![Densidaddecélulas[OD]
Extracción del sobrenadante celular
con factor VIII recombinante
c
Alimentación por perfusión continua
Tiempo [días]
Densidaddecélulas[OD]
1 2 3 4 5 6 180
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a fase de latencia b fase logarítmica c fase estacionaria
Fase de
crecimiento](https://image.slidesharecdn.com/soledadruizxviicursohemoderivados2013v1xslolectura-130429033152-phpapp02/85/Hemoderivados-V-Productos-de-origen-recombinante-45-320.jpg)
Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante
- 1. Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante XVII Curso de Introducción a laXVII Curso de Introducción a la farmacoterapia con hemoderivados H. Vall d´Hebron, 22 - 25 Abril 2013 Soledad Ruiz Marketing Manager BioPharma & Vacunas Baxter
- 2. Es la técnica mediante la cual se aislan y transfieren secuencias de ADN altamente específicas (genes) de un organismo y se ¿En qué consiste la tecnología recombinante? específicas (genes) de un organismo y se recombinan con el ADN de otro
- 3. Productos biológicos versus productos sintéticos convencionales FVIII: Glicoproteína con 6 dominios Gen Factor VIII localizado en cromosoma X (Xq28) 2,351 aminoácidos MW 270,000 Dalton Aspirina Ibuprofeno
- 5. Producto Origen Indicación FVIII Plasmático Recombinante Hemofilia A FVIII+FVW Plasmático Enfermedad de von Willebrand Hemofilia A FIX Plasmático Recombinante Hemofilia B Complejo protrombina Productos e indicaciones Complejo protrombina activado Feiba® Plasmático Hemofilia con inhibidor FVII activado Novoseven® Recombinante Hemofilia con inhibidor Hemofilia adquirida Déficit FVII Trombastenia de Glanzmann con anticuerpos anti-plaqueta FXIII Plasmático Recombinante Déficit congénito de FXIII
- 6. Fuente biológica de obtención Derivados plasmáticos Productos recombinantes
- 7. Key N S, Negrier C.The Lancet 2007
- 11. April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr. 1962 April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr. Francis Crick's discovery of the double helix. In March of 1953, after many years of attempting to understand and elucidate the DNA structure they proposed the complementary double-helical configuration. Subsequently, Dr. Watson, Dr. Crick and Dr. Maurice Wilkins received the Nobel Prize in 1962 for "their discoveries of the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material.”
- 12. 1984 Técnica de hibridomas para la elaboración de anticuerposelaboración de anticuerpos monoclonales (Köler y Milstein 1975)
- 13. ¿En qué consiste la tecnología recombinante? - Se inicia al aislar el gen de interés - Se obtiene un vector (plásmido), es decir un fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente - El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante)
- 15. ¿En qué consiste la tecnología recombinante? - Se inicia al aislar el gen de interés - Se obtiene un vector (plásmido), es decir un fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente - El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNAintegrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante) - Se clona para obtener cantidades suficientes de DNA - Se inserta en una célula huésped que sintetizará la proteína extraña (a ella) a partir de este DNA recombinante
- 16. Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero Molécula ADN Gen FvW Cadena especial de ADN (Plásmido) Gen Factor VIII Célula huésped Núcleo Plásmido se úne al ADN de la célula huésped Plásmido
- 18. •Desnaturalización y centrifugación •Extracción del RNA Precipitación y extracción•Precipitación y extracción del DNA
- 22. Enzimas DNA
- 24. DNA ligasa
- 25. Estructura del FVIII humano COOH (Carboxl-Terminal)BPéptido de alto peso molecular (Amino-Terminal) NH2 A1 A2 Punto de escisión proteolítica Cadena pesada COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2 80 kd 90 kd Metal++ Cadena ligera
- 26. Factor VIII se activa in vivo mediante la escisión del dominio B Péptido de alto peso molecular (Amino-Terminal) NH2 A1 A2 Punto de escisión proteolítica COOH (Carboxl-Terminal)B COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2 80 kd 90 kd Metal++
