Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze
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Le cellule progenitrici endoteliali (EPCs) sono cellule staminali derivate dal midollo osseo coinvolte nella riparazione dell'endotelio e nell'angiogenesi, e la loro riduzione è associata al diabete mellito e alle sue complicanze vascolari. Nei pazienti diabetici, le EPCs circolanti sono diminuite sia quantitativamente che funzionalmente, in particolare in presenza di complicanze micro e macrovascolari. Sebbene alcuni interventi farmacologici possano ripristinare i livelli di EPCs, non è ancora chiaro se ciò comporti una protezione cardiaca significativa.
![18 G.P. Fadini e A. Avogaro
come conseguenza dell’iperglicemia e delle anomalie meta- come in relazione a fattori di rischio emergenti (quali per
boliche a essa associate, è stato per molto tempo conside- esempio iperomocisteinemia20, infiammazione, insulino-resi-
rato il meccanismo principale di induzione del rischio cardio- stenza21). È stato anche evidenziato come l’aggregazione dei
vascolare nel diabete16. Attualmente si ritiene che alterazioni fattori di rischio che concorrono a definire la sindrome meta-
dei sistemi di riparazione endoteliale possano essere altret- bolica interagiscano in maniera sinergica nel ridurre il livello
tanto importanti nel condizionare la salute vascolare nel dia- delle cellule progenitrici circolanti22. In presenza di molteplici
bete. fattori di rischio, la riduzione delle EPCs correla significativa-
Utilizzando una metodica citofluorimetrica altamente stan- mente in maniera inversa con lo spessore medio-intimale
dardizzata, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che carotideo, confermando ancora una volta il significato della
pazienti affetti da diabete mellito di tipo 2 presentano una riduzione delle EPCs sul rimodellamento vascolare23.
riduzione di circa il 40-50% nel numero delle EPCs circolan- Riduzione e disfunzione delle EPCs sono state individuate
ti17. Questa prima osservazione potrebbe di per sé rappre- anche in pazienti affetti da diabete di tipo 1, in maniera del
sentare un difetto dei processi endogeni di riparazione che tutto simile a quanto osservato per il diabete di tipo 224. Tale
predispone al danno vascolare. È interessante notare come osservazione assume particolare rilevanza se si considera
la riduzione delle EPCs sia più marcata nei pazienti diabetici che soggetti giovani affetti da diabete di tipo 1, anche in
con complicanze vascolari quali l’arteriopatia obliterante assenza di microangiopatia, mostrano già una significativa
degli arti inferiori o la cerebrovasculopatia. Si osserva infatti deplezione di cellule progenitrici rispetto ai controlli di pari età
una correlazione positiva tra EPCs e ABI (ankle brachial e sesso25. Quindi, ancora una volta, la precocità delle altera-
index, indice caviglia braccio), mentre i più bassi livelli di zioni delle EPCs suggerisce un possibile coinvolgimento di
EPCs circolanti si rilevano nei pazienti con ulcere ischemiche queste cellule nella fisiopatologia della malattia e, soprattut-
dei piedi. In uno studio successivo è stato possibile eviden- to, delle sue complicanze.
ziare che le alterazioni a carico delle EPCs non sono sola- Nella letteratura di questo settore sono descritte alterazioni
mente quantitative, ma anche qualitative. Per esempio, le quali- e quantitative delle EPCs in quasi tutte le complicanze
EPCs isolate da pazienti diabetici con vasculopatia mostra- del diabete. Oltre alle già menzionate relazioni tra EPCs e
vano una ridotta adesione all’endotelio maturo e una ridotta vasculopatia diabetica, è stato dimostrato che lo sviluppo
proliferazione in vitro rispetto alle EPCs isolate da pazienti della retinopatia diabetica si caratterizza per la comparsa di
diabetici privi di complicanze vascolari18. Pertanto, appare alcune alterazioni peculiari delle cellule progenitrici circolanti.
come le alterazioni delle EPCs rispecchino in un certo senso Se, da un lato, le anomalie precoci della retinopatia diabeti-
la gravità e la progressione delle complicanze vascolari della ca sono simili alle alterazioni microcircolatorie periferiche
malattia diabetica. È stato anche possibile evidenziare che il (danno endoteliale e sviluppo di ghost capillaries), nelle fasi
livello delle cellule progenitrici circolanti CD34+ (precursori avanzate di questa complicanza può prevalere la formazione
indifferenziati delle EPCs) è ridotto molto precocemente nella di neovasi e quindi una condizione proliferativa. È interessan-
storia naturale del diabete di tipo 2, in quanto può essere evi- te come queste fasi si rispecchino in diverse alterazioni delle
denziato anche in soggetti prediabetici, con IGT (impaired EPCs: nelle fasi iniziali il livello circolante delle EPCs può
glucose tolerance) e/o IFG (impaired fasting glycaemia)19. essere normale o ridotto26, mentre nelle fasi avanzate con
Recentemente, il nostro gruppo di ricerca ha eseguito una proliferazione vascolare si osserva un patologico incremento
rivalutazione sistematica di tutti i casi in cui era stato possi- delle EPCs27, soprattutto quando valutate mediante un sag-
bile determinare contemporaneamente il livello delle cellule gio clonogenico in vitro28.
