Complejo Entamoeba
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El documento discute las nuevas estrategias de diagnóstico del Complejo Entamoeba (Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii). Explica que E. dispar y E. moshkovskii son más comunes que E. histolytica y que su identificación ha impactado el entendimiento de la amibiasis. También describe factores de virulencia como proteasas y lectinas que participan en la patogénesis de E. histolytica. Finalmente, propone el desarrollo de una prueba rápida para
Complejo Entamoeba
- 1. Nuevas estrategias de diagnóstico del Complejo Entamoeba (Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii) Juanita Trejos Suárez Bact. Msc. Docente Programa Bacteriología y Laboratorio Clínico Universidad de Santander – UDES- Bucaramanga
- 2. PLAN DE EXPOSICION Introducción Patogénesis Importancia de los factores de virulencia Expectativas en el laboratorio A futuro…
- 3. Amebas 9 especies de amebas viven en el lumen del intestino del ser humano: Entamoeba histolytica Entamoeba dispar Entamoeba moshkovskii Entamoeba hartmanni Entamoeba coli Entamoeba polecki Iodameba butschlii Endolimax nana Dientamoeba fragilis La información antes de 1991 no distinguía entre las especies morfológicamente idénticas: E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii Introducción
- 4. Organización Mundial de la Salud (1997) 10% de los individuos infectados por el complejo Eh/Ed 500 millones sufrirían de amebiasis cada año 80-98% muestran síntomas de disentería (invasión limitada a la mucosa intestinal) causando la muerte de 70.000 personas 2 - 10% de estos casos son mortales. 2-20% amebiasis invasiva (conducen a lesiones extraintestinales) Mayor frecuencia abscesos en el hígado Mapa de distribución mundial de disentería amebiana (2004) Mapa de distribución mundial de disentería amebiana (2004) Introducción
- 5. OMS y OPS sugieren que en el reporte microscópico debe anotarse: “Complejo E. histolytica/E. dispar” Diferenciación de las dos especies por técnicas: Bioquímicas Biología Molecular (PCR y sus variantes) Inmunológicas Pruebas inmunológicas E. histolytica test II;TechLab,Blacksburg,Va Anticuerpo monoclonal para la detección de la lectina Gal/GalNAc Reacciones cruzadas con Entamoeba dispar. Introducción
- 6. Prevalencia Ubicación Complejo Eh/Ed Entamoeba histolytica Referencia Colombia 2da Encuesta Nacional de morbilidad (1977-1980) 12,1% - Botero, D. et al. 1998 Arboleda (Nariño) 29,5% - Sanzón, F. et al. 1999 Quipile (Cundinamarca) Puesto de Salud de la Virgen 16,4% 1,4% Guzmán, C.E. et al. 2001 Instituto Seccional de Salud del Quindío 3,69% - Jiménez. et al. 2000 Armenia (Quindío) Guarderías Infantiles 15% - Giraldo J.M. et al. 2002 Armenia (Quindío) Asentamientos temporales post-terremoto 17,7% 0,6% Gallego, M.L. et al. 2003 Tendencia a sobre-diagnosticar Conduce al uso innecesario e yatrógeno de fármacos amebicidas, medicamentos agresivos que conllevan efectos secundarios Introducción
- 7. Complejo Entamoeba Entamoeba histolytica Entamoeba dispar Entamoeba moshkovskii OMS, 1997 2005
- 8. Entamoeba moshkovskii 1956 Paciente con diarrea de Laredo,Texas Ameba morfológicamente idéntica a E. histolytica, pero era capaz de crecer a T° ambiente. «Cepa Laredo de E. histolytica» 1991 Clark y Diamond Demostraron con estudios moleculares que era una cepa de E. moshkovskii (Tshalaia, 1941)
- 12. «La redescripción de E. dispar y la identificación de E. moshkovskii en humanos han impactado enormemente el conocimiento de E. histolytica y la amibiasis con importantes implicaciones clínicas y epidemiológicas que han conducido a la necesidad de reevaluar la prevalencia y morbilidad de la infección en la población mundial y estudiar la distribución geográfica, prevalencia y modelo de transmisión de las cepas de E. histolytica para detectar aquéllas epidemiológicamente relevantes y predecir el riesgo de la enfermedad amibiana en una población» Leonor Chacín-Bonilla (2010)
- 13. Se cree que las infecciones con E. dispar y E. moshkovskii más que con E. histolytica, pueden explicar, al menos en parte, la baja tasa de enfermedad considerando la alta tasa de infección.