- 27. Las funciones del dominio B • No función hemostática • Papel en el transporte intracelular • Favorece la secreción de factor VIII COOH (Carboxl-Terminal)B Dorner et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:7429-32 ; Pipe et al. JBC 1998; 273: 8537-8544 ; Kaufman et al. Blood Coagul Fibrinolysis;1997 Dec;8 Suppl2:S3-14 ; Moussalli et al. JBC 1999; 274: 32539-32542 ; Pipe SW. Haemophilia 2009; 1–10 • Control en el plegamiento de la proteína de factor VIII – Interacción con las proteínas chaperonas • Revisiones recientes sobre las funciones del dominio B, destacan diferentes vías por las que la deleción del dominio B podría afectar a la actividad de FVIII en sangre
- 28. Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero Molécula ADN Gen FvW Cadena especial de ADN (Plásmido) Gen Factor VIII Célula huésped Núcleo Plásmido se úne al ADN de la célula huésped Plásmido
- 29. CHO: Chinese Hámster Ovary cells (Células de Ovario de Hámster Chino) BHK: Baby Hámster Kidney cells (Células de riñón fetal de hámster)
- 30. 1er Paso: Desarrollo de una línea celular mamífera Para sintetizar moléculas biológicas complejas, como el FVIII humano, son necesarios sistemas celulares biológicos
- 31. Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) • Línea celular ampliamente estudiada y bien caracterizada (no procedente de línea celular tumoral) • Se utiliza para producir múltiples proteínas recombinantes: – EPO (anemia), Interferon-β1a (esclerosis múltiple), folitropina-ß (infertilidad), Dnasa (fibrosis quística) Koplove. Ann Hematol 1994; 68: S15-S20 Goochee et al. Biotechnology 1991; 9:1347-1355 Hotchkiss et al. Thromb Haemost 1988; 60: 255-61 • Capaz de realizar todas las modificaciones postranslacionales y postransduccionales del Factor VIII • Resistente a infección por la mayoría de virus humanos (Coronavirus, Sarampión, Influenza, Herpes, Rhino viruses...etc.) • Posibilidad de producción de grandes volúmenes a gran escala
- 32. La selección del clon celular productor de FVIII se basa en ciertos criterios clave GD 7/8 GE 5/6 GD 8/6 ... 600 clones Programa de selección de clones (Tests) • Homogeneidad de la población • Producción robusta de FVIII y FvW • Perfil de Western Blot
- 33. Células productoras de rFVIII Inmunofluorescencia FVIII W. Mundt, Baxter BioScience. Clon rAHF-PFM
- 34. Nutrientes necesarios para mantener las células vivas: Azúcares Sales Aminoácidos Vitaminas Selección del Medio de Cultivo Celular Aditivos que ayudan al crecimiento celular: Suero ternera fetal 1950s Insulina, albúmina, aprotinina, transferrina (bovina) 1990s Albúmina humana e Insulina recombinante finales 1990s Medio vegetal, sin proteínas humanas (ADVATE) 2004 Evolución
- 35. Características de los concentrados actuales de FVIIIr Utilización de proteínas derivadas de plasma humano Biosíntesis en cultivo celular Purificación Formulación Primera Presente Presente Presente Generación Presente Presente Presente Segunda Generación Presente Presente Ausente Tercera Generacion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
- 36. Desarrollo de: -Bancos Celulares Maestros (“Master Cell Bank“) y -Bancos Celulares de Trabajo (“Working Cell Bank“) Minus 135°C Células CHO idénticas con gen de FVIII insertado en sus genomas
- 37. Cada fermentación comienza con la reanimación de las células procedentes del Working Cell Bank 1 ml (congelado) 70 ml Incubación (37°C)
- 38. Viales del Working Cell Bank para comenzar el cultivo celular *Las fotografías presentadas se tomaron en la planta de Baxter para la fabricación de ADVATE (Neuchatel, Suiza)
- 39. Preparación de la solución celular
- 41. Expansión de la solución celular Incubación en botellas rotatorias a 37ºC
- 42. Proceso de fermentación FVIII • Los cultivos celulares crecen en las botellas rotatorias • Al llegar a una densidad determinada, se aúnan y se utilizan para comenzar la fermentación en biorreactores • 3 pasos de fermentación en biorreactores: 1. Biorreactor 40 l 2. Biorreactor 320 l 3. Biorreactores 2500 l (2 X)
- 43. Biorreactores Biorreactor 40 L. Tanque con Medio no celular 3000 L. Biorreactor 320 L. 2 x Biorreactores 2500 L.