progenitrici circolanti CD34+ e il grado di tolleranza ai carboi- Tra le complicanze microangiopatiche, anche la nefropatia
drati. In tale studio trasversale 425 pazienti erano stati sud- diabetica è stata associata ad alterazioni significative delle
divisi in 7 categorie (NGT [normal glucose tolerance], IFG, EPCs. In generale, l’insufficienza renale cronica crea uno sbi-
IGT, DM di nuova diagnosi, DM di 0-9 anni di durata, DM di lanciamento tra fattori che promuovono il danno endoteliale
10-19 anni di durata e DM di > 20 anni di durata) a mimare e fattori di riparazione, con aumento dei frammenti di cellule
la storia naturale del diabete di tipo 2. È stato interessante endoteliali in circolo e riduzione del livello delle EPCs29. Tale
notare come il più basso livello delle cellule progenitrici circo- scenario rappresenta probabilmente uno dei meccanismi
lanti si osservasse al momento della diagnosi di diabete di con cui l’uremia aumenta marcatamente il rischio di eventi
tipo 2, mentre un certo grado di recupero si osservava nei 10 cardiovascolari30. Più specificamente, nel contesto della
anni successivi, un altro tardivo nadir era presente in pazien- nefropatia diabetica, è stato riportato come il livello di cellule
ti con diabete da almeno 20 anni. Anche se con i limiti dello progenitrici circolanti CD34+ sia significativamente ridotto in
studio trasversale, questo studio suggerisce un precoce e pazienti con diabete mellito di tipo 2 e microalbuminuria,
grave, ma reversibile, difetto di cellule progenitrici circolanti, rispetto ai pazienti non microalbuminurici. Inoltre, gli stessi
indicando la necessità di un intervento quanto più possibile autori hanno evidenziato che il livello basale delle cellule
tempestivo per ripristinare la capacità rigenerativa endogena. CD34+ predice il peggioramento della microalbuminuria nel
Tuttavia, è opportuno sottolineare che le alterazioni delle corso del tempo31. Tuttavia, la presenza di microalbuminuria
EPCs non sono specifiche per la malattia diabetica, in quan- nel diabete di tipo 2 non è necessariamente da considerare
to possono essere rilevate anche in presenza di altri classici espressione di nefropatia incipiente e non ha sempre un
fattori di rischio per malattia cardiovascolare (quali iperten- andamento progressivo. In ogni caso, dati ottenuti in pazien-
sione arteriosa, obesità, dislipidemia, fumo di sigaretta), così ti con diabete di tipo 1 confermano che la presenza di](https://image.slidesharecdn.com/lecelluleprogenitriciendotelialineldiabetemellitoesuecomplicanze-110502043423-phpapp02/85/Le-cellule-progenitrici-endoteliali-nel-diabete-mellito-e-sue-complicanze-3-320.jpg)
Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze
- 1. G It Diabetol Metab 2011;31:16-23 Rassegna Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze RIASSUNTO Le cellule progenitrici endoteliali (EPCs, endothelial progenitor cells) sono cellule staminali di origine midollare coinvolte nella ripa- G.P. Fadini, A. Avogaro razione dell’endotelio e nei processi di angiogenesi. Alterazioni Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università quali-/quantitative delle EPCs si associano ai classici fattori di degli Studi di Padova, Padova rischio cardiovascolare e a malattia aterosclerotica prevalente. In pazienti con diabete mellito di tipo 1 e di tipo 2 si osserva una ridu- Corrispondenza: dott. Gian Paolo Fadini, Dipartimento zione delle EPCs circolanti e diverse alterazioni funzionali di que- di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di ste cellule rispetto ai soggetti non diabetici. In presenza di compli- Padova, Policlinico Universitario, via Giustiniani 2, canze diabetiche micro- e macroangiopatiche, il livello delle EPCs 35100 Padova si riduce ulteriormente in parallelo alla gravità di tali alterazioni. Le cause della riduzione delle EPCs nel diabete non sono del tutto G It Diabetol Metab 2011;31:16-23 note, ma si ipotizza che alterazioni della mobilizzazione midollare giochino un ruolo prevalente. Il basso livello di EPCs circolanti ha Pervenuto in Redazione il 26-11-2010 un significato prognostico nei confronti della malattia cardiovasco- Accettato per la pubblicazione il 02-02-2011 lare incidente in diverse tipologie di pazienti. Alcuni interventi far- macologici sono in grado di ripristinare il livello delle EPCs nel dia- Parole chiave: cellule staminali, rigenerazione, bete, ma non è ancora chiaro se tale effetto si traduca in una pro- patogenesi tezione dagli eventi cardiovascolari. Key words: stem cells, regeneration, pathogenesis SUMMARY Endothelial progenitor cells in diabetes mellitus and its complica- tions Endothelial progenitor cells (EPCs) are bone marrow-derived stem cells involved in endothelial repair and neo-angiogenesis. Quantitative and qualitative EPC alterations associate with classi- cal cardiovascular risk factors as well as with established athero- sclerotic diseases. Type 1 and type 2 diabetic patients show reduction and dysfunction of circulating EPCs, when compared to non diabetic subjects. In the presence of micro- and macrovascu- lar diabetic complications, EPC levels are further reduced in par- allel with disease severity. The causes of low EPCs in diabetes are not entirely clear, but defects in bone marrow mobilization processes appear to be predominantly involved. Low EPCs levels predict incident cardiovascular events in different cohorts of patients. Some pharmacological interventions are able to restore circulating EPCs levels, but it remains to be established whether or not this translates into cardiovascular protection.
