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Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana
ISSN: 0325-2957
actabioq@fbpba.org.ar
Federación Bioquímica de la Provincia de
Buenos Aires
Argentina
Assum, Débora Magalí; Orozco, Maria Belén; Tantucci, Leonela Ana; Suárez, Héctor
Andrés
Determinación de Levetiracetam en suero humano por cromatografía líquida con
detección de arreglo de diodos
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, vol. 51, núm. 1, 2017, pp. 53-61
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Buenos Aires, Argentina
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Acta Bioquím Clín Latinoam 2017; 51 (1): 53-61
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana
Incorporada al Chemical Abstract Service.
Código bibliográfico: ABCLDL.
ISSN 0325-2957
ISSN 1851-6114 en línea
ISSN 1852-396X (CD-ROM)
Bioquímica Clínica
Determinación de Levetiracetam en suero
humano por cromatografía líquida con
detección de arreglo de diodos
Levetiracetam determination in human serum by liquid
chromatography with diode array detection
Determinação de Levetiracetam em soro humano
por cromatografia líquida com detecção de arranjo
de diodos
`
` Débora Magalí Assum1a, Maria Belén Orozco2a, Leonela Ana Tantucci1a,
Héctor Andrés Suárez3b
1 Bioquímica.
2 Técnica de Laboratorio.
3 Bioquímico. Especialista en Toxicología y
Bioquímica Legal.
a Fundación para el Progreso de la Medicina, 9 de
Julio 941. Córdoba, Argentina.
b Hospital de Niños de la Santísima Trinidad,
Ferroviarios 1250, Córdoba, Argentina.
Resumen
Se desarrolló y validó un nuevo método analítico para determinar Leveti-
racetam (LEV) en suero humano utilizando cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) con detección de arreglo de diodos. El procedimiento
es sencillo, puede ser incluido en la rutina del laboratorio y prestar servicio
tanto en el monitoreo terapéutico como en la urgencia. El método incluye
las siguientes etapas: extracción líquido-líquido con diclorometano y eva-
poración de la fase orgánica, la droga se reconstituye con fase móvil, se
inyecta en el cromatógrafo y se detecta a 205 nm. El tiempo de retención de
LEV es de 5 minutos y no presenta interferentes con respecto a otras drogas
comúnmente prescriptas con Levetiracetam. La curva de trabajo presentó
un rango de linealidad entre 5,2 y 82,9 μg/mL, un límite de detección y
cuantificación de 0,8 μg/mL y 2,7 μg/mL, respectivamente. La recuperación
fue del 99,8%.
Palabras clave: levetiracetam * anticonvulsivante * cromatografía líquida de
alta resolución * método analítico * validación
Abstract
A new analytical method for Levetiracetam (LEV) determination in human
serum was developed and validated by high performance liquid chromatog-
raphy (HPLC) with diode detection. It is a simple methodology that can be
included in the laboratory routine and can be useful in both therapeu-
tic drug monitoring and emergencies. The drug extraction is performed
through a liquid-liquid extraction with methyl chloride. Subsequently, the
organic phase is evaporated, reconstituted with the mobile phase, and in-
jected in the chromatograph to be detected at 205 nm. LEV retention time

54 Assum DM et al.
Introducción
La epilepsia es un desorden crónico, el cual requiere
de largos tratamientos con drogas anticonvulsivantes.
