Mejoramiento Genetico

PROCESO DE PRODUCCIÓN CEPAS, LÍNEAS, CLONES GENÉTICA Mutantes Híbridos Recombinantes SELECCIÓN AGENTE BIOLÓGICO Microbianas Vegetales Animales SUSTRATO MEDIO DE CULTIVO ESTERILIZACIÓN PREPARACIÓN DISEÑO Y FORMULACIÓN Naturales (Wild type) Screening, colecciones de cultivo TIPO DE REACTOR MODO DE OPERACIÓN FERMENTACIÓN BIOTRANSFORMACIÓN DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIZADOR SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN PRODUCTO EFLUENTES

MUTACION Y SELECCION HIBRIDIZACION Y RECOMBINACION TRANSFORMACION,CONJUGACION Y TRASDUCCION (Bacterias) CLONADO y EXPRESION DE GENES El empleo de MUTANTES es escaso aun en la industria alimentaria MEJORAMIENTO DE CEPAS DE USO INDUSTRIAL: METODOS GENETICOS

objetivos: aumentar los rendimientos: debe realizarse en forma PERMANENTE. disminuir o eliminar co-metabolitos indeseables (ej. pigmentos, otros productos, facilitar la purificación) estimular la utilización de fuentes de carbono o nitrógeno mas baratas (ej. plásticos) alterar morfología o funciones para obtener propiedades deseadas (ej. espuma, pellets, etc)

MODOS DE OBTENCION 1- Mutación espontanea causadas por factores físicos, químicos o biológicos, tales como : Insecticidas, fungicidas, metales, radicales libres, errores en la replicación, trasposones (IS), recombinasas, DNA polimerasas y diversas exonucleasas con función de reparación. 2- Mutacion inducida causada por agentes químicos , físicos o endogenos, tales como: Análogos de bases (ej, bromouracilo), Deaminaciones (ácido nitroso) Agentes alquilantes (NTG, mostazas, ETMS), Radiaciones u.v Radiaciones ionizantes, Radicales libres, errores en la replicación y en la reparación, etc

Agentes Mutagenicos fisicos y quimicos y suS Mecanismos de acción

Condiciones requeridas para la mutación 1- Obtención de células o esporas aislados 2- Considerar el tipo de organismo: haploide, poliploide, multinucleados. 2- Selección del agente, condición de tratamiento, y tiempo de exposición en función de: carácter de la mutación (dominancia o recesividad) numero de eventos mutacionales por célula frecuencia de la mutación (10 -10 a 10 -4) estabilidad de la mutación (bajo nivel de reversión) - Considerar los sistemas de reparación, sobre todo los que actúan en la oscuridad y en ausencia de replicación para que las lesiones premutacionales puedan convertirse en una mutación directa durante la replicación o en una mutación indirecta por recombinación después de la replicación.

MECANISMOS DE REPARACION SIN ERRORES 1- Fotoreactivación (ruptura de los dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa ( phr ) activada mediante luz visible). 2- Escisión + reparación * Reparación de nucleotidos aislados por lesión u.v: necesita la otra hebra como templado (hasta 30 bp) Intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD * Reparación de bases modificadas (sitiosAP, alquilación o metilación) Intervienen exoIII ( xth), endo IV (nfo) DNA glicosilasa (fpg) y/o DNA glicosilasa I (tag) 3- Reparación post- replicativa * Reparación del apareamiento (“mismatch”): una metilasa reconoce DNA recientemente replicado ( dam) e intervienen las proteínas “mut” (helicasas, etc) * Reparación por recombinacion ( recA, recBCF, sbcB)

MECANISMOS DE REPARACION QUE PRODUCEN ERROR (mutaciones) Son sistemas inducibles que se activan frente al daño en el DNA (1000 bp) o cuando se inhibe la replicación S.O.S Las proteinas umu se unen a la DNA pol e impiden su rol corrector Lex A activo (-) recA, sulA, uvr ABD, RecA +ssbDNA RecA* umuDC, polB Lex A inactivo

Aislamiento selectivo de mutantes El objetivo de esta etapa es seleccionar las mutantes mas adecuadas, pero al mismo tiempo reducir el numero de ensayos que no ofrezcan resultados apreciables.

B- AISLAMIENTO DE MUTANTES RESISTENTES La poblacion mutagenizada se siembra en un medio selectivo que contiene una sustancia toxica que impide el crecimiento de la cepa silvestre. Solamente pueden desarrollar los clones resistentes . De esta forma pueden aislarse mutantes resistentes a antibióticos o a antimetabolitos. Resistencia a antibioticos : puede ser útil no solo como marcador genético sino ademas por su permeabilidad incrementada , mayor síntesis de proteínas, etc Resistencia a antimetabolitos: se emplean análogos estructurales del metabolito que ejerce los efectos regulatorios .El crecimiento en presencia de estos antimetabolitos ocasionan la muerte de las celulas normales, ya que por su similitud estructural con los metabolitos normales causan retroinhibición. En cambio los mutantes resistentes a los análogos pueden sobrevivir pues sintetizan los metabolitos en exceso, en algunos casos debido a sus mecanismos regulatorios modificados.

MEJORAMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS Recuperación en cultivo líquido plaqueo Fermentación Ensayo de actividad Revisar la actividad de las cepas exitosas Analizar nuevamente las cepas exitosas (screening secundario) Preservación Post-test Scale up Cultivo sumergido Reinicio del proceso Mutagénesis

SELECCION DE CEPAS SOBREPRODUCTORAS DE PENICILINA

Conclusiones La técnica de MUTACION Y SELECCIÓN ha sido muy exitosa en la producción de metabolitos microbianos, a diferencia de lo observado en general en organismos superiores. Se han logrado rendimientos de 20 g/l para cefalosporinas, tetraciclinas, eritromicina y estreptomicina. Tambien se han obtenido mutantes sobreprductoras de ácido cítrico (100 g/l), lisina (70 g/l) vitamina B12 (6 g/l), ácido glutamico (100 g/l), nucleótidos (20-30 g/l) y celulas vegetales con propiedades deseadas como resistencia a pesticidas o mayor contenido de Trp.

Otros mecanismos geneticos Recombinación : - sexual (híbridos de levadura) - parasexual - fusion de hifas fusión nuclear (1/10 -7 ) haploidization (al azar) fusion de Protoplastos Bacteria - lysozyme, fungi - glucanasa, chitinasa PEG, Electrofusion

haploide diploide Reproducción asexual Reproduccion asexual Fusión celular asco ascosporas Interacción de celulas de distinto mating type (Sexo) meiosis mitosis mitosis

- RECOMBINACION GENETICA EN HONGOS y LEVADURAS: CICLO SEXUAL

n + n heterokaryon n n haploide 2n diploide 2n + 1 2n - 1 nuclear fusion no-disyunción No-disyunción haploidisación PARA-SEXUAL CYCLE Recombinación mitótica 2n

Para forzar la fusión nuclear y la formación de heterocariones puede emplearse : Forzar la recombinacion con radiaciones ionizantes o mutagenos (fluoruracilo) Selección nutricional (parentales auxótrofos que se cultivan en un medio mínimo forzandose la recombinación) Método químico o físico (FUSION DE PROTOPLASTOS / ELECTROFUSION) METODOS DE FUSION CELULAR : ELECTROFUSION Y FUSION DE PROTOPLASTOS 1 - Obtencion de protoplastos bacterias gram positivas : lisozima o antibioticos + estabilizador osmotico. bacterias gram negativas :lisozima+ EDTA + estabilizador osmotico levaduras y hongos : distintas enzimas : glucanasas, sulfatasas, etc

2- Fusion celular método químico (PEG + Ca 2+) : solo para protoplastos método eléctrico (electroforésis + electroporación) que provoca agregación y luego ruptura reversible de la membrana con formación de heterocariones. 3- Regeneración de la pared (cultivo en medios gelificados) 4 - Selección de recombinantes por morfología, contenido de DNA, marcadores mitocondriales de resistencia, niveles de producción, etc.

OTROS METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS Y EUCARIOTAS INFERIORES 1- Conjugacion : mediada por plásmidos CONJUGATIVOS. A traves de pili y gobernado por sexo transferencia de un fragmento de DNA del donante Ej. La recombinación natural con plasmidos conjugativos de cepas de Lactococcus se utiliza para construir cepas resistentes a fagos que se emplean como starters. Se diminuye así el enranciamiento y acidificación de leches. 2- Transduccion : mediada por fagos que transmite segmentos de DNA del donante al receptor. La integración del fragmento se realiza por recombinacion sitio especifica ( genes att e hin ) Ej. Patogenicidad 3- Transformación : transferencia de DNA desnudo por células competentes. Ej. adquisición de caracteres diversos en la naturaleza Ej. aumento de la fijación de nitrógeno (simbiosis de Rhizobium con leguminosas) 4- Transposición : mediada por transposones (c/s IS ) con recombinación y sin homología www.life.uiuc.edu/micro/316/topics/plasmids/conjugation-mech.html

MOLECULAS DE DNA CONSTRUIDAS “IN VITRO” QUE PUEDEN REPLICARSE Y/O EXPRESARSE EN LA CELULA VIVA USOS AISLAR Y CARACTERIZAR GENES ALTERARLOS AUMENTAR EL NUMERO RETORNAR LOS GENES ALTERADOS A CELULAS VIVAS (MICROORGANISMOS, PLANTAS, ANIMALES) PARA EXAMINARLOS O UTILIZAR SU EXPRESION MEJORAMIENTO GENETICO EMPLEANDO TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE

EXTRACCION DEL DNA FUENTE VECTOR DE CLONADO FRAGMENTACION ENZIMATICA LINEARIZACION AISLAR CELULAS CON EL GEN CELULA HUESPED PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GEN CLONADO PRODUCCION DE PROTEINAS PROCEDIMIENTO DE CLONADO LIGADO INTRODUCCION DEL DNA EN EL HUESPED RECOMBINANTES

HERRAMIENTAS BASICAS PARA EL CLONADO DE GENES DNA BLANCO O SECUENCIA DE INTERES : DNA genómico (aislado directamente de células o tejido) DNA complementario (cDNA) preparado in vitro a partir de un templado de mRNA empleando transcriptasa reversa. DNA sintético, a partir de oligonucleótidos, con DNA pol (DS) o con M13 (SS ) o por amplificación de fragmentos por PCR ENZIMAS DE ACIDOS NUCLEICOS DNA polimerasas, transcriptasa reversa, DNA ligasas, endonucleasas de restriccion (clivan el DNA en sitios especificos)

VECTOR : molecula de DNA en la que puede insertarse DNA exógeno para que pueda replicarse en una celula apropiada Plasmidos, bacteriofagos virus de animales y plantas cromosomas artificiales HUESPEDES * BACTERIAS : E.coli y B. subtilis (transformacion, empaquetamiento “in vitro”) * LEVADURAS (transformacion, electroporación) * CELULAS ANIMALES (transfección, electroporación, virus animales, microinyección en nucleo) * CELULAS VEGETALES (electroporación, microinyección, T-DNA, revolver)

E.coli Es el microorganismo mejor estudiado no patógeno fácil de cultivar en medios baratos crecimiento rápido Desventajas las proteínas no son secretadas contienen endotoxinas no realizan modificaciones post-traduccionales posibilidad de plegamiento incorrecto de proteínas la separación de celulas puede dañar las proteínas Ventajas genética bien conocida. Mecanismos regulatorios conocidos crecimiento rápido y fácil medios de cultivo baratos altos niveles de expresión

Levaduras eucariotas de crecimiento aislado con paredes similares a las de plantas no son patogenos amplio conocimiento de su genetica y fisiologia rapido crecimiento en pequeña y gran escala Presenta varios promotores fuertes Un plasmido natural (2  m) puede ser usado como vector de expresion endogeno Tienen aparato de golgi para realizar modificaciones post transcripcionales y secreción. Secreta pocas proteinas naturales por lo que los productos recombinantes pueden recobrarse bastante puros (pocos contaminantes y de facil separación)

Células de mamíferos¨: CHO (de tumor ovárico de ratones), HeLa (human cervix) BHK (baby hamster kidney) e hibridomas. * los vectores son virus * se emplean para producir proteínas intracelulares pero preferentemente proteínas que requieren modificaciones postranscripcionales para permitir su secreción. * es fundamental testear el tipo y contenido de virus presentes en estas celulas ya que pueden acompañar los procesos de purificación junto con los fármacos (hepatitis, papiloma, HIV)

Características: Son pequeños (miles de pares de bases) generalmente portan solo uno o algunos genes son circulares tienen un único origen de replicacion no movilizables Para su utilizacion como vectores de clonado se requiere ademas: sitios unicos de clivaje para enzimas de restriccion gran numero de copias (por eliminación de la region de control) marcadores que permitan su reconocimiento VECTORES DE CLONADO PLASMIDOS : moleculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma EcoRI BamHI HindIII SalI Origin of replication PstI Ap r Tc r pBR322 Ejemplos: pBR322, pUC19

EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS EN LA EXPRESIÓN DE GENES HETEROLOGOS 1- Quimosina recombinante : Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura. Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos. 2- Insulina humana recombinante (Eli Lily and Co) (en E.coli) 51 aminoácidos ; MW =6 Kda, 3- Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) ( Genentech) 4- Vacuna Hepatitis (en levaduras ) 5- Interleukina- 2 humana , MW= 15 Kda 6- Interferón (citokina) 165 aminoácidos, MW= 20Kda

PROCARIOTAS GEN ESTRUCTURAL DNA mRNA TRANSCRIPCION TRADUCCION PROTEINA EUCARIOTAS I1 E1 I2 I3 E2 E3 I4 E5 I6 E6 I7 DNA TRANSCRIPCION mRNA primario TRADUCCION PROCESAMIENTO E1 E2 E3 E4 E5 E6 MENSAJERO FUNCIONAL ORGANIZACION GENETICA PROTEINA

Vector de expresion general de eucariotas * ORI euk y ORI E : origenes de replicacion. * Amp y ESM: marcadores de selección * Cs: sitio de clonado * P: promotor * T: señales de terminación y poli-A

3- Cromosoma artificial de levadura

Sintesis de cDNA a partir de mRNA

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