- 2. Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze 17 Introduzione factor 1), migrano selettivamente presso le sedi di danno endoteliale, aderiscono alla soluzione di continuo formando Le cellule progenitrici endoteliali (EPCs, endothelial progeni- una specie di toppa e quindi differenziando in cellule endote- tor cells) sono state identificate nel 1997 come un sottogrup- liali funzionalmente mature6. Questi fenomeni sono stati po di cellule mononucleate del sangue periferico in grado di dimostrati estesamente negli animali da laboratorio (conigli e differenziarsi in cellule endoteliali mature e di contribuire alla roditori) ed esistono anche dati preliminari nell’uomo7. formazione di nuovi vasi sanguigni1. Si ipotizza che la mag- L’ischemia tessutale rappresenta uno degli stimoli più poten- giore sorgente di EPCs sia rappresentata dal midollo osseo ti alla mobilizzazione delle EPCs dal midollo osseo al circolo emopoietico. Così come durante la vita embrionale, proba- periferico, grazie al rilascio di fattori di crescita (per es. VEGF, bilmente anche nell’organismo adulto, tanto nei roditori vascular endothelial growth factor), citochine (per es. IL-8) e quanto nell’uomo, le cellule staminali ematopoietiche e le chemochine (per es. SDF-1) indotto dalla bassa tensione di EPCs riconoscono un precursore comune, chiamato eman- ossigeno via HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1)8,9. Queste gioblasto. In passato si riteneva che la neovasculogenesi, molecole, agendo nel microambiente midollare, allentano le cioè la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da un tes- interazioni tra cellule progenitrici e cellule stromali (grazie suto avascolare, fosse limitata alle fasi di sviluppo dell’appa- all’azione della MMP9, matrix metalloproteinase 9) e favori- rato cardiovascolare a opera del mesoderma extraembriona- scono quindi il rilascio in circolo di EPCs10. Una volta nel tor- rio del sacco vitellino. Attualmente si ritiene che questo pro- rente circolatorio, le EPCs migrano selettivamente presso le cesso possa avvenire anche nell’organismo adulto, per sedi di ischemia seguendo i gradienti creati dalle chemochi- opera delle EPCs che, migrate dal midollo osseo ai tessuti ne (quali SDF-1) tramite l’espressione di superficie di recet- periferici, partecipano alla genesi di neovasi. Sono state tori specifici (per es. CXCR4, C-X-C chemokine receptor 4). anche identificate altre potenziali sorgenti di EPCs negli All’interno dei tessuti ischemici le EPCs partecipano alla organi parenchimatosi (per es. il rene)2 e, soprattutto, dalla gemmazione di nuovi vasi a partire dalle arteriole precapillari parete degli stessi vasi sanguigni, sia arterie di grosso calibro preesistenti e contribuiscono anche alla formazione di nidi (per es. l’aorta)3 sia vene (per es. la safena)4. Mentre fino agli vascolari nei tessuti connettivali di neosintesi, che poi matu- anni ’90 la ricerca cardiovascolare si è focalizzata soprattut- rano in strutture tubulari e quindi in vasi sanguigni che si met- to sui meccanismi di danno vascolare, la scoperta delle tono in comunicazione con la circolazione11. L’esatto ruolo EPCs ha aperto un nuovo filone di studio basato sull’analisi quantitativo svolto dalle EPCs nei processi di neoangiogene- dei meccanismi di riparazione vascolare. si non è ancora chiarito. Alcuni lavori metodologici hanno Le EPCs infatti svolgono due ruoli fondamentali nella fisiolo- riportato che il contributo di cellule midollari alla genesi dei gia e fisiopatologia dell’apparato cardiovascolare: il manteni- neovasi è piuttosto basso, mentre altri dati supportano un mento dell’omeostasi endoteliale e la neoangiogenesi. ruolo predominante delle cellule progenitrici, a seconda del L’endotelio è un organo anatomicamente e funzionalmente modello sperimentale utilizzato12. Il nostro gruppo di ricerca cruciale per la salute cardiovascolare. Esso fornisce una bar- ha dimostrato che le EPCs possono esistere in uno stadio riera fisica alle cellule ematiche e al plasma e regola il tono quiescente in sede perivascolare, da cui possono essere vascolare, l’aggregazione piastrinica e l’adesione leucocita- reclutate in presenza di ischemia e integrarsi all’interno dei ria. Le cellule endoteliali mature vanno incontro a un turnover neovasi13. molto lento, ma sono in grado, entro un certo limite, di rin- Alla luce di queste due fondamentali funzioni delle EPCs nella novarsi. L’endotelio, per la sua tipica localizzazione anatomi- regolazione vascolare, appare evidente come un difetto di ca, è esposto a numerose noxae patogene veicolate dal EPCs, sia esso quantitativo o qualitativo, possa influenzare sangue (per es. prodotti di ossidazione, acidi grassi, gluco- negativamente la biologia e la funzione cardiovascolare. sio, colesterolo ecc.) ed è quindi bersaglio dei tipici fattori di I metodi di analisi delle EPCs richiedono l’applicazione di rischio cardiovascolare, che agiscono tramite i noti meccani- sofisticati protocolli di enumerazione citofluorimetrica e/o di smi molecolari alterandone la funzione. La disfunzione endo- coltura cellulare. Per una rassegna della letteratura e un’ana- teliale si manifesta come aumento del tono vascolare, del- lisi critica dei metodi si veda Fadini e coll. 200814. Esistono l’aggregabilità piastrinica e dell’adesività leucocitaria, tutti numerosi aspetti controversi