA
(5.05 mg/L)
99.9 85
PeA (3.622 mg/L) +
HA (4.21 mg/L)
85.3 92
Application to real samples
The procedure has been applied to the determination of ammonium and primary
amines (expressed as methylamine) in real water samples (see experimental section).
Three water samples of different nature were analysed: Ditch water, Industrial waste
water and Fountain water. Based on the results showed in Table 5, a t test of related
samples gave á > 0.05 for both ammonium and methylamine determination. Therefore,
similar results were obtained by using both calibration systems, bivariate and PCR
models.
Sample 3 was also analysed by Nessler method and comparable results for
ammonium were obtained: 0.32 ± 0.02 (n= 3).
The OPA-NAC procedure was applied to the water samples after Kjeldahl
digestion. In this case, the analytical measurement of ammonium corresponds to the
ammonium content plus the organic nitrogen. The results obtained have been compared
with those obtained by Nessler method. The results of ammonium found were (0.19 ±

236
0.07), (213 ± 3) and (2.103 ± 0.018) mg/L ammonium for ditch, industrial waste and
fountain waters, respectively, which were similar to those obtained by Nessler (t test for
paired samples á > 0.05): (0.223 ± 0.018), (232 ± 3), (2.14 ± 0.02) mg/l ammonium
respectively. These results are in agreement of the water nature, for natural water with
low pollution, the N-Kjeldahl will not exceed 5 mg/l. For industrial waste water, this
parameter can be higher than 200 mg/L of ammonium. Bearing in mind the results of
Table 5, other amino compounds besides ammonium and primary aliphatic amines, are
present in these waters.
Conclusions
In this article, the use of OPA/NAC reagent for the simultaneous determination of
ammonium and primary aliphatic amines has been proposed. Bivariate calibration or
multivariate Principal Component Regression can be used obtaining similar results.
Methylamine can be used as model compound, because the response of each amine was
the same when it was expressed in mg/L of Nitrogen, and there was additivity in their
signal when mixtures were processed.
Similar calibration curves were obtained for ammonium (0.25-1.75 mg/L) with a
fixed amine concentration ranged from 0.25 to 0.625 mg/l methylamine exciting at 415
nm. No response for amines was obtained working at this wavelength. Slopes of the
Methylamine calibration curves (0.25-0.625 mg/l) were also similar with a fixed
ammonium concentration ranged from 0.25 to 1.75 mg/l exiting at 333 nm. The signal of
the ammonium affecting ordinate values.
Kjeldahl treatment was applied obtaining similar slopes for ammonium
calibration graphs before and after the treatment. Amine conversion into ammonium was
near 100% for every amine studied alone or in mixtures. The application of Kjeldahl
treatment to real water samples gave results in agreement of the water nature, and Nessler
method was applied in order to validate accuracy of the proposed method, providing
similar results to those obtained by the OPA/NAC method.
Acknowledgements
financial support received for the realization of Project PPQ 2000-1641. S.M.Ll.
expresses her gratitude to Ministerio de Educación y Cultura (Spain) for the predoctoral
grant.
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residuales, 17th
Edn., Apha-Awwe-WPCF, Madrid (1992).
[16] J.Verdú, D.L.Massart. Applic. Spectrosc. 52 (1998) 1425-1434.
[17] V.Centner, D.L.Massart, O.E. de Noord, S.de Jong, B.M.Vandeginste and C.Stena.
Anal.Chem. 68 (1996) 3851.

239
Apéndice 11.
UNPUBLISHED PAPER
CHEMILUMINESCENCE AUTOMATIC METHOD FOR TOTAL ESTIMATION
OF ORGANIC NITROGEN (-CH2-NH-) AND AMMONIUM
S. Meseguer Lloret, C. Molins Legua, J. Verdú Andrés and P.Campíns Falcó*
Departament de Química Analítica, Facultad de Química, Universitat de Valencia
C/ Dr. Moliner 50, E46100- Burjassot, Valencia. SPAIN
Abstract
An automatic method has been developed for estimation of organic nitrogen (-
CH2-NH-) and ammonium in water samples. We proposed a continuous flow system in
which nitrogen compound reacts with hypochlorite reagent to form chloramines and,
subsequently, the mixture was merged with luminol, generating a chemiluminescence
signal. The signal emission at 425 nm, registered as a function of time, decreases as
nitrogen concentration increases, due to the decrease on hypochlorite concentration. A
large number of nitrogen compounds has been assayed and sensitivities compared, in
mg/L of Nitrogen. For all of them the same calibration graph was obtained. The linear
interval was 0.24- 4 mg/L of N, being the detection limit 0.07 mg/L of N. The
chemiluminescence method was applied to the analysis of several kind of real water
samples: natural water, lake water, irrigation ditch water, fountain water, residual water
and seawater. A comparative study of ammonium nitrogen contents before and after
Kjeldahl treatment has been carried out. Except for two samples, the N found for the
untreated samples provided a good estimation of the N Kjeldahl. 60 samples per hour can
be analysed and the procedure used also for in situ monitoring.
Keywords: ammonium, organic nitrogen (-CH2-NH-), water samples,
chemiluminescence, luminol, hypochlorite, Total Kjeldahl Nitrogen.
* Correspondence author. E-mail address: pilar.campins@uv.es (P.Campins).