- 14. EPIDEMIOLOGIA Complejo E. histolytica/E. dispar E. moshkovskii
- 15. Población Incidencia Complejo Eh/Ed E. histolytica E. dispar E. moshkovskii Africa (Pacientes con HIV) - 4% 5% 13% Arabia 30% - - Argentina 13,5% - 23.5% - - Australia (Sidney) 21% 4,5 70.8% 61.8% Bangladesh (sintomáticos, área urbana) 15,2% 4,8% 10,4% Bangladesh (asintomáticos, área rural) 17,3% 4,7% 12,6% Bangladesh (Preescolares) 73% - - 21% Brasil 10% - 39.3% - - - Chile 3%-18% - - - Colombia 20,6%-45% - - - Estados Unidos 5 – 8% - - - Filipinas (Norte) 8,26% 0,96% 7,3% - India 10,2% 1.7% 8.8% 2,2% México 75% - - - Turquia - 23% - 2% Venezuela 6,8% - 42% - - -
- 17. Entamoeba histolytica rica en PS Entamoeba dispar pobre en PS In vitro eritrofagocitosis.
- 18. ¿Cómo se diferencian las especies del Complejo?
- 19. Entamoeba histolytica invade y daña tejidos a través de una secuencia de eventos en los que participan múltiples factores relacionados tanto con el parásito como con el hospedero.
- 20. Tres pasos básicos han sido descritos al observar la interacción in vitro de este protozoo con diferentes células diana: Colonización Reducción/Disrupción de la mucosa Citólisis Patogénesis Muchas moléculas están involucradas en estos procesos, incluyendo: Lectinas Péptidos formadores de poros (Amebaporos) Proteasas
- 24. Expectativas en el Laboratorio
- 26. Búsqueda de nuevas alternativas más económicas …
- 27. Producción, caracterización y purificación de anticuerpos monoclonales murinos contra la proteína recombinante Cisteína Proteasa 5 (rEhCP5) de Entamoeba histolytica. Juanita Trejos Suárez, Bact. Msc Jhon Carlos Castaño O. MD., PhD Grupo de Inmunología Molecular – GYMOL Centro de Investigaciones Biomédicas Facultad Ciencias de la Salud Universidad del Quindío
- 28. Cisteína Proteasas de Entamoeba histolytica Proteasas con a.a. de cisteína en su región catalítica. Éstas enzimas proteolíticas son secretadas por la ameba dentro de su microambiente Bruchhaus, et al (2003) 20 tipos diferentes de CP tres genes han presentado altos niveles de expresión para sus respectivas enzimas: EhCP1 (27/35 kDa) * EhCP2 (35 kDa) EhCP5 (29 kDa) * El gen EdCP5 presenta diferencias de hasta un 20% con el gen EhCP5 en su secuencia de nucleótidos
- 29. Inmunofluorescencia Indirecta A y B: Entamoeba histolytica HM-1:IMSS reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-EhCP5r. C: Entamoeba histolytica (Verde) y Entamoeba dispar (rojo). Protozoos presentes en un aislado clínico. D, E, F: Entamoeba dispar SAW760 no reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-EhCP5r. Gen EdCP5 presenta diferencias de hasta un 20% en su secuencia de nucleótidos con el gen EhCP5 Deleciones e inserciones que producen múltiples codones de paro dentro del marco de lectura (Bruchhaus, I., et al, 2003)
- 30. Anticuerpo Monoclonal Murinos Autores Resultados β1-integrina (140 kDa) Sengupta ,K. , et al (2001) Inhibición de la adhesión celular Quistes Walderich, B., et al (1998) Reconocer el estadio de Quiste del Trofozoíto Antígeno de Superficie 150 kDa Tachibana, H., et al (1997) Reconocimiento de E. histolytica de E. dispar. Antígeno total de E. dispar Tachibana, H., et al (1997) Reconocimiento de E. dispar de E. histolytica Cisteína Proteasa de 30 kDa Becker, I., et al (1996) Localización de proteína Antígeno total González-Ruiz, A, et al (1992) Reconocimiento de los aislados clínicos invasivos de los no invasivos
- 31. Anticuerpo Monoclonal Autores Resultados Lectina Gal/GalNac Petri, W. A, et al (1990) Reconocimiento de E. histolytica Antígeno 30,000 Mr Tachibana, H., et al (1990) Identificación de aislados patogénicos Antígeno 96 kDa Torian, B. E., et al (1990) Reconocimiento de E. histolytica de E. dispar. Estos anticuerpos monoclonales contra proteína de E. histolytica o contra E. dispar han sido diseñados específicamente para estudios de morfología y caracterización de enzimas y otras proteínas involucradas en el metabolismo de este protozoo o para el reconocimiento de estos protozoos enfocados en investigación básica.