nella definizione e metodologia eventi che possono favorire la comparsa e progressione di studio delle EPCs12, tanto che l’utilizzo di metodi differen- delle lesioni aterosclerotiche5. Le cellule endoteliali danneg- ti può anche condurre a risultati opposti15. Nella presente giate possono andare incontro ad apoptosi, distaccandosi dalla parete vascolare e lasciando un’area di denudamento rassegna gli aspetti più tecnici sono stati lasciati in secondo che costituisce una superficie altamente adesiva e tromboti- piano per far emergere una visione d’insieme della fisiopato- ca. Le cellule endoteliali mature ai margini di tale lesione, per logia di queste cellule nel contesto del diabete. la perdita dell’inibizione da contatto, possono rientrare nel ciclo cellulare, proliferare e migrare verso il centro della lesio- ne per colmare la soluzione di continuo. Tuttavia questo pro- Le EPCs nel diabete mellito cesso è lento e inefficiente. Fisiologicamente, il ripristino ana- tomico e funzionale dell’endotelio avviene anche con il con- Il diabete mellito rappresenta una condizione clinica caratte- tributo delle EPCs circolanti che, grazie a determinati segnali rizzata da un aumento di 2-4 volte del rischio di malattia car- solubili (per es. chemochine quali SDF-1, stromal cell-derived diovascolare. Un eccessivo danno a carico dell’endotelio,
- 3. 18 G.P. Fadini e A. Avogaro come conseguenza dell’iperglicemia e delle anomalie meta- come in relazione a fattori di rischio emergenti (quali per boliche a essa associate, è stato per molto tempo conside- esempio iperomocisteinemia20, infiammazione, insulino-resi- rato il meccanismo principale di induzione del rischio cardio- stenza21). È stato anche evidenziato come l’aggregazione dei vascolare nel diabete16. Attualmente si ritiene che alterazioni fattori di rischio che concorrono a definire la sindrome meta- dei sistemi di riparazione endoteliale possano essere altret- bolica interagiscano in maniera sinergica nel ridurre il livello tanto importanti nel condizionare la salute vascolare nel dia- delle cellule progenitrici circolanti22. In presenza di molteplici bete. fattori di rischio, la riduzione delle EPCs correla significativa- Utilizzando una metodica citofluorimetrica altamente stan- mente in maniera inversa con lo spessore medio-intimale dardizzata, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che carotideo, confermando ancora una volta il significato della pazienti affetti da diabete mellito di tipo 2 presentano una riduzione delle EPCs sul rimodellamento vascolare23. riduzione di circa il 40-50% nel numero delle EPCs circolan- Riduzione e disfunzione delle EPCs sono state individuate ti17. Questa prima osservazione potrebbe di per sé rappre- anche in pazienti affetti da diabete di tipo 1, in maniera del sentare un difetto dei processi endogeni di riparazione che tutto simile a quanto osservato per il diabete di tipo 224. Tale predispone al danno vascolare. È interessante notare come osservazione assume particolare rilevanza se si considera la riduzione delle EPCs sia più marcata nei pazienti diabetici che soggetti giovani affetti da diabete di tipo 1, anche in con complicanze vascolari quali l’arteriopatia obliterante assenza di microangiopatia, mostrano già una significativa degli arti inferiori o la cerebrovasculopatia. Si osserva infatti deplezione di cellule progenitrici rispetto ai controlli di pari età una correlazione positiva tra EPCs e ABI (ankle brachial e sesso25. Quindi, ancora una volta, la precocità delle altera- index, indice caviglia braccio), mentre i più bassi livelli di zioni delle EPCs suggerisce un possibile coinvolgimento di EPCs circolanti si rilevano nei pazienti con ulcere ischemiche queste cellule nella fisiopatologia della malattia e, soprattut- dei piedi. In uno studio successivo è stato possibile eviden- to, delle sue complicanze. ziare che le alterazioni a carico delle EPCs non sono sola- Nella letteratura di questo settore sono descritte alterazioni mente quantitative, ma anche qualitative. Per esempio, le quali- e quantitative delle EPCs in quasi tutte le complicanze EPCs isolate da pazienti diabetici con vasculopatia mostra- del diabete. Oltre alle già menzionate relazioni tra EPCs e vano una ridotta adesione all’endotelio maturo e una ridotta vasculopatia diabetica, è stato dimostrato che lo sviluppo proliferazione in vitro rispetto alle EPCs isolate da pazienti della retinopatia diabetica si caratterizza per la comparsa di diabetici privi di complicanze vascolari18. Pertanto, appare alcune alterazioni peculiari delle cellule progenitrici circolanti. come le alterazioni delle EPCs rispecchino in un certo senso Se, da un lato, le anomalie precoci della retinopatia diabeti- la gravità e la progressione delle complicanze vascolari della ca sono simili alle alterazioni microcircolatorie periferiche malattia diabetica. È stato anche possibile evidenziare che il (danno endoteliale e sviluppo di ghost capillaries), nelle fasi livello delle cellule progenitrici circolanti CD34+ (precursori avanzate di questa complicanza può prevalere la formazione indifferenziati delle EPCs) è ridotto molto precocemente nella di neovasi e quindi una condizione proliferativa. È interessan- storia naturale del diabete di tipo 2, in quanto può essere evi- te come queste fasi si rispecchino in diverse alterazioni delle denziato anche