Aproximadamente la mitad de los pacientes falla al ini-
cio del tratamiento o presentan interacción farmacoló-
gica con otros medicamentos que reciben en su terapia
crónica (1). Levetiracetam (LEV) es una nueva droga,
derivada de la pirrolidona (S-enantiómero de α-etil-2-
oxo-1-pirrolidina acetamida) con diferente actividad
anticonvulsivante a la demostrada en las otras drogas
antiepilépticas (2). Actualmente su mecanismo de ac-
ción no es claro; sin embargo, se ha demostrado que
no modula canales de Na+ dependientes de voltaje, ni
canales Ca+ activados por bajo voltaje, activa corrientes
de Cl¯ dependientes de GABA y de glicina inducidas
por moduladores alostéricos (3)(4), y también inhibe
corrientes de K+ de rectificación retardada (5-7). Se co-
noce además que LEV posee un mecanismo de acción
por el cual modula la liberación de neurotransmisores
mediante la unión a la proteína vesicular SV2A en cere-
bro (8). Estudios in vivo e in vitro sugieren que LEV no
altera la neurotransmisión normal y las características
básicas de la célula; se absorbe rápidamente después de
su administración oral y la biodisponibilidad oral abso-
luta es cercana al 100%. Las concentraciones plasmáti-
cas de LEV aumentan proporcionalmente con la dosis
del fármaco, lo que se traduce en una cinética lineal,
también se une débilmente a proteínas plasmáticas, lo
cual reduce el riesgo de interacciones farmacocinéticas
(9)(10). LEV es un fármaco anticonvulsivante potente y
bien tolerado en monoterapia, en poblaciones adultas,
presentando escasa farmacorresistencia principalmente
en pacientes de etiología sintomática debido a epilepsia
vascular cerebral (11). En politerapia se ha demostrado
un amplio espectro terapéutico, especialmente en pa-
cientes mayores de 16 años con crisis parciales, crisis ge-
neralizadas como las mioclónicas, ausencias y crisis in-
ducidas por estímulos luminosos. LEV es sugerido para
el tratamiento en pacientes con diagnósticos de epilep-
sia mioclónica juvenil (12)(13). Sin embargo, se ha re-
portado un paciente epiléptico pediátrico que presentó
una elevación de la fosfatasa alcalina (ALP) en sangre
después de recibir tratamiento con LEV. Los niveles de
ALP retornan a la normalidad después de discontinuar
la terapia, confirmando que LEV puede ser la causa
“probable” de elevación de ALP en suero (14). Si bien
es un fármaco con propiedades farmacocinéticas idea-
les, se recomienda vigilar su concentración en plasma
(rango terapéutico 10 a 40 μg/mL) para optimizar el
tratamiento, especialmente en pacientes con insuficien-
cia renal, ancianos y niños, en los cuales se ve alterada
la vida media de la droga (15). Se puede resumir que el
papel de LEV en el tratamiento de epilepsia presenta el
mejor equilibrio entre seguridad y eficacia (16). Existen
reportes que proponen la determinación de LEV por
HPLC por ser un método preciso, rápido, simple y con-
fiable tanto para la determinación de LEV en fórmulas
farmacéuticas (17)(18), como en suero de pacientes que
reciben tratamiento con la droga (19)(23).
La validación de un método analítico es un pro-
cedimiento fundamental para asegurar que los resul-
tados obtenidos sean confiables. Para demostrarlo
se realizó un plan de validación prospectiva, el que
incluyó: alcance de la validación, diseño experimen-
tal, materiales e insumos, desarrollo de pruebas de
parámetros de validación, evaluación de resultados e
informe de validación.
is 5 min and it does not show interference with respect to other drugs commonly prescribed with
Levetiracetam. The work curve showed linearity between 5.2 and 82.9 μg/mL and a detection and
quantification limit of 0.8 μg/mL and 2.7 μg/mL, respectively, while the recovery was of 99.8%.
Key words: levetiracetam * anticonvulsant * high performance liquid chromatography * ana-
lytical method * validation
Resumo
Foi desenvolvido e validado um novo método analítico para determinar Levetiracetam (LEV) em soro
humano, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção de arranjo de
diodos. O procedimento é simples, pode ser incluído na rotina do laboratório e prestar serviço tanto
na monitorização terapêutica quanto na urgência. O método inclui as seguintes etapas: extração
líquido-líquido com diclorometano, e evaporação da fase orgânica, o fármaco é reconstituído com
fase móvel, é injetado no cromatógrafo e detectado a 205 nm. O tempo de retenção de LEV é de
5 minutos e não apresenta interferentes com relação a outras drogas, comumente prescritas com
Levetiracetam. A curva de trabalho apresentou um intervalo de linearidade entre 5.2 a 82.9 μg/mL,
um limite de detecção e quantificação de 0.8 μg/mL e 2.7 μg/mL respectivamente. A recuperação
foi de 99.8%.