240
INTRODUCTION
Nitrogen is a key nutrient in natural waters, but excess N inputs lead to
eutrophication. The dominant N species in waters are: dissolved inorganic N (ammonium,
nitrite and nitrate), dissolved organic N (the largest fraction is made up of amino acids
and peptides and it is often called amino N) and particulate organic (due to small
organisms: algae, bacteria) and inorganic N [1]. Inputs of dissolved organic nitrogen
(DON) to natural waters are largely a result of autochthonous biological processes.
Additionally, external sources of DON arise from sewage and industrial effluents,
terrestrial run-off and atmospheric deposition [2]. DON content in water has largely been
ignored, difficulties in measuring DON, its chemical character remains poorly described
and an underlying assumption that it is biologically inert can be the causes [2].
Some analytical procedures exist for quantifying dissolved inorganic N (DIN), total dissolved
nitrogen (TDN) but not for dissolved organic N as mentioned above. The most used is the Kjeldahl
wet chemical method [3-6] because it is the reference method established by European Directive
[7] relative to measurement methods in the analysis of superficial waters. Kjeldahl
method was developed specifically for proteinaceous nitrogen and some authors indicated
incomplete recovery of nitrogen for some compounds [8,9]. It provides DON and
ammonium contents.
In other protocols DON is calculated as the difference between independent
measurements of TDN and DIN, but they are even more time-consuming than Kjeldahl
method. The main methods for TDN determinations are: alkaline persulfate oxidation or
UV-photo-oxidation to nitrate and oxidative combustion methods to NO [2,8].
Some papers have been published comparing several of the used methods
[2,10,11]. More work is needed in order to improve accuracy of DON results and reduce
time and/or difficulty of the technique.
Based on previous studies for ammonium [12] and the known reaction between
amine groups and hypochlorite, we propose a continuous flow system for organic amino
N and ammonium nitrogen determination on untreated water samples, in which amino
group react with hypochlorite reagent to form a chloramine and, subsequently, the
mixture reacts with luminol, generating a chemiluminescence signal. The signal emission
at 425 nm, registered as a function of time, decreases as nitrogen concentration increases,
due to a decreasement on hypochlorite concentration that depends on the amino group
present in the sample. A large number of nitrogen compounds has been assayed and
sensitivities compared, in mg/L of Nitrogen. A unique calibration graph can be used for a
great number of compounds tested and then, the method can be employed for estimating
the main dissolved organic nitrogen and ammonium. Characteristics of the method, such
as selectivity and reproducibility, have been evaluated.
The chemiluminescence method was applied to the analysis of several kind of
real water samples (natural water, lake water, irrigation ditch water, fountain water,
residual water and seawater). A comparative study of ammonium nitrogen contents
before and after Kjeldahl treatment has been carried out. Standard additions method was