in soggetti prediabetici, con IGT (impaired EPCs: nelle fasi iniziali il livello circolante delle EPCs può glucose tolerance) e/o IFG (impaired fasting glycaemia)19. essere normale o ridotto26, mentre nelle fasi avanzate con Recentemente, il nostro gruppo di ricerca ha eseguito una proliferazione vascolare si osserva un patologico incremento rivalutazione sistematica di tutti i casi in cui era stato possi- delle EPCs27, soprattutto quando valutate mediante un sag- bile determinare contemporaneamente il livello delle cellule gio clonogenico in vitro28. progenitrici circolanti CD34+ e il grado di tolleranza ai carboi- Tra le complicanze microangiopatiche, anche la nefropatia drati. In tale studio trasversale 425 pazienti erano stati sud- diabetica è stata associata ad alterazioni significative delle divisi in 7 categorie (NGT [normal glucose tolerance], IFG, EPCs. In generale, l’insufficienza renale cronica crea uno sbi- IGT, DM di nuova diagnosi, DM di 0-9 anni di durata, DM di lanciamento tra fattori che promuovono il danno endoteliale 10-19 anni di durata e DM di > 20 anni di durata) a mimare e fattori di riparazione, con aumento dei frammenti di cellule la storia naturale del diabete di tipo 2. È stato interessante endoteliali in circolo e riduzione del livello delle EPCs29. Tale notare come il più basso livello delle cellule progenitrici circo- scenario rappresenta probabilmente uno dei meccanismi lanti si osservasse al momento della diagnosi di diabete di con cui l’uremia aumenta marcatamente il rischio di eventi tipo 2, mentre un certo grado di recupero si osservava nei 10 cardiovascolari30. Più specificamente, nel contesto della anni successivi, un altro tardivo nadir era presente in pazien- nefropatia diabetica, è stato riportato come il livello di cellule ti con diabete da almeno 20 anni. Anche se con i limiti dello progenitrici circolanti CD34+ sia significativamente ridotto in studio trasversale, questo studio suggerisce un precoce e pazienti con diabete mellito di tipo 2 e microalbuminuria, grave, ma reversibile, difetto di cellule progenitrici circolanti, rispetto ai pazienti non microalbuminurici. Inoltre, gli stessi indicando la necessità di un intervento quanto più possibile autori hanno evidenziato che il livello basale delle cellule tempestivo per ripristinare la capacità rigenerativa endogena. CD34+ predice il peggioramento della microalbuminuria nel Tuttavia, è opportuno sottolineare che le alterazioni delle corso del tempo31. Tuttavia, la presenza di microalbuminuria EPCs non sono specifiche per la malattia diabetica, in quan- nel diabete di tipo 2 non è necessariamente da considerare to possono essere rilevate anche in presenza di altri classici espressione di nefropatia incipiente e non ha sempre un fattori di rischio per malattia cardiovascolare (quali iperten- andamento progressivo. In ogni caso, dati ottenuti in pazien- sione arteriosa, obesità, dislipidemia, fumo di sigaretta), così ti con diabete di tipo 1 confermano che la presenza di
- 4. Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze 19 microalbuminuria si associa a una riduzione e disfunzione morte cardiaca, infarto miocardico, angina instabile e neces- delle EPCs in vitro32. Il nesso fisiopatologico tra alterazioni sità di rivascolarizzazione. In un gruppo di 216 pazienti affet- delle EPCs e segni di iniziale glomerulopatia è confermato ti da insufficienza renale cronica o in trattamento dialitico anche da studi nell’animale che mostrano come cellule pro- (49% diabetici), Maruyama e coll. hanno dimostrato come un genitrici di origine midollare contribuiscano al ripopolamento basso livello di cellule progenitrici circolanti CD34+ si asso- dell’endotelio glomerulare e come le lesioni glomerulari tipi- ciasse a un elevato tasso di eventi cardiovascolari incidenti che del diabete siano, in certa misura e nelle fasi iniziali, ana- (fatali e non fatali, inclusi eventi di rivascolarizzazione e dia- tomicamente reversibili33. gnosi di vasculopatia periferica) e anche a un aumento signi- Molti meno dati esistono a supporto di una relazione clinica ficativo della mortalità per tutte le cause (che oltre alle cause tra EPCs e neuropatia diabetica, sia essa autonomica o cardiovascolari comprendeva soprattutto eventi infettivi) nei somatica. Queste complicanze riconoscono una patogenesi 23 mesi successivi38. In questo contesto è interessante nota- in parte microangiopatica e pertanto è possibile che la ridu- re come non il fenotipo specifico delle EPCs (CD34+KDR+), zione delle EPCs predisponga allo sviluppo della neuropatia ma quello più generico delle cellule progenitrici circolanti diabetica. Gli studi clinici sono tuttavia complicati dal fatto (CD34+) acquisti un significato prognostico. Ciò è concorde che, nella maggior parte dei casi, i pazienti diabetici di tipo 1 con l’osservazione, da parte del nostro gruppo di ricerca, o di tipo 2 presentano pattern di complicanze piuttosto com- che in una coorte di 214 pazienti (un terzo dei quali diabeti- plessi, confondendo le possibili associazioni statistiche. Dati ci) il livello delle cellule CD34+ risulta più strettamente asso- sperimentali ottenuti negli animali da esperimento suggeri- ciato alla malattia cardiovascolare prevalente rispetto alle scono che le EPCs possano essere coinvolte nella riparazio- EPCs (CD34+KDR+) e ad altri fenotipi di cellule