![¿Por que da tolerancia un gen que no está
conservado?
Homoserine Serine
Serine
Homoserine
Acetil-CoA
Acetil-CoA
[MET2] XERO1
CoA
CoA
O-acetylserine
O-acetylserine
O-acetylhomoserine
O-acetylhomoserine
S2- [MET15] S2-
Homocysteine Cysteine
Cysteine
Homocysteine
[STR4] Serine
Recientemente se ha demostrado que este gen
puede ser clave para el desarrollo de estrategias de
cystathionine
cystathionine fitorremediación
(Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007)
[STR1/CYS3]
Cysteine
Cysteine](https://image.slidesharecdn.com/pptjmmulet-120221090123-phpapp02/85/Jose-Miguel-Mulet-Biotecnologia-para-hacer-frente-al-cambio-climatico-la-busqueda-de-variedades-tolerantes-a-sequia-frio-y-salinidad-29-320.jpg)
José Miguel Mulet - Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad
- 1. Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad, Barcelona 16-11-2011 José Miguel Mulet
- 2. ¿Que es el estrés para una planta? • Es difícil de definir a nivel general, puesto que lo que puede resultar estrés para una planta para otra puede que no lo sea. • Una definición para salir del paso de estrés biológico sería: “factor o condición adversa que inhibe el funcionamiento normal de un sistema biológico (planta)”
- 3. ¿Por que nos estresa que las ¿Por qué nos estresa que las plantas se estresen? plantas se estresen? • La población mundial es de 7.000 millones y creciendo. • El estrés abiótico es el mayor factor limitante para la productividad agrícola. • El estrés abiótico produce pérdidas de cientos de millones de euros cada año debido a bajadas de producción o pérdida de cosechas. • El crecimiento de la población ha acentuado los factores de estrés existentes (básicamente metales pesados y salinidad… quizás cambio climático).
- 4. Históricamente la sequía ha sido más definitivo para el fin de una civilización que las guerras o las epidemias Existen más casos documentados como la civilización Maya, los indios pueblo,la mesopotamia primitiva o la antigua camboya.
- 5. La sequía y la salinidad son problemas actuales tanto en países desarrollados como en países en desarrollo Imágenes tomadas en Tempe (Arizona, USA), que muestran el efecto de vaias décadas de irrigación (Gentileza del Dr. Roberto Gaxiola)
- 6. La Mejora Clásica se ha demostrado muy buena para el aumento de la productividad, pero limitada en tolerancia a condiciones ambientales adversas Trigo tradicional: Bajo radio grano/paja Trigo de la revolución verde: Alto radio grano/paja Norman Borlaug (2009) Premio Nobel de la Paz
- 7. La cuestión es: ¿Qué gen elegir para hacer plantas tolerantes? O dicho de otra manera: ¿Por qué no hay todavía plantas tolerantes a estrés abiótico en el mercado?
- 8. Para aplicar ingeniería genética es preciso conocer el efecto a nivel celular… y elegir un gen
- 9. Estrategias basadas en conocimiento previo • Genetica reversa: – Partiendo de datos obtenidos del genoma clonar genes con una función determinada y/o construir lineas modificando la expresión del gen que nos interesa. • Genómica funcional: – Estudiar que genes se expresan o se reprimen en determinadas condiciones de estrés y a partir de estos datos modificar la expresión de genes de relevancia. • Ingeniería Genética: – Transformar una planta con un gen de otro organismo de probada funcionalidad en determinado estrés.
- 10. Así es como representamos una ruta de respuesta
- 11. Pero realmente se parece a esto Pérdida de Función Factores negativos Tolerancia a estrés Cuello de botella Factores positivos redundancia Unico gen que dará tolerancia por sobrexpresión
- 12. Un ejemplo: Optimizar la síntesis de osmolitos para tolerancia a sequía • La síntesis de osmolitos es una estrategia generalizada para retener el potencial osmótico dentro de la célula. • El problema es que no es una respuesta conservada, y cada organismo parece que ha encontrado su solución particular… lo que dificulta el diseño de estrategias… • Las diferentes estrategias han fracasado (incluso después de haber funcionado bien en el laboratorio).
- 13. El Yield Penalty, un indeseado efecto secundario Theor Appl Genet. 2007 Jun;115(1):35-46. Epub 2007 Apr 11. Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L.
- 14. Un gen puede dar tolerancia por sobreexpresión por: • Mejorar la respuesta a estrés (señalización). • Mejorar la respuesta a estrés (defensa). • Ser una diana molecular del estrés. • Regular negativamente un factor negativo. • Ser un factor negativo (la mutación daría tolerancia).
- 15. ¿Por qué no cambiamos la estrategia? • El truco es cambiar la afirmación: “este gen que conozco funcionará” por : ”voy a buscar genes que funcionen, aunque no los conozca”, ergo: hacer un screening. • El problema es: ¿Cómo?