241
applied for all samples studied in order to test the presence or absence of proportional
systematic errors.
EXPERIMENTAL
Apparatus
All spectrofluorimetric measurements were made on a Hitachi F-4500, 700v
fluorescence spectrophotometer (Tokio, Japan). The light emission was monitored at 425
nm.
The pH was measured with a Crison micropH 2000 pH-meter. A Nanopure II
(Synbron Barnstead) water unit was used.
For FI assembly (see Figure 1), a Gilson Miliplus peristaltic pump was used to
drive the reactants through the flow cell; it always worked at a flow rate of 4.1 ml/min. A
400 µL reactor was employed to perform the reaction between Hypochlorite and Nitrogen
compounds. The sample loop employed had a 50 µL internal volume. Tygon tubing (i.d.
0.8 mm) was used with the peristaltic pump. The other tubing was made of PTFE (i.d. 0.5
mm). The flow cell was a laboratory-made bundle cell [13], consisting of knotted
transparent poly-tetrafluoroethylene tube, measuring 50 cm in length and 0.8 mm of
internal diameter. The bundle cell (1.5x1x1 cm) was placed in a plastic cell. A second
kind of flow cell studied was a laboratory-made spiral cell [13] consisting of coiled
transparent PTFE tube measuring 50 cm in length and 0.8 mm of internal diameter. Its
dimensions were 1 cm (internal diameter) and 3 cm (external diameter).
For sample Kjeldahl treatment, the Digestion Unit was a Tecator Digestion
system 6, 1007 Digestor (Höganäs, Sweden), and the Distillation Unit was a Büchi 323
Distillation Unit (Switzerland).
Reagents and solutions
All solutions were prepared in nanopure water, and all reagents were of analytical
grade.
Stock standard solutions of ammonium were prepared by dissolving ammonium
chloride (Probus, Barcelona, Spain) in nanopure water.
The following amines from Sigma (Steinheim, Germany) were employed:
methylamine (MA), ethylamine (EA), n-propylamine (nPA), isopropylamine (iPA),
butylamine (BA), pentylamine (PeA), hexylamine (HA), dimethylamine (DMA),
diethylamine (DEA), trimethylamine (TMA), triethylamine (TEA), β-phenylethylamine
(BPEA), 1,7-diaminoheptane (DAH), putrescine (Put), cadaverine (Cad), spermine (Spm)
and spermidine (Spd).
The following aminoacids from Aldrich (Steinheim, Germany) were employed:
aspartic acid, tryptophan, glutamic acid, glicocole, proline, serine, tyrosine, alanine,
phenylalanine, valine, leucine, isoleucine, treonine, lisine, metionine, histidine, cysteine,
histidine and arginine.
Other solutions (1000 mg/L) were prepared: Mercaptoethanol (Scharlau,
Barcelona, Spain); Urea and sodium sulphide from Prolabo, Fontenay, France; N-Acetyl-
L-Cysteine, s-Triazine and albumine from bovine serum were from Fluka (Switzerland);

242
Moreover, metal solutions (0.05 M) of chromium chloride, cobalt (II) chloride, copper
(II) chloride, iron (III) chloride, cadmium chloride and mercury (II) chloride from
Panreac (Barcelona, Spain) were prepared.
The following reagents were also used: sodium hypochlorite 15%, sodium
thiosulphite and potassium sulphate from Prolabo (Fontenay, France); sodium hydroxide,
sulphuric acid and sodium carbonate from Merck (Darmstadt, Germany), and red mercury
oxide from Panreac (Barcelona, Spain).
PROCEDURES
FI procedure
The flow injection assembly is shown on Figure 1. Initial concentrations and
flow injection system assembly were the ones described in [12], with some modifications.
Firstly, hypochlorite was not electrogenerated, in order to have a simpler system.
Secondly, the sample was previously mixed with hypochlorite in a reaction coil of 400
µL in order to form the chloramine compound and, then, sample loop was filled up. A
water carrier picked up the loop contents when injection valve was turned, and it was
mixed with luminol / buffer carrier. The distance between the last T-junction and the
detection cell was the minimum possible, 5 cm.
The working solutions were as follows: hypochlorite 0.9 mM (in
hydrogencarbonate / carbonate buffer 0.144 mM, pH 11.2), and luminol 1 mM (in
hydrogencarbonate / carbonate buffer 0.2 M, pH 11.2).
FIGURE 1. Flow injection assembly for chemiluminescence organic nitrogen determination.
The following standard solutions were prepared and measured according to the
methodology proposed:
Standard solutions of ammonium, amines, amino acids, N-acetyl-L-cysteine
(NAC), s-triazine and urea were measured in the range of 0-4 mg/L of nitrogen.
Albumine from bovine serum was measured in the range of 2.5-100 mg/L of albumine.
W
Detection
cell
Sample
loop: 50 µL
IV
Reactor,
400 µL
Standard/Sample
H2O
Luminol 1 mM,
0.2M CO3
2-
/HCO3
-
pH 11.2
Hypochloride 9 µM,
0.144mM CO3
2-
/HCO3
-
pH 11.2
v = 35 rpm
W