- 44. Proceso de Fermentación CHEMOSTAT Medio Fresco Sobrenadante - Densidad celular - Viabilidad celular - pH - Gasto de oxígeno - Mezclado / agitación Medio Fresco estéril Sobrenadante celular cosechado continuamente BIORREACTOR en modo Chemostat Monitorización constante de:
- 45. Densidaddecélulas[OD] Extracción del sobrenadante celular con factor VIII recombinante c Alimentación por perfusión continua Tiempo [días] Densidaddecélulas[OD] 1 2 3 4 5 6 180 a b a fase de latencia b fase logarítmica c fase estacionaria Fase de crecimiento
- 46. Proceso de Cultivo Celular continuo y estable DensidadCelular Tiempo DensidadCelular Proceso de Alimentación por lotes Proceso Chemostat
- 47. El proceso de fabricación de FVIIIr consiste en 3 pasos principales: 1. Biosíntesis de FVIII en cultivo celular en biorreactores 2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos 3. Formulación final, llenado y liofilización
- 48. Purificación de FVIIIr mediante cromatografía (Inmunoafinidad y cromatografía de intercambio iónico)
- 49. Cromatografía de inmunoafinidad / Ligandos sintéticos Cromatografía de intercambio catiónico Proceso Purificación Línea celular de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales anti-FVIII adaptada a un medio vegetal libre de proteínas FVIII Inactivación viral Cromatografía de intercambio aniónico Tratamiento solvente/detergente S/D (TNBP+TritonX-100/Tween 80) (NF) El eluído es congelado y almacenado a –80ºC Para la formulación final, llenado y liofilización
- 50. Recogida del FVIIIr purificado El “bulk“ de FVIIIr se almacena a -80°C hasta la formulación final
- 51. Llenado aséptico de viales
- 52. Liofilizadores
- 55. Características de los actuales concentrados de FVIIIr Utilización de material derivado de plasma humano Biosíntesis en cultivo celular Purificación Formulación Primera Presente Presente Presente Primera Generación Presente Presente Presente Segunda Generación Presente Presente Ausente Tercera Generacion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
- 56. LÍNEA CELULAR CHO BHK CHO CHO MOLÉCULA FVIII FVIII COMPLETO FVIII COMPLETO BDD-FVIII FVIII COMPLETO UTILIZACIÓN DE ALBÚMINA SI SI NO NO INACTIVACIÓN Y RECOMBINATETM 3ª GENERACIÓN2ª GENERACIÓN1ª GENERACIÓN FACTOR VIII INACTIVACIÓN Y ELIMINACIÓN VIRAL CROMATOGRAFÍA SD SD + NF SD CROMATOGRAFÍA 1. Cromatografía de intercambio iónico 2. Cromatografía inmunoafinidad 1. Cromatografía de intercambio iónico 2. Cromatografía inmunoafinidad 1. Cromatografía de intercambio iónico 2. Cromatografía con ligandos sintéticos (químicos) 1. Cromatografía de intercambio iónico 2. Cromatografía inmunoafinidad EXCIPIENTES Aminoácidos Albúmina Cloruro sódico Sacarosa Aminoácidos Cloruro Sódico Sacarosa Aminoácidos Cloruro Sódico Trehalosa Manitol Aminoácidos Cloruro Sódico
- 57. Ovario de hamster chino Cromatografía y nanofiltración No presencia de albúmina nanofiltración 1.Cromatografía de intercambio iónico 2.Cromatografía de inmunoafinidad por anticuerpos monoclonales murinos Aminoácidos, sacarosa y Tween 80
- 59. FVIIa Plasmático y FVIIa Recombinante (rVIIa) • Estructura protéica idéntica (aminoácidos, péptidos). • Igual estructura de hidratos de carbono.• Igual estructura de hidratos de carbono. • Propiedades ezimáticas idénticas.