progenitrici. ne/rigenerazione dei vasa nervorum e quindi confermano il In uno studio di follow-up di 34 mesi, un basso livello di cel- possibile link tra riduzione delle EPCs e sviluppo di neuropa- lule CD34+ risultava significativamente associato a un’eleva- tia diabetica34,35. ta incidenza di eventi cardiovascolari, ospedalizzazione per tutte le cause e morte per tutte le cause. In questo studio appariva di particolare interesse il fatto che il basso livello di Ruolo predittivo delle EPCs nei confronti cellule CD34+ amplificava in maniera sinergica il rischio associato alla presenza di sindrome metabolica. L’interesse della malattia cardiovascolare nell’utilizzo del fenotipo semplificato CD34+ come marker prognostico consta nel minore costo dell’analisi e nelle pos- È stato dimostrato che la riduzione delle EPCs assume un sibilità di eseguire il test nella maggior parte dei laboratori significato prognostico in relazione allo sviluppo di futuri attrezzati per citofluorimetria di routine. In un’estensiva rea- eventi cardiovascolari. Tale dato longitudinale è stato eviden- nalisi di questi 4 studi longitudinali è stato possibile confer- ziato per pazienti con malattia cardiovascolare36, sindrome mare il significato prognostico sfavorevole delle basse cellu- metabolica37 o nefropatia38 e si conferma in una recente le progenitrici circolanti, indipendentemente dal fenotipo uti- metanalisi di questi studi di coorte39. Nel lavoro di Werner e lizzato (CD34+ o CD34+KDR+), così come la possibilità di coll., publicato su New England Journal of Medicine nel confrontare dati ottenuti in diversi contesti clinici e laborato- 2005, sono stati arruolati 519 pazienti al momento dell’ese- ristici. Al momento non esistono studi longitudinali condotti cuzione di una coronarografia diagnostica, i quali sono stati specificamente nella popolazione diabetica. Tuttavia, la seguiti per 12 mesi per raccogliere gli eventi cardiovascolari determinazione delle EPCs circolanti assume un significato, incidenti36. Circa il 30% dei pazienti risultava affetto da dia- oltre che fisiopatologico, anche clinico. Infatti, l’aggiunta bete mellito. La presenza di un livello di EPCs (CD34+KDR+) della conta delle cellule progenitrici circolanti a un algoritmo nel terzile inferiore della distribuzione standardizzata risultava associata a un aumento del 52% dell’incidenza di un primo per la determinazione del rischio cardiovascolare, potrebbe evento cardiovascolare maggiore rispetto alla presenza di un essere in grado di migliorare la stratificazione del rischio e livello di EPCs nel terzile superiore. Questo primo studio, identificare un maggior numero di pazienti da sottoporre a condotto su una popolazione “cardiologica” altamente sele- prevenzione primaria o secondaria39. zionata, dimostrava per la prima volta il significato prognosti- co negativo del basso livello di EPCs circolanti. In un sotto- gruppo di pazienti, anche il numero delle colonie di EPCs in Meccanismi fisiopatologici coltura (CFU-EC) risultava predittivo di futuri eventi cardiova- scolari. Nel quasi contemporaneo studio di Schmidt-Lucke e I meccanismi che possono teoricamente determinare una coll., di numerosità campionaria inferiore (n = 120), sono stati riduzione delle EPCs circolanti nei pazienti con diabete inclu- inclusi 43 controlli, 44 pazienti con malattia coronarica stabi- dono: le e 33 pazienti con eventi coronarici acuti40. Il 14% di que- 1) riduzione della mobilizzazione dal midollo alla periferia; sta coorte di pazienti risultava affetto da diabete mellito. 2) aumento dell’apoptosi delle cellule in circolo; Anche in questo contesto si rilevava come un livello di EPCs 3) consumo delle cellule presso tessuti sede di danno inferiore a un valore soglia determinato mediante la curva vascolare. ROC era significativamente associato a eventi avversi sug- Discutendo brevemente questi meccanismi in ordine inverso, gestivi di progressione della malattia aterosclerotica, tra cui il fenomeno del consumo, come causa di un basso livello di
- 5. 20 G.P. Fadini e A. Avogaro EPC circolanti, non è supportato dai dati sperimentali. umano, hanno dimostrato che esiste, a livello midollare, una Utilizzando un modello di topo chimerico con midollo marca- specifica forma di neuropatia autonomica, caratterizzata da to GFP (green fluorescent protein), abbiamo dimostrato che depauperamento delle fibre nervose ortosimpatiche. Dal il reclutamento delle EPCs a livello delle ulcere cutanee è momento che l’innervazione simpatica del midollo osseo è ridotto nei topi diabetici rispetto ai controlli41. Pertanto, pur in di fondamentale importanza per la regolazione dell’immis- presenza di un alterato sviluppo del tessuto di granulazione sione in circolo di cellule ematiche, anche questa alterazio- e di un danno vascolare maggiore, i topi diabetici non ne potrebbe contribuire al difetto di EPCs nel diabete. mostrano un eccessivo consumo di EPCs. Una ridotta Nell’uomo, la scarsa disponibilità di materiale per lo studio sopravvivenza di EPCs ottenute dal sangue di pazienti dia- del midollo osseo rende difficile confermare i dati ottenuti betici è stata precedentemente dimostrata in vitro. Sono stati nell’animale da esperimento. Il nostro gruppo di ricerca ha proposti diversi meccanismi molecolari, tra cui un aumento comunque dimostrato che il diabete di tipo 2 si associa a dello stress ossidativo42 