Palavras chave: levetiracetam * anticonvulsivante * cromatografia líquida de alta eficiência * méto-
do analítico * validação

Determinación de Levetiracetam en suero 55
Materiales y Métodos
INSTRUMENTO
Se utilizó un cromatógrafo líquido Agilent Technolo-
gies 1260 Infinity (fabricado en Alemania), con bomba
cuaternaria, inyector automático, compartimiento de
columna controlada y detector con arreglo de diodos.
La separación cromatográfica se realizó en columna
Eclipse XDB-C18,5 μm y 4,6 x 250 mm (Agilent Tech-
nologies). Los datos fueron recolectados mediante el
software ChemStation y analizados a 205 nm del espectro.
REACTIVOS Y SOLUCIONES
El estándar de Levetiracetam puro fue donado por
Temis Lostaló (UIO-0179, Análisis 7742), como están-
dar interno (ISTD) Teofilina con una concentración de
18 μg/mL. Diclorometano (Anedra) 84,93 g/mol, Ace-
tonitrilo calidad HPLC (J.T. Baker), agua bidestilada
(Regondi) y KH2PO4. Se preparó una solución están-
dar de trabajo de levetiracetam de 1,450 μg/mL.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Para el análisis de las muestras se utilizaron sueros de
donantes que no estaban bajo tratamiento farmacológi-
co. Estos sueros se estudiaron agregando concentraciones
conocidas de la solución estándar de LEV, dependiendo
de la etapa a validar. Para la extracción, se partió de 250
μL de suero, a los que se adicionaron 800 μL de dicloro-
metano, ISTD, se agitó durante 5 minutos y se centrifugó
15 minutos a 3.000 rpm. Se extrajo el sobrenadante y se
evaporó hasta sequedad, para luego reconstituirlo con
100 μL de fase móvil.
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
La fase móvil estuvo compuesta por un buffer KH2PO4
(50 mM, pH 6.5) y acetonitrilo (94:6 v/v), con un flujo
isocrático de 0,8 mL/min. Se inyectaron 45 μL del ex-
tracto, temperatura controlada en la columna a 35 ºC, la
señal se obtiene a 205 nm de longitud de onda. El tiempo
de retención del Levetiracetam es alrededor de 5 minu-
tos en las condiciones descriptas anteriormente (Fig. 1).
Se utilizó el software Chem Station para la integración
de los cromatogramas (relación entre las áreas de LEV/
ISTD) y mediante la absorción espectral se confirmó la
pureza de los picos.
Resultados
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
1. Linealidad
La linealidad es la capacidad de un método de análi-
sis, dentro de un rango determinado, de dar resultados
proporcionales a la cantidad de analito presente en una
muestra.
Figura 1. Cromatograma de LEV y su estándar interno.

56 Assum DM et al.
Para determinar el rango de linealidad se procesa-
ron seis niveles por triplicado en matriz proteica, con
distinta concentración de la solución estándar de LEV,
determinando así el rango de medición del método, el
cual fue de 5,2 a 82,9 μg/mL. Del análisis de regresión
(Fig. 2, Tabla I) es posible obtener la curva de calibra-
ción, graficando concentración del estándar (x) v/s
relación droga/ ISTD (y) y determinar así la ecuación
de la recta: Y=0,0223 X+0,011, r²: 0,9997. Se evaluó esta-
dísticamente el procedimiento con la prueba t de Stu-
dent, como un mejor indicador de modelo lineal. Ex-
presando t>t crit (206,5>2,78) lo que permite concluir
que existe correlación lineal significativa con un nivel
de confianza del 95%.
2. PRECISIÓN
La precisión se estableció en términos de repetibili-
dad y reproducibilidad, utilizando la guía CLSI EP5-A2
y expresando el grado de imprecisión en valores de des-
viación estándar (S) y coeficiente de variación (CV%).
Para el ensayo se procesaron 80 muestras a dos con-
centraciones diferentes según nivel de decisión médica
(9,6 y 38,4 μg/mL). Estos se prepararon a partir de la
recolección de sueros libres de la presencia de drogas
y de la solución estándar de LEV (Tabla II)(Tabla III).
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80 100
Relación
Concentración
y = 0,0223x + 0,011
R2
= 0,9997
Figura 2. Curva de linealidad LEV (µg/mL).
Tabla II. Niveles de concentración de LEV utilizados para
determinar precisión.