243
Standards of cysteine, metionine, NAC, mercaptoethanol and sodium sulphide
were prepared in the range of 0-5.4· 10-5
M of sulphide.
Metal solutions of: Copper (II) (2· 10-6
, 4· 10-5
and 5· 10-4
M), Fe(III) (9· 10-6
, 5· 10-4
and 5· 10-3
M), Cd(II) (4.5· 10-8
, 2.5· 10-4
and 2.5· 10-3
M), Hg(II) (5· 10-9
, 6.25· 10-3
and
0.05M), Cr(III) (1· 10-5
M) and Co(II) (8.5· 10-6
M) were also measured.
Kjeldahl treatment
For the application of Kjeldahl treatment [14], 6.7 g of potassium sulphate, 0.52 g
of red mercury oxide and 10 mL of concentrated sulphuric acid, were added to 100 mL of
nitrogen containing compound standard in a digestion tube. Then, the tubes were placed
on the Kjeldahl digestor, previously heated at 370ºC. Heating is kept until white fumes
appeared and, then, digestion continues for 30 minutes more. After that, digestion residue
must be cooled and diluted up to 100 mL with nanopure water. Distillation is performed
after the addition of 35 mL of distillation reagent (25 g of sodium thiosulphate and 500 g
of sodium hydroxide diluted up to 1L with nanopure water). Distilled ammonia must be
picked up on 25 mL of 0.04 N sulphuric acid until 80 mL. This solution was diluted up to
100 mL. Before experimental measures, collected solutions were adjusted to pH 6.0-7.0.
Solutions (100 mL) of TEA, urea, histidine and arginine, with final
concentrations of 1.5 mg/L of nitrogen, solution mixtures of MA / PeA / DMA or MA /
PeA / DMA / TEA, with final Nitrogen concentration of 1.5 mg/L or 1.8 mg/L
respectively, and a solution with 1 g/L of albumine, were submitted to Kjeldahl treatment.
Sample procedures
Eight different water samples were collected and pH adjusted to 2.0 with
concentrated nitric acid until they were used. At the moment of the analysis, the samples
pH value was adjusted near 7.0. All of them were analysed directly by the proposed FI
chemiluminescence method, before and after the Kjeldahl treatment. Samples were
named as follows: S1: mineral bottled water; S2: tap water; S3 and S7: irrigation ditch
water (from different sources); S4: lake water; S5: sea water; S6: industrial waste water
and S8: fountain water with clear aspect of eutrophication.
4.45 mL diluted up to 5 mL for S1, S2, S3, S4, S7 and S8, 1ml diluted up to 5 mL
for S5, or 0.035 mL diluted up to 5 mL for S6, were prepared and measured in triplicate.
These samples were also spiked with ammonium (0.75, 1.5 and 3 mg/L of nitrogen), in
order to apply the standard additions method.
Kjeldahl treatment
Kjeldahl treatment was applied, as described above for standards, to 100 mL of
S3, S4, S5 and S8 (all in triplicate), and to 7 mL of S6 diluted up to 100 mL (in
triplicate). After Kjeldahl treatment, 4.45 mL diluted up to 5 mL for S3, S4, S5 and S8, or
0.35 mL diluted up to 5 mL for S6, were measured in triplicate. They were also spiked
with ammonium (0.75, 1.5 and 3 mg/L of nitrogen), to apply the standard additions
method.

244
Analytical parameters
The parameters for the calibration curves chemiluminescence signal vs nitrogen
concentration (mg/L), and other figures of merit, for the ammonium determination at
different experimental conditions assayed can be seen in Table 1.
The different variables tested were: kind of measurement cell, buffer
concentration, hyplochlorite concentration, presence of buffer in standards and presence
of NaCl in standards.
TABLE 1. Ammonium calibration curves (chemiluminescence signal vs nitrogen
concentration, mg/L) and other figures of merit for the different experimental conditions
assayed. (a: ordinate, sa: estándar deviation of ordinate, b: slope, sb: estándar deviation of
slope, n: number of standards, r
2
: regression coefficient, sy/x: standard deviation of
calibration curve).
Conditions assayed
Detection
Cell
Hypochl.
Conc.
(mM)
Buffer in
Hypochl.
Buffer in
standard
solutions
NaCl in
standard
solutions
Calibration curve
Y = (a ±± sa) + (b ±± sb)· C
(n, r2
,sy/x)
DL
(mg/l)
Linear
Interval
(mg/l)
Spiral 0.9 0.144 mM No No Y = (9170 ± 30) + (-1844 ± 14)· C
(12, 0.9994, 70)
0.091 0.3-4
Bundle 0.9 0.144 mM No No Y = (9680 ±± 140) +(-2370 ±± 70)· C
(10, 0.9938, 300)
0.070 0.24-4
Bundle 0.5 0.144 mM No No Y = (4300 ± 50) + (-1960 ± 40)· C
(9, 0.9968, 100)
0.086 0.3-2
Bundle 0.9 0 mM No No Y = (9690 ± 100) +(-2290 ± 40)· C
(12, 0.9962, 200)
0.073 0.24-4
Bundle 0.9 10 mM No No Y = (9400 ± 90) + (-1730 ± 40)· C
(12, 0.9940, 200)
0.097 0.3-4
Bundle 0.9 0.144 mM Yes No Y = (7960 ± 160) + (-1570 ±70)· C
(12, 0.9806, 400)
0.107 0.4-4
Bundle 0.9 0.144 mM No Yes Y = (8290 ± 100) + (-2050 ±40)· C
(15, 0.9942, 200)
0.082 0.27-4
Because the presence of the analyte decresases the chemiluminescence signal, it
is interesting to reach almost 10000 arbitrary units for the blank (saturation signal), in
order to have the maximum working range for the analyte.
The optimum conditions have been marked in bold in Table 1: bundle cell and
hypochlorite 0.9 mM in carbonate buffer (0.144 mM, pH 11.2). Good linearity was
obtained, and the detection limit reached was 0.07 ppm (referred to nitrogen content in
the sample). Sensitivity decreased about 33% when standards were conditioned with
buffer, and about 13% when they were prepared in NaCl. FI registers obtained for
ammonium calibration standards are shown in Figure 2.