- 16. La levadura como instrumento para buscar genes Yeast genomic fragments + Yeast multicopy plasmid Overexpression libraries Saccharomyces cerevisiae NaCl or LiCl Selection for salt tolerance medium
- 17. Este sistema nos permitió descifrar la homeostasis de iones en levadura setting energization +++ Li+, Na+ H+ Polyaminesn+ --- Aminoglycosidesn+ ADP K+ ? ATP + Pi Trk1 ? Acid stress Pma1 ? Plasma membrane Hal4,5 Hal1 CN YCK1,2 Ptk2 Osmotic stress Ppz1.Hal3 Glucose K+ starvation Na+ stress metabolism Alkaline stress
- 18. Y también alguna aplicación en plantas THE YEAST HAL1 35S::HAL1 control GENE IMPROVES SALT TOLERANCE IN TOMATO (cultivar P73; Gisbert et al., Plant Physiol. 123 (2000) 393- 402; collaboration with the group of Vicente Moreno) … and in water melon (Ellul et al., 2003, 10 days with Theor. Appl. Genet. 150 mM NaCl 107: 462-469) 20 days with 150 mM NaCl
- 19. Ya que la levadura funciona muy bien para encontrar genes de levadura… • …Por que no buscar genes de plantas? • Ventajas: • Es un proceso rápido y barato. • En poco tiempo se puede hacer un escrutinio exhaustivo. • Inconvenientes: • No todos los cDNA se expresan bien en los sistemas heterólogos (problemas con el codon usage). • Muchas rutas no están conservadas. • Suele salir un sesgo hacia moleculas efectoras, pocas señalizadoras, y poquísimas proteínas de membrana.
- 20. La levadura como instrumento para buscar genes Plant cDNAs + Yeast multicopy plasmid with strong promoter Overexpression libraries Saccharomyces cerevisiae NaCl or LiCl Selection for salt tolerance medium
- 21. Genes de halotolerancia de la planta modelo Arabidopsis thaliana encontrados por sobreexpresión en levadura (Forment et al., 2002, Plant J. 30:511-519; collaboration with the group of Oscar Vicente ) TECHNICAL DATA Yeast strain G19 (ena1-4::HIS3) Library of F. Lacroute (Plant J. 1992, 2: 417-422): Arabidopsis seedlings grown in vitro Minimal medium with 25 mM LiCl and 0.4 mM methionine 750.000 transformants tested Name Times isolated Mechanism of action RCY1 3 K/T-type cyclin fused to an RS-domain typical of splicing proteins SRL1 3 RS-domain typical of splicing proteins AtU1A 1 U1A protein of the spliceosomal U1-snRNP
- 22. OVEREXPRESSION OF SRL1 CONFERS SALT TOLERANCE TO TRANSGENIC ARABIDOPSIS PLANTS In vitro germination 3-weeks old plants treated for 20 d with 200 mM NaCl aborted siliques normal siliques
- 23. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a salinidad. (Col. Con Roc Ros, U. de Valencia) mRNA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA cDNA Beta vulgaris cv. DITA Eco RI Xho I Eco RI Xho I Eco RI Xho I cDNA Yeast/E. coli plasmid pYPGE15 S. cerevisiae (ena1-4 nha1)
- 24. Genes de remolacha obtenidos en el escrutinio de tolerancia a salinidad Clone Number of Predicted function Motifs times isolated BvSATO1 6 RNA binding protein RGG and RE/D BvSATO2 1 Homologous to BvSATO1 BvSATO3 1 RNA binding protein P-rich and Zn-finger BvSATO4 1 RNA binding protein RBD BvSATO5 1 RNA binding protein BvSATO6 1 RNA binding protein RBD BvU2AFsnRNP 3 RNA binding protein RBD and Zn-finger BvSATO7 1 No homologies BvCK2a 1 Protein kinase CK2 BvURA4 2 Dihydroorotase (uracil biosynthesis) BveIF-1A 3 Translation initiation factor
- 25. 35S::BvSATO1 control 35 days growth with without stress 35 days growth with 50 mM NaCl
- 26. PATENT TITLE: Protection against environmental toxicity through manipulation of the processing of messenger RNA precursors Inventors : O. Vicente-Meana, M. Roldan-Medina, R. Serrano-Salom, J. J. Forment, M. A. Naranjo-Olivero, R. Ros Palau, R. Khanonou Priority date: 19 April 2000 Filing date : 19 April 2001 PCT publication date: 01 November 2001 (transferred to Crop Design, now part of BASF) AN EXAMPLE OF A PATENT TOO SPECIFIC Because 8 years later an RNA binding protein provided drought tolerance in corn: News release, Monsanto (St. Louis, USA) and BASF (Ludwigshafen, Germany), June 9, 2009 Monsanto, BASF scientists disclose discovery of gene conferring drought tolerance in corn plants: bacterial cspB gene encoding an RNA binding protein Gene provides yield stabilty Control plants during periods of inadequate water supply