- 32. A futuro… Prueba rápida para la detección de: E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii, Giardia spp, y Cryptosporidium spp en una sola prueba con la Sensibilidad y Especificidad de una técnica molecular y el costo-beneficio de un ensayo inmunoenzimático.
- 33. ¨Debido a la observación de que E. dispar es más común que E. histolytica, la identificación en aumento de E. moshkovskii en humanos, la asociación de E. dispar y E. moshkovskii con síntomas en algunos estudios y el polimorfismo genético de estas dos especies, es recomendable el diagnóstico y tipeaje simultáneos de estas especies en los estudios clínicos y epidemiológicos de la amibiasis¨.
Notas del editor
- #4: Todas estas especies se consideran microorganismos comensales, exceptuando E. histolytica y Dientamoeba fragilis, el otro parásito intestinal que causa diarrea y dispepsia, pero no invade extraintestinalmente.
- #5: A su vez esta patología sin el tratamiento adecuado da lugar a complicaciones potencialmente fatales (como absceso hepático, absceso cerebral, peritonitis, amebiasis mediastino-pericárdica y amebiasis pleuropulmonar), lo que representa un problema de salud pública.
- #7: La distribución geográfica de ambas especies está todavía incompleta, debido a que la metodología utilizada en la mayoría de los estudios no discriminan a ambas especies, es muy poco lo que se hace principalmente en los laboratorios clínicos de primer y segundo nivel para su diferenciación. Hecho por el cual se aumenta la tendencia a sobre-diagnosticar como amebiasis los síntomas gastrointestinales, sin confirmar su agente causal, problema, que entre otras consecuencias, conduce al uso innecesario e yatrógeno de fármacos amebicidas, medicamentos agresivos que conllevan efectos secundarios.
- #22: Los trofozoítos han desarrollado un proceso de invasión muy elaborado, en el cual secretan y expresan proteínas que les permiten adherirse al epitelio a través de la Lectina Gal/GalNac (McCoy et al 1994), degradar la matriz extracelular a través de la acción de la Cisteina Proteasa (Keene et al 1990) y lisar las células epiteliales para penetrar dentro de la mucosa por medio de los Amebaporos (Leippe, 1997), además, fagocitan activamente bacterias y desechos de las células del hospedero que le sirven de alimento
- #29: Los genes de estas tres enzimas comprenden el 90% de las transcripciones requeridas para iniciar la actividad de las proteasas halladas en este protozoario. EhCP1, EhCP2 y EhCP5 están localizadas dentro de las vacuolas digestivas. El gen EdCP5 presenta diferencias de hasta un 20% con el gen EhCP5 en su secuencia de nucleótidos. Estos cambios incluyen deleciones e inserciones que producen múltiples codones de paro dentro del marco de lectura dañando su funcionalidad. Esto sugiere que la ausencia de patogenicidad de E. dispar se debe a que no se produce la proteína involucrada en este fenotipo. Las diferencias nucleotídicas entre la EhCP5 y la EdCP5 se dieron desde un ancestro común y no se extendió a genes adyacentes El Proyecto del Genoma Entamoeba histolytica reveló que ~ 40 genes codifican para cisteína proteasas, pero sólo una minoría (8 genes) expresan las cisteína proteasas In Vitro. De estos ~ 40 genes, un total de 20 genes diferentes han sido estudiados (EhCP1 – EhCP19, EhCP112),
- #30: Estos resultados son coherentes con la información obtenida por múltiples estudios, donde demuestran que el gen EdCP5 presenta diferencias de hasta un 20% en su secuencia de nucleótidos con el gen EhCP5, incluyendo deleciones e inserciones que producen múltiples codones de paro dentro del marco de lectura, dañando la funcionalidad del gen, presentándose un fenotipo de E. dispar que no puede expresar la proteína, y de ésta manera el AcM contra EhCP5r no encuentra una secuencia homóloga protéica que reconocer y ello explica los resultados negativos obtenidos contra ésta