245
FIGURE 2. FI registers obtained under optimum experimental conditions at different
Nitrogen concentration levels. Conditions: Hypchlorite 0.9 mM in carbonate buffer 0.144 mM
pH 11.2 with bundle cell.
The reproducibility of the method was measured in two ways. Figure 3 shows
how ammonium calibration curves obtained for five different days overlap at every
concentration level. The percentage of residual standard deviation (%RSD) for calibration
slope was 1.86%.
FIGURE 3. Nitrogen calibration curves (Chemiluminescence versus Nitrogen concentration
(mg/L)) obtained in five different days. Conditions: Hypchlorite 0.9 mM in carbonate buffer
0.144 mM pH 11.2 with bundle cell.
y = -2293.3x + 9365.4
y = -2255.9x + 9570.4
y = -2332.4x + 9456
y = -2339.4x + 9677.6
y = -2366.3x + 9676
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4 5
Nitrogen Concentration (mg/L)
Chemiluminescence
26/06/03
30/06/03
01/07/03
02/07/03
25/06/03
Nitrogen calibration curves
0 100 200 300 400
0
2000
4000
6000
8000
10000
Time (s)
0.75 mg/l N
BlanK
2 mg/l N
3 mg/l N
4 mg/l N

246
On the other hand, repeatibility studies gave a RSD (n=3) of 0.81%, 0.31% and
3.7% for nitrogen concentrations of 0.75, 2 and 4 mg/L respectively.
Both values indicate that the precision of the method can be considered rather
satisfactory.
60 samples per hour could be analysed without previous treatment and the
procedure can be adapted as an in situ monitoring analyser.
Response to other nitrogen-containing compounds
In order to check the behaviour of the proposed methodology for the amino N
determination (organic nitrogen plus ammonium nitrogen), the results for other families
of nitrogen-containing compounds were obtained, and compared with those obtained for
ammonium (all referred to nitrogen content).
The first family of compounds studied were the aliphatic amines: primary,
secondary and tertiary.
Seven aliphatic primary amines (methylamine, ethylamine, n-propylamine,
isopropylamine, butylamine, pentylamine and hexylamine) were processed, and the
corresponding recovery results (calculated as slope of amine calibration * 100 / slope of
ammonium calibration) are shown in Table 2. The mean recovery obtained, (91 ± 11) %,
showed how the primary amine responses were similar to the ammonium response and,
for this reason, their nitrogen content could be also measured with this methodology.
TABLE 2. Percentage of recovery (slopeamine*100/slopeNH4+) found for primary and
secondary aliphatic amines individually and mean %recovery.
AMINE
% Recovery =
bamine*100/bNH4+
Mean Recovery
(% REC ± s)
methylamine 104
ethylamine 83
n-propylamine 79
isopropylamine 82
butylamine 82
pentylamine 102
hexylamine 103
(91 ± 11)%
dimethylamine 78
diethylamine 84
(81 ± 4)%
Two aliphatic secondary amines (dimethylamine and diethylmine) were also
processed, and the results are also shown in Table 2. Although the mean recovery was
slightly lower than for primary amines, (81 ± 4)%, their nitrogen content can be also
measured with this methodology.
The results for two aliphatic tertiary amines (trimethylamine and triethylamine)
showed that this kind of compounds can not be detected with this methodology. This can