- 60. Indicaciones del rFVIIa • Registros: EU (96), USA (99), Japón (00) • Hemofilia congénita con inhibidor • Hemofilia adquirida• Hemofilia adquirida • Déficit congénito de factor VII • Trombastenia de Glanzmann
- 61. Próximos factores recombinantes en el mercado Factor IX recombinante (FIXr) MOLÉCULA COMPLETA TERCERA GENERACIÓN BAXTER Factor VIII recombinante (FVIIIr) DOMINIO B TRUNCADO TERCERA GENERACIÓN NOVO-NORDISK Factor VIII recombinante (FVIIIr) MOLÉCULA COMPLETA TERCERA GENERACIÓN BAYER Factor VIII recombinante (FVIIIhr) TERCERA GENERACIÓN OCTAPHARMA Factor XIII recombinante (FXIIIr) TERCERA GENERACIÓN NOVO-NORDISK Factor VIII recombinante (FVIIIhr) TERCERA GENERACIÓN CÉLULAS HUMANAS OCTAPHARMA Factor VII recombinante activado (aFVIIr) TERCERA GENERACIÓN BAXTER Factor von Willebrand recombinante (FvWr) TERCERA GENERACIÓN BAXTER Factor VIII recombinante porcino (OBI-1) Molécula de FVIII porcina de origen recombinante BAXTER
- 62. CRITERIOS DE UTILIZACIÓN DE LOS FACTORES ANTIHEMOFÍLICOS (Fundación Victoria Eugenia, 2006) Dado su perfil de eficacia y seguridad se recomienda el paso progresivo del tratamiento de la hemofilia a concentrados de FVIII o FIX de origen recombinante, en modalidades terapéuticas habituales (a demanda, profilaxis primaria, profilaxis secundaria) “Es particularmente importante, en temas de seguridad, que no creemos una situación en la que pudiera peligrar la disponibilidad de derivados de plasma para aquellos que lo necesiten” (Goldfard B. National Hemophilia Foundation, Hemacare 2007; 12:15-22)
- 63. GUÍA TERAPÉUTICA
- 64. Retos en los factores de la coagulación • Inhibidores • Coste • Adherencia
- 65. Nuevos concentrados de factores de la coagulación • INHIBIDORES • Coste • Adherencia
- 66. Inhibidores • Coppola A. Haemophilia 2010; 16 (supp 1):13-19
- 68. Inhibidores: Estudio RODIN OBJ: Evaluar si el tipo de FVIII y el intercambio de productos puede estar asociado al incremento de inhibidores en PUPs con HAG MET: Recogida retrospectiva de 75 DEs en 574 ptes HAG nacidos entre 2000-20102000-2010 RESULTADOS: 1. FVIIIr y FVIIIdp confieren igual riesgo de desarrollo de inhibidores 2. Contenido FvW y cambio entre productos no estuvo asociado con riesgo de desarrollo de inhibidor 3. Inesperadamente, los FVIIIr de 2ª gen se asociaron a un riesgo aumentado (60%), comparando con 3ª gen
- 69. Inhibidores: Consecuencias del Estudio RODIN
- 70. Retos en los factores de la coagulación • Inhibidores • COSTE • Adherencia
- 71. Coste: Eficiencia • Reducción de hemorragias en 99,4% en la mediana de la TAH • La profilaxis individualizada (pK) con FVIII 3ª gen de molécula completa redujo nº sangrados incluso en dosificación cada 3 días • 42% de los pts tuvieron CERO sangrados/año
- 72. Retos en los factores de la coagulación • Inhibidores • Coste • ADHERENCIA
- 73. • Adherencia a profilaxis es aún problema • Lindvall K,et al. Haemophilia 2006; 12: 47-51. • Duncan N, et al . Haemophilia 2010; 16: 247-55. Adherencia • Personalización de la profilaxis para cada tipo de paciente, e infusiones menos frecuentes pueden mejorarla
- 74. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia? Infusiones IV de factor menos frecuentes Tratamiento sin infusiones IV
- 75. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia? Infusiones IV de factor menos frecuentes: – Desarrollo de cocentrados de Factor VIII de más larga duración: • Unión a proteínas de fusión: IgG o albúmina Hace a la molécula más resistente a la acción de la trombina, manteniéndose activo más tiempoactivo más tiempo • Unión a otras moléculas: PEG/ PSA/PEGlip Para disminuir la velocidad de inactivación por parte de la trombina, y aumentar el tiempo que la molécula permanece activa (ABC) -- PEG Para conservar la función con un aumento de la estabilidad • Combinación de FVIII pegilado o polisializado con FvW • Modificación de aminoácidos: Análogos, rFVIII variante Prolonga la vida media, por ej. aumentando unión a plaquetas
- 76. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia? FVIII: Vida media corta No atraviesa piel ni pulmón Se destruye en el tracto GI Genera inhibidores si se administra por vía no IV Tratamiento sin infusiones IV: – Moléculas sintéticas – Restauran la capacidad de generación de trombina por la vía extrínseca (por ejemplo, bloqueando los inhibidores de la coagulación, inhibidores del TFPI) – Fucoide como tto adyuvante del FVIII en profilaxis Tratamiento vía oral
- 77. La tecnología recombinante: Permite generar proteínas para uso terapéutico no procedente de donaciones No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma CONCLUSIONES No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma Minimiza el riesgo de transmisión de virus humanos Tiene un perfil de seguridad específico La fuente de partida es única, sistematizada y bien caracterizada Es un proceso industrial técnicamente exigente y regulado
- 78. La tecnología recombinante : Supone un incremento potencial en el nivel de seguridad de los hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de CONCLUSIONES hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de seguridad implementadas en los productos plasmáticos Abre el camino a nuevas generaciones de proteínas terapéuticas