VERIFICACIÓN DE ENSAYO DE PRECISIÓN
NIVEL 1 9,6 μg/mL NIVEL 2 38,4 μg/mL
DÍA Replicado 1 Replicado 2 Replicado 3 Replicado 4
1 9,46 9,11 39,31 37,78
2 9,55 9,43 35,46 37,23
3 9,87 9,33 39,29 36,56
4 9,35 9,93 39,75 40,25
5 9,89 9,47 35,74 40,34
6 9,69 9,60 37,79 34,19
7 8,71 10,02 39,91 38,93
8 9,59 9,95 38,32 42
9 9,96 9,52 39,18 37,85
10 9,74 9,30 38,64 37,72
11 10,19 9,22 38,67 36,55
12 9,46 9,05 36,85 39,06
13 9,83 9,78 37,99 38,77
14 9,18 9,05 37,51 36,68
15 9,65 9,75 37,91 36,72
16 10,00 9,38 39,97 39,72
17 8,78 10,30 36,61 37,88
18 9,61 10,79 41,1 42,05
19 9,47 9,93 35,49 39,66
20 10,27 9,92 40,97 35,66
Tabla I. Niveles de concentración de LEV v/s relación D/I,
utilizadas en el rango de linealidad del método.
Parámetro LINEALIDAD
Niveles Concentración (μg/mL) Relación D/I
1
5,18
5,18
5,18
0,125
0,123
0,12
2
10,36
10,36
10,36
0,235
0,235
0,246
3
20,72
20,72
20,72
0,5
0,47
0,483
4
41,43
41,43
41,43
0,929
0,916
0,923
5
62,14
62,14
62,14
1,394
1,404
1,412
6
82,86
82,86
82,86
1,852
1,85
1,853

De los valores obtenidos se calcularon los estadís-
ticos para determinar repetibilidad y precisión inter-
media, según Tabla III por cada corrida cromatográ-
fica.
Se obtuvo la precisión intermedia con un CV 4,37 para
9,6 μg/mL y un CV 4,80 para 38,4 μg/mL (Tabla IV).
3. LOD – LOQ
Los límites de detección y de cuantificación se obtu-
vieron a partir de la curva de linealidad. LOD (3Sa/b)
0,797 µg/mL; LOQ (10Sa/b) 2,658 µg/mL, donde Sa
es la desviación estándar de la ordenada al origen.
4. VERACIDAD
Para determinar el rendimiento analítico del méto-
do en el proceso de extracción y la cantidad de analito
existente en la muestra, se realizó un ensayo de recupe-
ración de 5 puntos por triplicado dentro del rango de li-
nealidad del método, mediante el agregado de estándar
de levetiracetam de un 30, 50, 100, 130 y 170% del valor
esperado. Se analizó estadísticamente a través de un en-
sayo t de Student para muestras independientes con un
nivel de confianza p=0,05. Se obtuvo un porcentaje de
recuperación R: 99,8%, (con tob<t exp-0,08<2,145). A
través del gráfico % medido vs. % agregado (Fig. 3), y
obteniendo mediante el análisis de regresión lineal, se
pudo comprobar la pendiente positiva con la inclusión
de la ordenada al origen en cero (ecuación de la recta
y: 0,9935 y+0,6344, r²: 0,9936-IC: 95%, rango ordenada
al origen de -15,24; 16,51 y pendiente de 0,85; 1,14).
5. ESPECIFICIDAD
Para determinar interferencia interna se utilizaron
distintas muestras de suero que presentaban valores
patológicos de distintos analitos endógenos por ejem-
plo sueros hemolizados, con concentraciones de tri-
glicéridos >400 mg/dL, urea >50 mg/dL, bilirrubina
total >1,5 mg/dL, albúmina >5,0 mg/dL, y albúmina
<3,0 mg/dL. A todos estos sueros se les adicionó la so-
lución estándar de LEV, en concentraciones conocidas
y se procesaron por triplicado. Se analizaron en parale-
lo sueros que presentaban valores normales de dichos
analitos con las mismas concentraciones añadidas de
solución estándar de LEV. Los datos fueron analizados
comparando el porcentaje agregado, con respecto al
valor hallado. No se observó diferencia en la recupera-
ción en aquellas muestras que presentaban valores pa-
tológicos de triglicéridos, bilirrubina, urea, y albúmina,
respecto a los sueros normales. Sí se registró diferencia
en las muestras hemolizadas, ya que presentaron una
Tabla III. Cálculos de precisión por día
de procesamiento de LEV utilizados para determinar precisión.