247
be explained because in these experimental conditions the corresponding chloramine is
not formed. Thus, the hypochlorite reagent is not consumed, and the chemiluminiscence
signal remains constant.
A second family of compounds studied were the polyamines. These molecules
contain several amino groups, and thus, the response for each analyte should decrease as
many times as amino groups are present. When the calibration is performed against the
nitrogen content for five of these compounds (putrescine, cadaverine, spermine,
spermidine and 1,7-diaminoheptane), excellent percentage recoveries were found (Table
3). The mean recovery, (96.6 ± 1.8) %, allows the nitrogen content for these kind of
compounds to be obtained by applying this methodology.
TABLE 3. Percentage of recovery (slopepolyamine*100/slopeNH4+) found for polyamines
individually and mean %recovery.
POLYAMINE
% Recovery
bamine*100/bNH4+
Mean Recovery
(% REC ± s)
putrescine 98
cadaverine 95
spermine 98
spermidine 94
1,7-diaminoheptane 97
(96.6 ± 1.8)%
The third family of nitrogen containing compounds studied were arylalkyl
amines. â-phenylethylamine was selected as a model of compound. The obtained
recovery was 100.1 %, indicating that also the nitrogen content for this kind of amines
can be measured with the proposed methodology.
Another two types of nitrogen compounds were studied: those containing an
aromatic N atom (for example, triazine), and those containing resonant nitrogen (for
example, urea). In both cases the chemiluminiscence signal remains constant for all
concentrations tested. These results show that aromatic and resonant nitrogen will not be
detected by this methodology, however the aromatic nitrogen exalted the blank
chemiluminescence signal.
In addition, 14 amino acids (with only one amino group) were also studied. The
recoveries obtained (Table 4), were near 100% in all cases. The mean recovery was (96 ±
4) % for their nitrogen content, and it was in excellent agreement with the real one.
Histidine presents a structure with two aromatic nitrogens besides the amino group and
accordly with results for triazine, the chemiluminescence of the blank was increased and
no decrease of the signal was observed in the N working range. Arginine presents
resonant nitrogens besides the amino group, the obtained results considering only the
aliphatic nitrogen (baminoacid* 100/ bammonium= 96.8) confirm that only the –CH2-NH2 group
for arginine lowers the chemiluminiscence signal. Cisteine and metionine gave (baminoacid*
100/ bammonium) values of 287 and 147 %. Those recoveries indicate that other atom of

248
their structure were contributing to the decrease in chemiluminescence. As can be
demonstrated below this atom was S.
TABLE 4. Percentage of recovery (slopeaminoacid*100/slopeNH4+) found for aminoacids
individually and mean %recovery.
AMINOACID
% Recovery
bamine*100/bNH4+
Mean Recovery
(% REC ± s)
aspartic acid 93.5
tryptophan 87.1
glutamic acid 101.9
glicocole 97.6
proline 96.6
serine 99.9
tyrosine 95.4
almandine 98.1
phenylalanine 97.1
valine 100.6
leucine 94.3
isoleucine 96.0
treonine 97.1
lysine 93.8
(96 ± 4)%
Selectivity of the method: Interference study
The first type of interfering compounds studied were those containing sulphur
atoms, because they can produce interferences in the nitrogen determination as can be
seen in the previous section for amino acids containing S. Two compounds, sodium
sulphide (S2-
) and mercaptoethanol (R-SH), without nitrogen content, were studied. As it
was expected, both compounds lowered the chemiluminiscence signal. Sulphur
interference was twice the mercaptoacetic interference, the slopes of the calibration
graphs obtained were 3058 and 1850 L/mg S.
The response for cysteine, amino acid with sulphur content, and its derivative N-
acetyl-cysteine were due to the contribution of the both atoms, N and S. The experimental
signals were around 100 % of the theoretical signals obtained bearing in mind the slopes
of the calibration graphs of ammonium and mercaptoethanol. The interference caused by
the R-S-R group is small as can be derived from the recovery given in the previous
section for metionine. The concentration of biogenic thiols in natural waters have been
found to be about 0.25 ppb [15], and the higher limit admitted for drinking water for H2S
is 50 ppb [7], at these levels the sulphur containing compounds did not interfere in the
reaction, giving the same signal that the corresponding to the blank solution.

