Práctica n° 10
- 1. BIOLOGÍA GENERAL PRÁCTICA N°10 ENZIMAS. I. OBJETIVOS Conocer los fundamentos de las técnicas que permiten detectar la presencia o ausencia de proteínas en muestras biológicas (ensayos cualitativos). Discutir el significado de los términos falso positivo y falso negativo aplicados a una reacción de caracterización. Realizar ensayos cuantitativos para la determinación de la cantidad de proteínas presentes en una muestra por métodos colorimétricos. Reconocer la acción de las enzimas frente a diversos compuestos Definir los parámetros que afectan la actividad enzimática. II. FUNDAMENTOS La enzima es una proteína, generalmente globular y conjugada, capaz de aumentar hasta 1020 veces la velocidad de una reacción debido a su alto poder de activación, específico para cada reacción su parte proteínica se llama apoenzima, que al unirse a un cofactor produce la enzima. Si en un extracto biológico se desea establecer la presencia de una determinada proteína con actividad biológica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha proteína, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es funcional. Cuando la actividad biológica es específica (como ocurre en el caso de las enzimas) muchas veces resulta innecesaria la etapa de purificación, ya que la mencionada actividad biológica será evidenciable aún en presencia de otras proteínas, aunque será necesaria la eliminación de cualquier sustancia que interfiera con su actividad. Para medir la actividad enzimática se requiere un método analítico sencillo que determine la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción. Enzima + Sustrato Productos Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentración de enzima, etc. sobre la velocidad de la reacción, debe realizarse dicha reacción variando el factor en estudio y dejando constantes todos los demás. III. MATERIALES Y MÉTODOS Alimentos diversos (huevo, leche, papaya con pepas, papa, hígado (de pollo y res) y Gelatina ) Probeta 100 mL Tubos de ensayo Vaso de precipitado de 250mL Rejilla y trípode Mechero Agua destilada (control negativo) Sulfato de cobre al 1% Caseína de leche 1% Hidróxido de sodio 10% Solución de almidón al 5% Lugol Fehling Pipetas 5ml y 1mL Bombillas Goteros Agua oxigenada IV. PROCEDIMIENTOS Reacción del biuret: Colocar en un tubo de ensayo: Solución a investigar 0,5 ml Hidróxido de sodio al 10% 10 gotas Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 26
- 2. BIOLOGÍA GENERAL Sulfato de cobre al 1% 1 gota Mezclar por agitación, anotar sus observaciones Ensayo cualitativo de proteínas Tomar 4 tubos de ensayo Rotularlos como se indica en la segunda columna de la siguiente tabla Empleando el protocolo de la reacción del biuret, realizar la reacción sobre cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna de la misma tabla Tipo de Ensayo Solución a investigar Control Negativo (Blanco) Agua destilada Control Positivo Caseína al 0,1% Muestra 1 Gelatina comercial al 1% Muestra 2 Clara de huevo al 10% Interpretar los resultados. Ensayos de Estabilidad de Proteínas en Dispersión Acuosa Efecto del pH En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersión de caseína De leche al 1% Agregar ácido acético al 10% gota a gota hasta obtener un precipitado Al observar la formación de precipitado comenzar a agregar hidróxido de sodio al 10% hasta lograr la redisolución del precipitado Interpretar los resultados obtenidos. Hidrólisis del almidón Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4. Añadir en cada tubo 5 mililitros de una solución diluida de almidón. A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva (Para ayudarte y formar más saliva, piensa en un limón o en algo que te apetezca mucho comer... Así favoreces que formes más saliva.) En el tubo 1, haz la Reacción de Fehling. En el tubo 2, realiza la Reacción de Lugol. Los resultados son los esperados para un polisacárido como el almidónLos tubos 3 y 4 que contienen el almidón, al que le hemos echado la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al baño María, controlando la temperatura del agua para que no hierva, ya que lo que intentamos, es que la enzima de la saliva trabaje a unos 37: C. Dejarlo unos 15 minutos A continuación realizar las siguientes reacciones: En el tubo número 3, realizar la Reacción de Fehling. En el tubo número 4, realizar la Prueba del Lugol. El resultado positivo obtenido en el tubo de ensayo 3, nos dice que no hay ya almidón, porque la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidón transformándolo en glucosa, por eso la reacción de Fehling es ahora positiva. De una manera similar, podemos interpretar el resultado del tubo de ensayo 4, ahora nos da la reacción de polisacáridos negativa, ya que el almidón( polisacárido) se ha hidrolizado. Cuadro general de práctica Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 27
- 3. BIOLOGÍA GENERAL V. TRABAJO 1. Grafique y realice un informe de la práctica 2. Identifique las reacciones y justifique los procedimientos de la práctica Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque MC 28