X
–
9,58 9,57 38,34 38,29
9,64 9,72 38,31 38,28
Varianza 0,132 0,095 2,494 4,880
0,209 0,315 3,513 3,783
CV 3,79 3,22 4,12 5,77
4,74 5,77 4,89 5,08
DE 0,363 0,308 1,579 2,209
0,457 0,561 1,874 1,945
MEDIDAS DE RESUMEN GLOBAL
Nivel 9,6 Nivel 38,4
X
–
9,63 38,30
Varianza 0,177 3,386
CV 4,37 4,80
DE 0,420 1,840
Tabla IV. Parámetros de precisión por nivel de concentración.
Verificación de RECUPERACIÓN
y = 0,9935 + 0,6344
R2
= 0,9936
% AGREGADO
%
MEDIDO
180,00
160,00
140,00
120,00
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,00
0 50 100 150 200
Figura 3. Ensayo de recuperación % medido vs. % agregado de Levetiracetam.

58 Assum DM et al.
recuperación menor (14,7% -R: 85,3%), considerando
de esta manera que las muestras hemolizadas pueden
interferir en la medición de este anticonvulsivante.
Para verificar interferencia externa, a una muestra
de suero que contenía LEV, se agregaron distintos están-
dares de otras drogas comúnmente prescriptas como:
Fenobarbital, Ethosuximida, Primidona, Fenitoína, Ox-
carbamazepina y Carbamazepina. En las condiciones
cromatográficas descriptas en este trabajo solo pudieron
observarse la presencia de Fenitoina y Fenobarbital, con
tiempos de retención diferentes a las drogas analizadas
(estándar interno y LEV). No se observaron interferentes
en el desarrollo del método cromatográfico en este aná-
lisis, con las condiciones descriptas previamente (Fig. 4).
6. ROBUSTEZ
Se procesaron 2 niveles de levetiracetam (19,2 μg/mL
y 38,4 μg/mL) por triplicado. A la mitad de las muestras
se las mantuvo en condiciones ideales (sin exposición a
luz uv directa, temperatura de 25 °C y sin exponerlas a
varios ciclos de descongelado y congelado a -70 ºC). Al
resto de las muestras se las expuso a distintas situacio-
nes para comprobar su estabilidad en ciclos de congela-
miento y descongelamiento, exposición a temperaturas
mayores a 37 ºC y exposición a luz UV, cumpliendo tres
periodos de 15 min en condiciones ideales y 15 min
aplicando las variantes a analizar.
Para comprobar si alguna de estas condiciones tenía
influencia significativa sobre el resultado se utilizó el Test
de Youden y Steiner, el cual permite explorar el efecto
de cada una de las variables en un solo experimento y así
aproximarse a la desviación esperada en la variabilidad
de aquellos factores considerados como críticos. De este
modo se puede conocer el efecto de cada variable en el
método analítico. Como criterio de aceptación para la ro-
bustez del método se considera que la diferencia entre los
valores obtenidos bajo distintas situaciones sea superior a
√2 de la desviación estándar de la precisión del método
(S), es decir; < √2. Si se comparan los valores obtenidos
en presencia de los distintos parámetros con S √2 para
el nivel de 19,2 μg/mL y de 38,4 μg/mL en todos los
casos, los resultados fueron < S √2, lo cual refiere que
no existe diferencia significativa frente a las distintas va-
riables analizadas.
7. VERIFICACIÓN ANALÍTICA
Después de implementar el nuevo método, se ve-
rificó su desempeño utilizando la guía EP15-A2 para
verificar precisión y veracidad. Se analizaron dos nive-
les, 19,2 μg/mL y 38,4 μg/mL. Se consideró un error
total aceptable (ETa) del 20%, obteniendo resultados
aceptables (Tabla V)(Tabla VI), mediante los cuales se
logró obtener el sigma del método, el nivel limitante y
el esquema de control de gestión de calidad interno
para incorporarlo en la rutina del laboratorio. Uti-
lizando el nivel limitante (19,2 μg/mL) y mediante
las OPSpecs chart (Fig. 3) se estableció como proce-
dimiento de control de calidad candidato a la regla
1 3,5S, N2 (dos controles por corrida) (Tabla V)(Ta-
bla VI)(Fig. 5).