249
The second type of possible interfering compounds assayed was some metallic
ions. Cr(III) and Co(II), at concentration levels of 0.5 ppm, do not interfere. Cu(II), at
concentration level of 50 ppb (maximum allowed limit for natural waters), decreased 10%
the chemiluminiscence signal. Other cations, at the maximum allowed concentration
(Fe(III), at concentration level of 0.5 ppm, Cd(II), at concentration level of 5 ppb, and
Hg(II), at concentration level of 1 ppb) do not either interfere.
Kjeldahl treatment
Kjeldahl treatment was applied to nitrogen-containing compounds that did not
give reaction with hypochlorite, in order to study its reactivity after sample digestion.
Triethylamine, urea, histidine and arginine were measured at a final nitrogen
concentration of 1.5 mg/L after Kjeldahl treatment. Recoveries obtained can be seen in
Table 5. They are all near 100%, so applying Kjeldahl digestion, these nitrogen
compounds will also be measured.
TABLE 5. Individual Percentage of recovery and Mean percentage of recovery found for
standards of Triethylamine, urea, histidine, arginine of final Nitrogen concentration of 1.5
mg/L, and for mixtures of Methylamine, Pentylamine and Dimethylamine (final Nitrogen
concentration of 1.5 mg/L) and of Methylamine, Pentylamine, Dimethylamine and
Trimethylamine (final Nitrogen concentration of 1.8 mg/L), after Kjeldahl treatment.
ANALYTE % Recovery
Mean Recovery
(% REC ± s)
TEA 94.1
urea 103.5
histidine 114.9
arginine 109.6
MA + PeA + DMA 96.3
MA + PeA + DMA + TMA 99.7
(103 ± 8)%
Moreover, aliphatic amine mixtures containing or not trimethylamine have been
digested and distilled by Kjeldahl method. The recovery percentages for two mixtures
containing a total nitrogen content of 1.5 mg/L or 1.8 mg/L of Nitrogen is shown in
Table 5, with both values close to 100%.
In addition, a protein, as it is albumine, was also analyzed. The results, before and
after the Kjeldahl digestion were different. In this case, almost half of the nitrogen is not
detected without acidic digestion.
Several real water samples were analysed. To validate the accuracy of the
method, all samples were fortified to apply the standard additions method, and the
percentages of recovery of nitrogen added were near 100% (Table 6). This table show

250
that there were not matrix effect in these samples, and that sample Nitrogen content can
be deduced directly from standards calibration curve.
TABLE 6. Concentration of Nitrogen found in spiked real water samples (mg/L)(S1-
Mineral water, S2-Tap water, S3-Irrigation ditch water 2, S4-lake water, S5-sea water,
S6-Waste (residual) water, S7-Irrigation ditch water 1 and S8-Fountain water), and
percentage of recovery of the fortified concentration at different concentration levels.
Sample
Added Concentration
(mg/L N)
Found concentration
(mg/L N)
% Recovery
(Rec ± s) %
0.75 0.69 ± 0.04 92 ± 6
1.5 1.52 ± 0.05 101 ± 4S1
3 2.91 ± 0.08 97 ± 3
0.75 0.64 ± 0.07 86 ± 10
1.5 1.46 ± 0.02 97.4 ± 1.3S2
3 2.75 ± 0.08 92 ± 3
0.75 0.71 ± 0.03 95 ± 4
1.5 1.58 ± 0.03 105.2 ± 1.7S3
3 3.004 ± 0.018 100.1 ± 0.6
0.75 0.724 ± 0.018 97 ± 2
1.5 1.69 ± 0.04 112 ± 3S4
3 2.62 ± 0.04 87.4 ± 1.3
0.75 0.76 ± 0.04 101 ± 6
1.5 1.58 ± 0.05 105 ± 3S5
3 2.85 ± 0.03 95.0 ± 1.1
0.75 0.692 ± 0.017 92 ± 2
1.5 1.43 ± 0.08 96 ± 6S6
3 2.696 ± 0.004 89.86 ± 0.12
0.75 0.79 ± 0.03 105 ± 4
1.5 1.581 ± 0.013 105.4 ± 0.9S7
3 3.034 ± 0.007 101.1 ± 0.2
1.5 1.49 ± 0.10 99 ± 7
S8
3 2.91 ± 0.10 97 ± 3
In three of the samples assayed, mineral water (S1), tap water (S2) and irrigation
ditch water 2 (S3), the nitrogen contents were under detection limit of the method. Sea
water (S5), presented increase of the blank signal and then, can not be analysed by the FI
method directly. In other four samples, lake water (S4), waste water (S6), irrigation ditch
water (S7) and fountain water (S8), detectable nitrogen was found when direct
measurement was made. Table 7 shows the nitrogen contents found by the direct
measurement of these water samples, calculated from standards calibration curve.
Nitrogen content on real water samples was also deduced by this methodology
after Kjeldahl treatment. As can be deduced from results (Table 7), two groups of
samples have appeared: the first one showed similar nitrogen concentrations before and

