Rotavirus y Eelectroforesis
- 1. Ruth Bishop y col. Royal Children`s Hospital en Melbourne, Australia 1974 Thomas Henry Flewett
- 2. Estructura del ROTAVIRUS Cápside Externa 80 nm. Cápside Interna Cápside Interna
- 3. ROTAVIRUS ESPECIES DE RV. Segmentos de ARN Grupo A – (SGI-SGII) Grupo B - China VP1/ VP3 Grupo C – Australia, Brasil Grupo D VP2 Grupo E Grupo F Grupo G VP6 VP7 VP4 Clivada por tripsina pancreática VP8 / VP5
- 4. Proteínas virales No estructurales (NS) Replicación ARN viral NSP1 Transcrita por el gen 5 y es una proteína de unión al ARN. NSP2 Proteína de unión de ARN, que se acumula en inclusiones citoplasmáticas. NSP3 Unida al ARNm en células infectadas y es responsable de la finalización de la síntesis proteica celular. NSP5 Codificada por el segmento 11 del genoma vírico del RV A y en las células infectadas se acumula en el viroplasma NSP4 Enterotoxina viral que induce Diarrea (primera enterotoxina que se descubrió)
- 5. Grupo A La clasificación de rotavirus de acuerdo con el serotipo VP7. Se divide en 14 serotipos de RV del grupo A de origen animal y humano siendo: Vp7(G (Glicoproteínas)). Serotipos que infectan a Humanos (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10 y G12) 20 Genotipos diferentes de VP4 (P) 10 Serotipos Vp4(P(Prot. sensible a la Proteasa)) Serotipos en Humanos (P1A, P1B, P2A, P3, P3B, P4, P5 y P8)
- 7. NÚCLEO
- 8. Replicación viral (Penetración directa) 4 Nuevos virus deja a las células infectadas para invadir a las sanas ROTAVIRUS VP4 Célula Epitelial 1 Hemaglutinina viral 2 Transcriptasa viral. 3 El virus se multiplica y produce la toxina 5 Las células epiteliales mueren y los fluidos salen del cuerpo
- 9. Patogenia Respuesta Inmune 11 H. a 3 días Disminución en la superficie de absorción Alteración de la integridad epitelial (Incubación) Deficiencia de disacáridos
- 10. Cuadro Clínico 7 a 10 Días 14 o más días Intolerancia disacáridos 5-8 Días 2-3 Días 2-3 Días
- 11. Diagnóstico de Laboratorio Serología ELISA Inmunofluorescencia Aglutinación en Latex Contrainmunoelectroforesis Reacción de fijación del complemento
- 12. Diagnóstico de Laboratorio Otros recursos Inmunoelectromicroscopía. Hibridación para detección de heces. Sondas de oligonucleótidos acopladas a radioactividad. Cultivo celular Estudio de reaccion de polimerasa en cadena. Identificación de ARN segmentado
- 14. Control Específico 2 Meses de Edad 4 Meses de Edad 6 4 Meses de Edad
- 15. Epidemiología 65-67% ---1año de edad 35% entre 2 y 3 años de edad Caracas: En todo el año. 85% -- 1 año 14% -- 2 años 1% 3 años Valencia – Edo. Carabobo Estacionaria. 67% -- 1 año 26% -- 2 años 7% 3 años Templados: EE.UU, México, Finlandia, Gran Bretaña (Fríos o Secos) Tropicales: Brasil, Venezuela varios países de África (todo el año)
- 17. Electroforesis Vocablos griegos “êlektron” (“ámbar”) y hace referencia a la electricidad “phoros” (“llevar o trasladar”) Etimológicamente puede definirse como: Un transporte o traslado bajo la acción de la electricidad. Más propiamente, la electroforesis se define como un método analítico para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
- 18. Arne Tiselius (1937) Desventajas Dio paso a aquellos que Escaso poder de usaban un soporte sólido o resolución Exigir gelatinoso gran cantidad Embebido en de muestra, la solución amortiguadora Muy laborioso de pH Sobre el que ocurría la En la práctica no separación electroforética permitir la separación de los los total decomponentes en bandas o zonasde la componentes discretas mezcla “Electroforesis De Frentes En Movimiento” o “moving boundary electrophoresis”
- 19. Fundamento El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma aleatoria o movimiento browniano
- 20. Tipos de Electroforesis Electroforesis Libre Disoluciones o suspensiones. Fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Desesuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.
- 21. Electroforesis en Zona Fuente de alimentación. Cubeta. Soporte electroforético.
- 22. Tipos de Electroforesis de Zona ELECTROFORESIS EN PAPEL El revelado se realiza empleando los mismos métodos que los utilizados en cromatografía sobre papel, mediante la acción de los colorantes adecuados ELECTROFORESIS EN GEL La separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño.
- 23. Tipos de Geles Geles de agarosa Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos. Geles de poliacrilamida Se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible
- 24. La Electroforesis en Geles de Poliacrilamida TIPOS 1. Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo) a. PAGE-nativa b. PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE) c. Isoelectroenfoque 2. Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)
- 25. PAGE-nativa SEPARAR EN FUNCIÓN Carga intrínseca de las proteínas PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE) Tamaño (MM) SEPARAR EN FUNCIÓN D. PM de las proteínas Detergentes (SDS, sodio dodecil sulfato) Caótropos (urea) agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT).
- 26. Isoelectroenfoque DESPLAZAMIENTO Gradiente de pH Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
- 28. La Electroforesis Capilar (CE) Detector De las especies portadoras de Electroferograma--- Muestra el una carga eléctrica global, bajo registro de la composición de el efecto de un campo eléctrico y la muestra. en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) Solo las especies que se adecuado. dirigen hacia el cátodo serán detectadas. Solución Buffer SEPARAR MIGRACIÓN
- 29. Métodos de Detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco. Detección por Fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos portadores de un fluoróforo.
- 30. Factores que Afectan la Electroforesis CAMPO ELÉCTRICO MUESTRA SOPORTE TAMPÓN
- 31. Resultados Muestras rotapositivas que mostraron el patrón típico de ARN de