e una iperattività della proteina MAP una deplezione di cellule progenitrici CD34+ tanto nel midol- chinasi p3843. Tuttavia, è opportuno sottolineare che queste lo quanto nel circolo periferico e che i livelli di queste cellu- osservazioni non sono state confermate in vivo, cioè non esi- le nei due compartimenti sono linearmente correlati44. ste a oggi evidenza che le EPCs diabetiche abbiano una Questi dati preliminari nell’uomo confermano la possibile ridotta sopravvivenza in circolo. Nostri dati indicano che l’a- esistenza di un primitivo difetto midollare nel diabete mellito poptosi delle cellule progenitrici CD34+ circolanti non è signi- e pongono quindi il midollo osseo al centro di un modello ficativamente aumentata nel diabete, a dispetto di un basso fisiopatologico per lo sviluppo di altre complicanze della livello totale di cellule progenitrici circolanti44. Pertanto appa- malattia. re improbabile che un aumento della morte per apoptosi spieghi il basso livello di EPCs nel diabete. Appare molto più consistente l’ipotesi che la riduzione delle EPCs circolanti nel diabete sia attribuibile a un difetto di Target terapeutici mobilizzazione dal midollo osseo. In ratti diabetici sottoposti Le alterazioni qualitative e quantitative delle EPCs sono a ischemia/riperfusione del muscolo scheletrico abbiamo in suscettibili di interventi farmacologici. È stato dimostrato da passato dimostrato che la mobilizzazione postischemica diversi gruppi di ricerca che molti farmaci comunemente uti- delle EPCs è inibita rispetto ai ratti non diabetici di control- lo45. Tale blocco della mobilizzazione si associa a un’incapa- lizzati nei pazienti diabetici, e dotati di cosiddetti effetti pleio- cità del tessuto ischemico di attivare i sistemi sensibili all’i- tropici cardiovascolari, sono in grado di modulare favorevol- possia/ischemia (quali HIF-1) e rilasciare fattori di crescita mente livello e/o funzione delle EPCs. Tra questi si annove- (VEGF) e chemochine (SDF-1) che inducono il rilascio delle rano le statine49, gli ACE-inibitori50 e i bloccanti recettoriali EPCs a livello midollare. Come risultato del blocco della At-II51. Per quanto riguarda i farmaci antidiabetici, è stato evi- mobilizzazione, l’angiogenesi postischemica nei muscoli denziato che, in vitro e in vivo, i glitazonici stimolano le EPCs degli animali diabetici risultava compromessa rispetto ai non attraverso effetti trascrizionali PPAR-γ dipendenti52. diabetici. Successivamente è stato dimostrato che l’alterata Dal momento che alterazioni significative delle EPCs sono regolazione di HIF-1 nel diabete dipende dalla glicazione state individuate nel diabete sia di tipo 1 sia di tipo 2 è vero- non enzimatica del cofattore di HIF-1, chiamato ARNT-1 simile che l’iperglicemia, come minimo comune denominato- (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator)46. Pertanto, re delle due condizioni, rappresenti il target più logico per appare come il difetto mobilizzativo dipenda, almeno in terapie volte al ripristino delle EPCs. È stato dimostrato che parte, da un’alterazione dei sistemi di risposta all’ischemia il ricompenso metabolico mediante terapia insulinica è in nei tessuti bersaglio. Tuttavia, il difetto non sembra essere grado di riportare il valore delle EPCs verso la norma53 e che limitato ai tessuti periferici, in quanto, quando il midollo veni- l’insulina stimola la proliferazione e la funzione delle EPCs in va stimolato mediante fattori di crescita esogeni, il rilascio di vitro a concentrazioni soprafisiologiche54. Tuttavia, non è EPCs risultava significativamente ridotto negli animali diabe- chiaro da questi studi se l’effetto dell’insulina sia mediato tici rispetto ai non diabetici45. Questa prima evidenza a favo- dalla riduzione della glicemia o dall’effetto diretto dell’ormo- re di un possibile difetto primitivo del midollo osseo nel dia- ne sulle cellule progenitrici. bete è stata recentemente confermata da alcuni studi isto- Un approccio farmacologico più mirato per la stimolazione patologici in modelli murini di diabete mellito di tipo 1 e tipo 2. delle EPCs nel diabete mellito può derivare dall’utilizzo dei Oikawa e coll.47, utilizzando topi resi diabetici mediante inie- DPP-4 inibitori. Tra i substrati fisiologici dell’enzima DPP-4 si zione di streptozotocina, hanno dimostrato che, a lungo ter- annovera anche la chemochina SDF-1 che, come già mine, il diabete induce lo sviluppo, a livello midollare, di una descritto, è una delle molecole segnale più importante per la forma di microangiopatia molto simile a quella osservata in regolazione delle EPCs. Abbiamo recentemente dimostrato altri organi nel contesto del diabete, con rarefazione capilla- che, in pazienti con diabete di tipo 2, una terapia di 4 setti- re e disfunzione endoteliale. L’interessamento istopatologi- mane con l’inibitore di DPP-4 sitagliptin è in grado di aumen- co delle nicchie di cellule staminali all’interno del microam- tare le concentrazioni circolanti di SDF-1 e di aumentare biente midollare spiegherebbe quindi il difetto di mobilizza- contemporaneamente i livelli di EPCs55. Sarà interessante zione delle EPCs associato al diabete. Busik e coll.48, utiliz- comprendere se questo effetto ancillare dei DPP-4 inibitori si zando ratti con una forma di diabete simile al diabete di tipo 2 traduca effettivamente in una protezione cardiovascolare.