251
after the Kjeldahl digestion (this is the case of S6 and S7). S6 was also analysed by the
Nessler and o-phthaldialdehyde/N-Acetyl-L-Cysteine (OPA/NAC) methods for
ammonium [16], and after Kjeldahl treatment, the found concentrations were (180 ± 3,
n=3) and (166 ± 3, n=3) mg/L N for Nessler and OPA/NAC procedures respectively. For
this type of samples, we could replace the tedious Kjeldahl treatment by the application of
the direct simple FI system presented in this work. The second group of samples, showed
different nitrogen concentrations before and after the Kjeldahl digestion (this is the case
of S4, S5 and S8). The proposed method for S4 provided 60 % of the N-Kjeldahl, S5
presented increase of the blank signal and then can not be analysed by the FI method
directly as mentioned previously. The results for S8 can be explained by the presence of
nitrogen containing compounds that does not react completely with the hypochlorite, but
are transformed into ammonium after Kjeldahl treatment or, more probably, by the
presence of complex organic matrix, decomposed by the acidic digestion (in a similar
way that albumine results predict). S8 was also analysed by the Nessler and OPA-NAC
method for ammonium [16], the results were (0.25±0.02, n=3) and (0.29±0.02, n=3)
mg/L N, respectively before Kjeldahl treatment, and (1.66 ± 0.02, n=3) and (1.635 ± 0.18,
n=3) mg/L N, respectively after Kjeldahl treatment. These results are near those obtained
with the proposed chemiluminescence FI detection procedure.
TABLE 7. Total Nitrogen content (Organic and ammonium)(mg/L N) found in different water
samples studied, before and after Kjeldahl treatment. Samples analysed in triplicate.
Nitrogen Content (mg/L N)
Sample
Before Kjeldahl Treatment After Kjeldahl Treatment
S4 (0.92 ± 0.15) (1.59 ± 0.06)
S5 N.D. (1.66 ± 0.10)
S6 (140 ± 8) (149 ± 11)
S7 (0.52 ± 0.04) (0.57 ± 0.03)
S8 (0.35 ± 0.05) (1.99 ± 0.07)
CONCLUSIONS
The response of amino compounds (-CH2-NH-) including ammonium by
applying the proposed methodology gave recoveries near 100% for primary and
secondary aliphatic amines, polyamines, arylalkylamines and fourteen of the aminoacids
assayed. Tertiary amines and aromatic or resonant nitrogens did not give the reaction, N-
proteins is incompletely recovered. The reaction was interfered by sulphide groups, but
not at concentrations below their legislation level. Metal ions studied have not resulted
interferences below their legislation levels. The method is capable of estimating total
dissolved N-amino in a sample very quickly.
Matrix effects have not been observed in fortified samples, and accurate results
have been obtained with recoveries near 100%. Results shown in this paper permit to
establish that for some kind of samples, Kjeldahl treatment can be omitted and the
simpler FI system presented in this work used. This option is very advantageous because

252
the method does not require sample treatment, three replicates of the sample can be made
in 1 min, toxicity of the reagents is low and the method can be used in in situ monitoring .
The proposed methodology can be also used as an alternative for final ammonium
detection after Kjeldahl digestion of the samples. The precision of the method for
ammonium determination was very good, with RSD of 0.3-3.7 % for intraday
repeatibility values, and 1.9% for interday reproducibility of the slope calibration line
values. These values were similar to Nessler method precision (%RSD=0.4%), and better
than OPA-NAC method precision (%RSD below 12.5%). Dynamic range was 0.24-4
mg/L N. For Nessler method, it was 0.66-3.88 mg/L N and for OPA-NAC method it was
0.155-1.088 mg/L N. Detection limit reached with the proposed method (0.07 mg/L N)
was similar to that obtained with OPA-NAC method (0.054 mg/L N), and better than that
reached with Nessler reference method (0.46 mg/L N). The rapidity of the proposed
method resulted excellent (60 samples/hour) compared with Nessler (6 samples/hour) or
OPA/NAC (10 samples/hour) methods.
ACKNOWLEDGEMENTS
financial support received for the realization of Project BQU2003-06138 . Susana
Meseguer Lloret expresses her gratitude to Ministerio de Educación y Cultura (Spain) for
the predoctoral grant.
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