- 27. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a sequía. mRNA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA cDNA Beta vulgaris cv. DITA Eco RI Xho I Eco RI Xho I Eco RI Xho I cDNA Yeast/E. coli plasmid pYPGE15 S. cerevisiae (gpd1)
- 28. Resultados del escrutinio en sequía cDNAs identificados en 1.7 M de Sorbitol YPD XERO1 Serine O-Acetyltransferase XERO2 Type II Plant Haemoglobin SD XERO3 Ascorbate Peroxidase 3 No incluidos en la patente Incluidos en la patente
- 29. ¿Por que da tolerancia un gen que no está conservado? Homoserine Serine Serine Homoserine Acetil-CoA Acetil-CoA [MET2] XERO1 CoA CoA O-acetylserine O-acetylserine O-acetylhomoserine O-acetylhomoserine S2- [MET15] S2- Homocysteine Cysteine Cysteine Homocysteine [STR4] Serine Recientemente se ha demostrado que este gen puede ser clave para el desarrollo de estrategias de cystathionine cystathionine fitorremediación (Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007) [STR1/CYS3] Cysteine Cysteine
- 30. Actualmente tenemos arroz que sobreexpresa este gen Y hemos empezado una colaboración con Carmina Gisbert (COMAV, Valencia) para sobreexpresar XERO1-3 en tomate y berengena
- 31. Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a frío. mRNA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA cDNA Beta vulgaris cv. DITA Eco RI Xho I Eco RI Xho I Eco RI Xho I cDNA Yeast/E. coli plasmid pYPGE15 S. cerevisiae (wt)
- 32. Resultados del escrutinio en frío cDNAs identificados a 10 ºC YPD CRIO1 (8) ScDID1 / AtSNF7 / CHMP4 / VPS32 CRIO2 (2) Homólogo de CRIO1 CRIO3 (4) ScDID2 / AtVPS46/CHMP1 CRIO4 (1) PDR16 / SEC14 SD CRIO5 (1) Proteína “Ring Finger” CRIO6 (1) Proteína intrínseca de tonoplasto SDCOLD1 (2) Cadena corta de la rubisco SDCOLD5 (1) Proteína de unión a clorofila
- 33. CRIO1,2 localizan en el MVB en células vegetales
- 34. Crecimiento de las plantas RD29A::CRIO2 a 10 ºC hypocotyl length 10 7,5 5 2,5 0 wt L3 L8 L9 N. Of branches/plant 4 3 2 1 Line 9 0 wt L3 L8 L9 Line 8 Vegetative Bolting N. Of Flowers/plant Inflorescence Line 3 Floral 6 4 wt 2 0 0% 25% 50% 75% 100% wt L3 L8 L9
- 35. La levadura funciona bien Pero no es una planta
- 36. Buscar genes de plantas en plantas • Ventajas: • Trabajan “In situ”, por lo que evitas el sesgo de los sistemas heterólogos contra las proteínas de membrana o las proteínas reguladoras. • Las variedades obtenidas pueden ser de utilidad immediata. • Desventajas: • Sistema caro y lento. Requiere una infraestructura complicada.
- 37. Primera aproximación: Colecciones de mutantes no marcadas (ganancia o pérdida de función) Sodium transporters SOS1 (extrussion in roots) HKT1 (phloem loading in shoots and xylem retrieving in roots) Regulators SOS2-SOS3 (Ca-PK) Calcium signaling SAL1 (PAP and inositol polyphosphatase) ABA signaling ABA (ABA2, ABA3, ABI4) Antioxidants H2O2 detoxification Catalase General metabolism Defects in fundamental processes SOS4 (pyridoxal kinase) compromise adaptation to diffferent SOS5 (arabinogalactan protein) stresses Problemas: No identifica factores limitantes, Proyectos muy largos y caros
- 38. Las colecciones marcadas: Una especie de solución para encontrar genes de tolerancia • Activation tagging: Construcción con cuatro copias en tandem del promotor del 35S. En función del sitio de inserción puede ocasionar la sobreexpresión de un gen. • El problema es que a veces se consigue la sobreexpresión de una copia truncada o la sobrexpresión de un antisentido. RB LB T-DNA Activador Transcripcional
- 39. Alejandro et al. (2007) EMBO J. 26: 3203-3215 (tesis doctoral de Santiago Alejandro; colaboración con los grupos de Pedro L. Rodriguez y José A. Fernández) A dominant mutation conferring pleiotropic tolerance to toxic cations
- 40. Y ahora que? • Los genes SATO, CRIO1-5 y XERO2 han sido introducidos en maíz, colza, soja y algodón y están actualmente en evaluación en campo. • …Quizás algún día tengamos plantas tolerantes con genes que encontramos en el laboratorio de Valencia
- 41. ¡¡¡Gracias por la vuestra atención!!! • Si teneis ganas de más: ( @jmmulet) • www.losproductosnaturales.com