0 2 4 6 8 10 12 14 min
mAU
300
250
200
150
100
50
0
4
216
DAD1C. Sig=205,4 Ref=off (LEVEQ 2015-05-29 11-46-09/001-1010.D)
Área: 2465,08
Área: 262.997
Área: 310.296
Área: 728.218
4
044
5
083
6
837
Fenobarbital
Levetiracetam
Fenitoína
ISTD
Figura 4. Análisis de interferentes externos.

0 (c) Unidades Eta DEi CVi Sesgo ET Sigma ESc
Nivel de Decisión Médica 1 19,20 µg/mL 20,0 0,442 2,3 2,3 6,9 7,7 6,0
Nivel de Decisión Médica 2 38,40 µg/mL 20,0 0,368 1,0 0,4 2,3 20,4 18,8
Tabla V. Desempeño del método.
Figura 5. Gráfico de Función de Poder.
Tabla VI. Nivel de Decisión del método, nivel limitante.
Nivel limitante
DEi: Desviación estándar intralaboratorio, CVi: Coeficiente de variación intralaboratorio, ET: error total, ESc: error sistemático constante.

60 Assum DM et al.
Discusión y Conclusiones
LEV es un fármaco con propiedades farmacociné-
ticas ideales. Se recomienda vigilar su concentración
en plasma (rango terapéutico 10 a 40 μg/mL) para
optimizar el tratamiento, especialmente en pacientes
con insuficiencia renal, ancianos y niños, en los cuales
se ve alterada la vida media de la droga. Es importan-
te disponer de un método analítico para su determi-
nación en suero, mediante HPLC con detección de
arreglo de diodos, previa extracción líquido – líquido,
fase móvil isocrática compuesta por un buffer KH2PO4
(50 mM, pH 6,5) y acetonitrilo (94:6 v/v), con un flujo
de 0,8 mL/min. Se inyectan 45 μL del extracto, tem-
peratura controlada en la columna a 35 ºC, la señal
se obtiene a 205 nm de longitud de onda. El tiempo
de retención del Levetiracetam es alrededor de 5 mi-
nutos en las condiciones descriptas anteriormente. Se
utilizó teofilina como estándar interno, como control
e indicador de posibles errores al extraer la droga de
la muestra de suero. No se observó interferencia con
las drogas comúnmente prescriptas en la terapia con
LEV. En cuanto a la toma de muestras para la deter-
minación de este anticonvulsivante es suficiente con
300 µL de suero, pero se deben evitar las muestras he-
molizadas debido a las interferencias observadas en el
ensayo de recuperación del mismo.
Se evidenció un buen desempeño metodológico,
poniendo a prueba y demostrando los distintos pa-
rámetros analíticos. Además se implementó la uti-
lización de la guía EP15-A2, la cual evidencia el
comportamiento metodológico en la rutina, apor-
tando el sigma del método, el nivel limitante y el
esquema de reglas de control de gestión de calidad
interno, para incorporarlo al monitoreo de rutina
del laboratorio.
El método desarrollado es un método simple, rápi-
do, preciso, exacto y con sensibilidad aceptable para
la determinación de LEV en suero humano, lo cual
le permite ser implementado en el laboratorio clínico
para el monitoreo terapéutico de pacientes que reciben
tratamiento crónico con LEV, también utilizarlo ante la
sospecha de toxicidad por dicho fármaco para obtener
una respuesta rápida y apropiada para el diagnóstico y
seguimiento del paciente.
CORRESPONDENCIA
Bioq. DÉBORA MAGALÍ ASSUM
Fundación para el Progreso de la Medicina
9 de Julio 941, CÓRDOBA, Argentina.
Referencias bibliográficas
1. Torres-Ferrús M, Toledo M, González-Cuevas M, Seró-
Ballesteros L, Santamarina E, Raspall-Chaure M, et
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Recibido: 9 de marzo de 2016
Aceptado: 3 de mayo de 2016

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