J.C Vidal - Uso de aptámeros en biosensors
- 1. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Uso de aptámeros en biosensores Juan C. Vidal Aptámeros 8 -Marzo- 2.011
- 2. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Uso de aptámeros en biosensores ÍNDICE SELEX, Transd.+Rec., vs Ab, I. Aptámeros y Biosensores : Spielgelmers, Plegamientos II. Transducción de masa : ● QCM ● AFM ● SPR ● Fluorescencia III. Aptasensores ópticos : ● Aptabeacons ● Microarrays IV. Aptasensores electroquímicos : ● Voltametría ● EIS Índice
- 3. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES BIOSENSOR I. Aptámeros y Biosensores
- 4. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Características ideales de un biosensor • Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad • Alta fiabilidad • Tiempo vida largo • Bajo coste • Tiempo corto análisis • Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo • Tiempo real • Portátil • Automatizable • Miniaturizable • Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis I. Aptámeros y Biosensores
- 5. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Biosensores analíticos • Ópticos BIOSENSORES • Electroquímicos • Catalíticos (enzimas) • T. Masa (QCM) • De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA, Receptores, tejidos, MIPs…) Transductor Bioreactivo inmovilizado Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo I. Aptámeros y Biosensores
- 6. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Selección de aptámeros: SELEX Aptámeros (DNA o RNA) o SELEX convencional (1990) o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX) o SELEX automatizado (1998) (Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN; In-vitro transcription; modific. quím.; Selecc. negativa;Post-SELEX) Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment I. Aptámeros y Biosensores
- 7. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptámeros vs. Anticuerpos Aptámeros Anticuerpos Afinidad μM - pM μM - pM Especificidad Alta Alta Síntesis In-vitro In-vivo (inmunización) Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuesta Réplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb) Modif. química Sencilla / Afinidad Limitada Desnaturalización Reversible Irreversible Tiempo de vida Largo Limitado 5-25 kDa Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad vs 150 kDa Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad, cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados, FP / EIS / SPR, Arrays I. Aptámeros y Biosensores
- 8. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Spiegelmers / Aptámeros modificados Nucleósidos modificados (1994<) (no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX. • “Mirror-image aptamers” (1996<) • Síntesis de L-nucleósidos (en lugar de D-enantiómeros) • Mínima toxicidad e inmunogenicidad Noxxon Pharma AG I. Aptámeros y Biosensores
- 9. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Plegamiento de los Aptámeros (Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC) • Especificidad • Espaciadores • Disoluc. reguladoras • Iones • Regeneración Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas, interacciones dipolares (Van der Waals)
- 10. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción II. III y IV. Transducción
- 11. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción de masa (I) • Efecto piezoeléctrico QCM • NO ETIQUETADO (t. real) • f0 ~ 5 MHz, 10 MHz S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2), IgG, Regenerac. (2002) II. Transducción de masa
- 12. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción de masa (II) Flexible micro-cantilevers (2004) Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs) 3-32 nm differential bending (Gold) 2x (referencia – ads. inespecífica) Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1) 50 x 150 μm AFM S ~ 1-100 nM Thbr II. Transducción de masa
- 13. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) Sistemas de flujo (Biacore) SPR ~ 10 pg/mm2 QCM ~ 1 ng/mm2 Kd (afinidad) Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real, sin etiquetado (2001) III. Aptasensores ópticos
- 14. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores de fluorescencia (FP) Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt, L-adenosina (μM) (1998) • Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada • Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente • Etiquetado fluorescente del aptámero • Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.) • También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados) III. Aptasensores ópticos
- 15. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptamer microarrays Lisozima + HIV + Ricina (glass-slides) (LODs 320 ng mL-1) (Ellington, 2004) • Spotting” • Multianalito (1998, FP) • Somalogic (LOD 10 fM) • FP (fibras ópticas) • Bi-Apt + av-agarosa III. Aptasensores ópticos
- 16. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptamer molecular beacons - FP F*-Q* Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996) • Versatilidad frente Ab’s • Composición disoluciones • En disolución (no inmovilizac. Apt) F*-F* • No regeneración FRET Mayor sensibilidad (ej. thrombin pM) (TBA, 2002) Cocaine (dye displac.) III. Aptasensores ópticos
- 17. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores electroquímicos Desplazamiento ELAA (<1 nM) (2005) TBA (CNTs) (*): enz., MB, NPs •S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM) •DPV, CRA, SWV, LSV, … •EIS IV. Aptasensores electroquímicos
- 18. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores: sandwich / competitividad Sandwich: Competitividad o desplazamiento: => necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo => Necesidad de Ag* • Conjugaciones previas ELONAs (~ ELISAs) • No influye el cambio conformacional (3D) • Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs) LODs ~ 0,5 pM IV. Aptasensores electroquímicos
- 19. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Espectroscopía de Impedancia e- • No etiquetado (difus. externa) • Sensibilidad (Ab’s) • Modulac. carga Apt.(-) • IgG (Ferric.), hairpin, (2-100 nM, LOD 0,1 nM) EIS (2005) • Medida rápida (10-90 min.) IV. Aptasensores electroquímicos
- 20. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Electrochemical aptabeacons •Etiqueta electroquímica (mediador) •Regeneración (immovilizac.) •“Reagentless” (as SPR, QCM) •No “contaminación óptica” •Cuádruple / helix-junction •Grandes cambios conformac. (Prot.) Ejemplos: TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002) Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006) Señal ON / Señal OFF IV. Aptasensores electroquímicos
- 21. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensor electroquímico de OTA (ejemplo) Determination of OTA in wheat flour DPV LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s IV. Aptasensores electroquímicos
- 22. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores: ejemplos • Factor Xa (p-Thbr=>Thbr) Cocaína (500 μM) • 2 Apt* (FM - híbrido) Platelet PDGF • LOD 50 pM (3-way-juntion) Aplicaciones Aptasensores: Drogas, proteínas, peq. molec., Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds., Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av, Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas) NPs (CNTs, QDs) IV. Aptasensores electroquímicos
- 23. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores (inmunosensores) electroquímicos: Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman) Prof. Juan C. Vidal (GEAS) Lcda. Alba Ezquerra (GEAS) Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL) Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL) Gracias por su atención !!