- 6. Le cellule progenitrici endoteliali nel diabete mellito e sue complicanze 21 Figura 1 Fisiologia, fisiopatolo- gia e bersagli terapeutici delle EPCs nel diabete mellito: link alle complicanze croniche della malattia. CXCR4, C-X-C che- mokine receptor type 4; EPC, endothelial progenitor cells; HIF, hypoxia inducible factor; NO, nitric oxide; SDF, stromal cell- derived factor (modificata da: Avogaro et al. Diabetes Care 2010 suppl., in stampa). Conclusioni 6. Fadini GP, Agostini C, Sartore S, Avogaro A. Endothelial progen- itor cells in the natural history of atherosclerosis. Atherosclerosis 2007;194:46-54. Una riduzione delle EPCs nel diabete mellito probabilmente 7. Erbs S, Linke A, Schachinger V, Assmus B, Thiele H, Diederich contribuisce allo sviluppo e alla progressione delle compli- KW et al. Restoration of microvascular function in the infarct- canze della malattia. Infatti, un basso livello di EPCs predice related artery by intracoronary transplantation of bone marrow lo sviluppo di futuri eventi cardiovascolari. Mediante terapia progenitor cells in patients with acute myocardial infarction: the farmacologica è possibile ottenere un ripristino delle EPCs a Doppler Substudy of the Reinfusion of Enriched Progenitor Cells and Infarct Remodeling in Acute Myocardial Infarction (REPAIR- livelli normali, ma rimane da chiarire se questo effetto si tra- AMI) trial. Circulation 2007;116:366-74. duca in una effettiva protezione dal danno d’organo (Fig. 1). 8. Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone mar- row-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 1999;5:434-8. Conflitto di interessi 9. Ceradini DJ, Gurtner GC. Homing to hypoxia: HIF-1 as a medi- Nessuno. ator of progenitor cell recruitment to injured tissue. Trends Cardiovasc Med 2005;15:57-63. 10. Heissig B, Hattori K, Dias S, Friedrich M, Ferris B, Hackett NR et al. Recruitment of stem and progenitor cells from the bone Bibliografia marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand. Cell 2002;109:625-37. 1. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T 11. Tepper OM, Capla JM, Galiano RD, Ceradini DJ, Callaghan MJ, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angio- Kleinman ME et al. Adult vasculogenesis occurs through in situ genesis. Science 1997;275:964-7. recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow-derived cells. Blood 2005;105:1068-77. 2. Fadini GP, Miotto D, Baesso I, Facco M, Miorin M, Tiengo A et al. Arterio-venous gradient of endothelial progenitor cells across 12. Ingram DA, Caplice NM, Yoder MC. Unresolved questions, renal artery stenosis. Atherosclerosis 2005;182:189-91. changing definitions, and novel paradigms for defining endothe- lial progenitor cells. Blood 2005;106:1525-31. 3. Pasquinelli G, Tazzari PL, Vaselli C, Foroni L, Buzzi M, Storci G et al. Thoracic aortas from multiorgan donors are suitable for 13. Fadini GP, Albiero M, Boscaro E, Agostini C, Avogaro A. obtaining resident angiogenic mesenchymal stromal cells. Stem Endothelial progenitor cells as resident accessory cells for post- Cells 2007;25:1627-34. ischemic angiogenesis. Atherosclerosis 2009;204:20-2. 4. Campagnolo P, Cesselli D, Al Haj Zen A, Beltrami AP, Krankel N, 14. Fadini GP, Baesso I, Albiero M, Sartore S, Agostini C, Avogaro A. Katare R et al. Human adult vena saphena contains perivascu- Technical notes on endothelial progenitor cells: ways to lar progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic escape from the knowledge plateau. Atherosclerosis 2008; potential. Circulation 2010;121:1735-45. 197:496-503. 5. Avogaro A, Fadini GP, Gallo A, Pagnin E, de Kreutzenberg S. 15. Leor J, Marber M. Endothelial progenitors. A new tower of Babel? J Am Coll Cardiol 2006;48:1588-90. Endothelial dysfunction in type 2 diabetes mellitus. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2006;16(suppl. 1):S39-45. 16. Avogaro A, de Kreutzenberg SV, Fadini G. Endothelial dysfunc-
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